兔眼视网膜下手术的逐步操作方案

本手术干预的总体目标是替换功能失调的视网膜色素上皮（retina pigment epithelium，RPE），以探索治疗RPE相关疾病（如年龄相关性黄斑变性）的潜在方法。该方法有助于解答视光学领域中关于细胞治疗和年龄相关性黄斑变性的关键科学问题。该技术的主要优势在于，它可能为细胞替代基质或药物递送装置向视网膜下腔的转运提供一种有效的输送方式。

尽管该方法可为兔眼玻璃体切除术和视网膜下手术提供参考，也可应用于其他模式生物，如猪、猴或人类。通常，初学者在操作该方法时会遇到困难，因为不仅眼内手术本身较为复杂，且该手术在人员配备、组织管理和技术操作方面均需高度协调。仪器装载步骤将由本实验室的博士后 Fabian Thieltges 和手术刷手护士 Ralf Brinken 进行演示。

手术开始前，确认动物已达到适当的麻醉水平，并对未手术的另一只眼睛涂抹眼膏。然后将兔子置于手术显微镜下，左侧卧位，右眼朝上，鼻部略微抬高，可用折叠的毯子垫高。用几滴聚维酮碘对眼睛消毒一分钟。

然后，用无菌BSS冲洗眼睛，并用带有预先剪好的眼部开口的无菌手术巾覆盖动物头部。将一块12厘米×17厘米的粘性手术切口巾贴于眼部，用剪刀做一条正中水平切口以暴露眼睛。使用倒置的止血钳将眼球推至突出位置，并用3-0丝线缝合固定组织。

然后，使用一对Vannas剪刀在靠近角膜缘处切开结膜，距离邻近的血管约一毫米，并平行于角膜缘扩大结膜切口。钝性分离结膜后，作一垂直于角膜缘、长约六至七毫米的垂直切口，从而在结膜上形成一个“T”形切口。在2点位置周围再做一个小的结膜切开。

然后，将23号针头的玻璃体视网膜刀尖小心地经巩膜插入，在8点钟位置距角膜缘3.5毫米处指向眼球后极。为避免扩大切口，应沿相同方向缓慢撤出刀片，并预先放置一根7-0 Vicryl缝线。接着，将定制的侧口灌注套管插入巩膜开口，并利用预先放置的缝线固定套管。

将眼内压设定在20至24毫米汞柱。然后使用25G平头套管在2点钟位置穿刺巩膜，并将25G吊灯式导光束插入套管内。用胶带固定导光束，将其光强调节至约30%功率，再根据需要进行个体化调整。

使用20号手术刀去除水肿的角膜上皮，以改善眼内结构的可视化。现在，在10点钟位置使用23号穿刺刀进行另一处巩膜切口，并在切开的巩膜周围置入U形7-0薇乔缝线，暂不完全打结。将高速玻璃体切割头插入切口，并从入口处开始进行玻璃体切除术。

以每分钟最多2,000至3,000次的切割速度将玻璃体切成小块，持续在视盘及髓样纤维区域进行玻璃体切除术，并以最大200毫米汞柱的压力进行抽吸。为轻柔分离玻璃体与视网膜，将玻璃体切割头置于视盘后极部及下方，持续抽吸而不进行切割。当后部玻璃体完全脱离后，玻璃体内注射约50微升目标化合物，以观察玻璃体近乎完全切除过程中的漂浮情况。

当眼球准备就绪后，用未添加任何补充成分的眼科级BSS将植入用细胞培养物冲洗三次。接着，向一个100 × 20毫米的细胞培养皿中加入10毫升眼科级BSS，并将细胞培养插件放入培养皿中。将培养皿置于光学显微镜下居中位置，使用特制的尖头椭圆形中空针在细胞培养物上穿出一块扁平、豆形的基质，尺寸为2.4 × 1.1毫米，具有两条长边和两条圆边。

通过第二个端口用BSS轻轻冲洗针头，将植入物冲入盛有BSS的细胞培养皿中。为获得第三条边缘，在植入物的一个圆形末端做一处0.5毫升的切口，使用23号膜剥离镊将植入物转移至定制的装载站。确保植入物处于直立位置，然后用镊子轻轻将植入物完全推入射击装置中，直至所有组织均被固定在装置尖端内，并将射击装置的尖端置于BSS下的装载站中，直至细胞被植入。

为了将细胞植入视网膜下，使用连接至气密注射器的可伸展41号规格视网膜下注射针接近神经视网膜，并向视网膜下注射BSS以形成视网膜下隆起（bleb）脱离。当隆起范围达到约2至3个视盘直径时，使用垂直23号规格玻璃体视网膜剪将视网膜切开扩大至1.5毫米，并使用1.4毫米切口刀将10点钟方向的巩膜切口精确扩大至20号规格入路。随后，尝试将20号规格的模拟注射导管通过巩膜切口，必要时扩大切口，以确保装载好的注射导管能够顺畅且紧密地通过。

然后，将装有植入物的注射器通过巩膜切口，在20至24毫米汞柱的压力下推进至视网膜切开边缘，并从视网膜内界膜位置将植入物注入视网膜下腔。注射器应能在首次尝试时迅速穿过巩膜，因此需确保巩膜切口大小适中。随后，应以较小的角度将RPE细胞植入视网膜下腔，以避免植入物前端被玻璃膜（Bruch's membrane）卡住。

调整植入物位置，使其合理地置于视网膜下，远离视网膜切开处。随后，将套管从巩膜切口取出，并通过烛台式套管注入25微升曲安奈德。使用7-0缝线关闭2点和10点位置的巩膜切口，并检查有无渗漏。

移除灌注套管，并立即用预先放置的7-0 Vicryl缝线关闭最后一个巩膜切口。使用30号针头注入BSS，根据需要通过触诊调节眼内压。最后，用7-0 Vicryl缝线缝合结膜，并移除眼球突出丝线，注意避免损伤深部眶静脉丛。

在进行核心玻璃体切除术时，视网膜下移植的手术成功率约为60%，而当诱导产生后部玻璃体脱离时，成功率可提高至75%以上。此处显示的是在未发生并发症的情况下，将培养的视网膜色素上皮细胞接种于聚酯膜后进行异种移植的扫描激光检眼镜红外反射图像，由于免疫反应导致的光感受器萎缩在植入物周围表现为晕轮状。在相应的谱域光学相干断层扫描图像中，可见外核层变薄，这是对视网膜色素上皮细胞异种移植的反应，主要出现在植入物上方存在明显高反射带的视网膜区域。

然而，植入物邻近的神经视网膜显示出接近正常的反射条带，提示植入过程未造成创伤。通过H/E染色观察发现，在未接受免疫抑制的异种移植兔模型中，存在视网膜下瘢痕形成及外核层萎缩。植入物下方的布鲁赫膜也显示连续性良好，脉络毛细血管中含有少量散在的红细胞，进一步证实了植入输送过程中未造成组织损伤。

一旦掌握，若无并发症，该技术可在一小时内完成。在实施该手术时，需注意创建大小适中的视网膜隆起和视网膜切开，以恰好容纳植入物。此外，手术干预速度越快，通常预后效果越好。

完成该操作后，可采用其他方法（如光学相干断层扫描或组织学）来回答更多问题，例如移植是否成功、视网膜下腔的生物相容性以及移植细胞的存活情况。该技术建立后，为干细胞生物学和生物材料领域的研究人员探索视网膜下腔递送干细胞衍生物和/或生物功能化载体基质以治疗视网膜疾病（尤其是视网膜色素上皮细胞相关疾病）奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在兔模型中进行玻璃体切除术和视网膜下腔植入手术。

请注意，操作晶状体、玻璃体视网膜以及视网膜下界面时可能极具危险性，因此在进行该手术时，必须采取适当的预防措施，例如正确的手部位置、良好的视野暴露以及稳定的眼内压。