Name: TAPE:一种生物可降解止血胶由无处不在的复方植物外科应用的启发 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 了解TAPE生物可降解止血胶的制备方法，该材料由单宁酸和聚乙二醇制成，具有比纤维蛋白胶高2.5倍的耐水粘附性，适用于外科手术止血应用。

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本研究由韩国国家研究基金会：中年科学家资助项目（2014002855）以及产业通商资源部：世界顶级材料开发计划资助。本工作还部分由韩国科学技术院纳米世纪研究所（KINC）下属的自然启发技术研究中心（CNiT）资助。

所有动物护理和实验均按照韩国科学技术院（KAIST）机构审查委员会（IRB）提供的伦理协议进行。
1. TAPE 的形成
<ol>
	<li>配制单宁酸（TA）溶液时，将一个4 ml的玻璃小瓶置于磁力搅拌器上，加入1 ml蒸馏水和一个搅拌子。向小瓶中加入1 g单宁酸，以200 rpm的转速轻轻搅拌超过1小时，使其完全溶解于水中。当TA完全溶解后，混合液变为呈棕色的透明溶液。</li>
	<li>通过将1 g聚乙二醇（PEG）粉末（4臂型，10 kDa；线性，4.6 kDa）加入1 ml蒸馏水中，再涡旋混合数秒形成白色浆液，以配制PEG溶液。将此浆液置于60 °C培养箱中加热10分钟，直至白色浑浊完全变为澄清。 
	注意：分子量为10 kDa的PEG熔点约为55–60 °C，4 kDa的PEG熔点为53–58 °C。熔融后的PEG可与水混溶，因此可在水中达到高达1 g/ml的浓度并形成澄清溶液。一旦在高温下形成澄清的PEG溶液，冷却至室温后仍可保持稳定。</li>
	<li>在微量离心管中，加入329 µl步骤1.2中制备的PEG（4臂型，10 kDa）溶液和671 µl步骤1.1中制备的TA溶液（若使用分子量为4.6 kDa的线性PEG，则加入311 µl PEG溶液和689 µl TA溶液）。使用窄头刮刀轻轻混合这两种粘稠、类似蜂蜜的溶液，使其均匀混合。 
	注意：两种溶液均较为粘稠，因此操作人员必须缓慢而充分地使用移液器吸取和转移溶液，避免产生气泡或剪切损伤。</li>
	<li>将步骤1.3中制得的混合物在配备固定角转子的离心机中以12,300 × g离心3分钟。</li>
	<li>使用移液器小心尽可能多地去除上清液，并收集已沉淀的产物：即为完全形成的TAPE。TAPE形成后，可将其储存在冰箱（4–8 °C）中，保存数周。&#160;注意：TAPE在用于外科应用前，可通过γ射线辐照或电子束处理进行灭菌。</li>
</ol>
2. TAPE粘附强度的测量&#160;
<ol>
	<li>去除猪皮组织上的所有脂肪后，使用皮肤活检打孔器切割出两块直径为 6 mm 的猪皮组织。 
	注意： 猪皮组织取自健康猪的 flank 皮肤，购自韩国大田市当地肉类市场。</li>
	<li>将市售的氰基丙烯酸酯胶水涂抹在每块组织的外侧，并将组织固定在金属杆上。 
	注意： 金属杆用作辅助手柄，以避免机器直接夹持组织。因此，可根据拉伸试验机的配置替换为其他材料。</li>
	<li>在组织的一侧滴加一滴 TAPE（一滴 TAPE 约为 3–6 mg）。然后，将另一块组织置于两块组织内侧之间，均匀涂抹 TAPE，使两块组织如 图 2A 所示相互粘附。</li>
	<li>随后，手动反复粘附和分离两块组织数次，以均匀混合并最大化组织与 TAPE 之间的界面。</li>
	<li>使用 UTM 装置小心夹住每根金属杆的两端。粘附强度由使经 TAPE 粘合的两块组织分离所需的作用力决定。首先施加 20 N 的力持续 1 分钟。接着，以 1 mm/min 的速率通过仪器将两根金属杆向相反方向拉伸，直至组织完全分离。 
	注意： 数据将以各金属杆运动所检测到的力-距离（F-D）曲线形式给出。</li>
	<li>通过将步骤 2.5 中获得的 F-D 曲线上显示的最大力（kN）除以试样表面积（即 3.14 × (0.003 m)2），计算 TAPE 的粘附强度。</li>
	<li>为监测在水存在条件下的粘附强度，向两块组织之间的分离区域加入 20 µl 水，立即重新粘合，并使用仪器再次进行分离测试。</li>
</ol>
3. 体外 降解测试
<ol>
	<li>剪下一个微量离心管的管盖（直径 = 8 mm），称量该管盖的质量，记为 Wc。</li>
	<li>在管盖中加入 150 mg 的 TAPE，再次称量整体质量，记为初始总质量 W0。 
	注意：切勿在管盖中过量填充 TAPE。TAPE 的高度应低于管盖顶部，否则在步骤 3.4 的孵育过程中，搅拌产生的 PBS 缓冲液流可能受到 TAPE 的物理阻碍。</li>
	<li>将装有 TAPE 的管盖放入细胞培养瓶（75 cm2）中，并向培养瓶中加入 50 ml PBS 缓冲液（1×，pH 7.4），使管盖中的 TAPE 完全浸没于 PBS 缓冲液中，如 图 3A 所示（n = 5）。</li>
	<li>将步骤 3.3 中制备的细胞培养瓶置于轨道摇床孵育器中，在 37 °C 下孵育，模拟生理条件，并以轻柔搅拌（50 rpm）进行。 
	注意：保持搅拌速度为 50 rpm。过高的转速可能导致 TAPE 崩解。</li>
	<li>在每个时间点，从细胞培养瓶中取出装有 TAPE 的管盖，用氮气吹干后称量管盖及残留 TAPE 的质量，记为该时间点的质量 Wt。更换新鲜的 PBS 缓冲液，在完成每次 Wt 测量后重新开始振荡孵育。</li>
	<li>根据以下公式计算相对残留质量（%）。 
	相对残留质量（%）= (Wt&#160; - Wc) / (W0&#160; - Wc) × 100%</li>
</ol>
4. TAPE 的止血能力
&#160; &#160; &#160; &#160;注意：所有动物实验均应遵循韩国卫生与福利部提供的指南和伦理规程进行。
<ol>
	<li>为了评估 体内 止血能力，参见参考文献中所述的出血小鼠肝脏模型 24.</li>
	<li>用替来他明-唑拉西泮（33.333 mg/kg）和赛拉嗪（7.773 mg/kg）腹腔注射麻醉15只小鼠（正常ICR小鼠，6周龄，30–35 g，雄性），每组5只。为确认麻醉效果，轻捏小鼠足爪，观察是否出现缩足等反应。 等等。 无活动表明动物已充分麻醉，可进行手术。</li>
	<li>为防止动物眼睛干涩，在麻醉期间应充分涂抹兽医专用眼膏。通过腹部正中切口暴露肝脏，并用18 G针头刺破肝脏以诱导出血。</li>
	<li>用无菌纱布擦去流动的血液，立即在出血部位滴加100 µl TAPE或纤维蛋白胶（阳性对照）。 
	注意： 使用TAPE后，由于其对伤口组织具有高度抗血液干扰的黏附特性，无需进一步缝合。对于阴性对照组，出血部位不进行任何处理。</li>
	<li>每种情况下，在肝脏下方放置一张已知质量的滤纸，以收集损伤部位流出的血液。每隔30秒更换一次滤纸。&#160;4 次即，2 分钟）。</li>
	<li>每30秒收集一次滤纸，测量每张滤纸上吸收血液的质量。动物实验结束后，通过CO2 窒息安乐死</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们开发了一类全新的止血粘合剂，命名为TAPE，其灵感来源于植物来源的多酚类化合物TA所具有的耐水性分子相互作用。TA是一种典型的可水解单宁，因其抗氧化、抗菌、抗诱变和抗癌特性而受到广泛关注。
制备TAPE的过程极为简单、可规模化且环境友好，仅需将两种水溶液一步混合，随后离心，无需任何其他化学合成步骤。
双组分混合方案是形成传统产品中所用组织粘合剂最典型且最简单的方法，例如纤维蛋白胶。该方法是在将纤维蛋白原和凝血酶应用于组织之前立即混合而成3。然而，对于氰基丙烯酸酯胶和基于合成聚合物的粘合剂，其组分的制备需要多步化学合成。此外，在基于蛋白质材料的情况下，有时会使用高毒性化学物质作为其中一个组分，以化学交联由聚合物前体组成的另一组分，例如通过戊二醛固化的胶以及含有甲醛和间苯二酚的粘合剂。
在使用兔子的动物研究中，经戊二醛固化的材料在肺和肝组织中表现出强烈的体内炎症反应，尽管该材料已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于主动脉组织。...

在过去十年中，由于可生物降解/生物吸收性粘合剂在使用上的便利性以及在手术过程中对组织侵入性较低，人们已努力尝试用其替代当前用于闭合伤口的外科缝线和钉合钉。市面上的组织粘合剂可分为四类：（1）氰基丙烯酸酯衍生物1，（2）由凝血酶通过酶促反应将纤维蛋白原转化为纤维蛋白聚合物而形成的纤维蛋白胶2,3，（3）基于蛋白质的材料，如经化学或物理交联的白蛋白和/或明胶4,5，以及（4）基于合成聚合物的粘合剂6。尽管这些粘合剂已在多种临床应用中使用，但每种粘合剂均存在固有的缺点和局限性，可能阻碍其广泛使用。基于氰基丙烯酸酯的粘合剂对组织具有较高的粘附强度，但在降解过程中产生的氰乙酸酯和甲醛等有毒副产物常引发显著的炎症反应7。纤维蛋白胶以及基于白蛋白或明胶的材料存在传播动物源性传染性成分（如病毒）的安全隐患：纤维蛋白胶来源于人血浆，而明胶类粘合剂则来源于包括牛、鸡、猪和鱼在内的动物8。尽管已有少数基于合成聚合物的粘合剂获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，但大多数由合成聚合物制成的粘合剂在简化制造工艺步骤和实现良好生物相容性方面仍面临困难9。最重要的是，所有粘合剂在湿润组织上的机械强度和粘附力均较差10。近年来，受海洋贻贝11-13、壁虎14、兼具贻贝与壁虎特性的仿生结构15以及内寄生蠕虫16启发的仿生组织粘合剂，因其可调节的机械性能、粘附性能及良好的生物相容性，正成为现有医用粘合剂的有前景替代品。然而，迄今为止，在这些粘合剂成为商业化产品之前，仍有一些问题有待解决17。
在此，我们报道一种全新的医用胶水TAPE，其名称源于植物来源的粘附性分子单宁酸（Tannic acid, TA）与生物惰性聚合物聚乙二醇（Poly(ethylene glycol), PEG）之间通过分子间氢键作用形成。TA是一种典型的可水解鞣质，广泛存在于植物的次生代谢过程中。由于其具有抗氧化、抗诱变和抗癌特性，TA受到广泛关注，并已被证明可与多种聚合物发生超分子相互作用，例如聚（N-异丙基丙烯酰胺) (PNIPAM) 和聚(N聚乙烯基吡咯烷酮（PVPON）以形成逐层自组装（LbL）薄膜18-20 和药物释放微胶囊21-23在本研究中，我们发现单宁酸（TA）可作为一种高效的防水粘附功能基团，用于制备医用粘合剂TAPE。通过与TA简单混合，原本抗污的聚合物聚乙二醇（PEG）转变为一种超分子胶水，其粘附强度相比商用纤维蛋白胶提高了2.5倍，且即使在水存在条件下，仍可在多达20次的粘附-脱离循环中保持稳定的粘附性能。该粘合剂的止血能力已在肝脏出血模型中得到验证。 体内 并在数秒内表现出良好的止血能力。作为首个源自植物的粘合材料，TAPE在相关领域具有重要意义，可为解决现有仿生方法的局限性提供新的思路。此外，由于其制备方法简单、可规模化生产、降解速率可调，以及具有优异的耐湿粘附性能，我们预期TAPE将在多种医学与药学应用中得到广泛使用，例如黏膜粘附剂、药物释放贴片、伤口护理敷料等。

<table><tbody><tr><td>单宁酸</td><td>Sigma-aldrich</td><td>403040</td><td></td></tr><tr><td>聚环氧乙烷，四臂，羟基封端</td><td>Aldrich</td><td>565709</td><td>平均 Mn ~ 10,000</td></tr><tr><td>聚乙二醇</td><td>Aldrich</td><td>373001</td><td>平均 Mn 4,600</td></tr><tr><td>活检打孔器</td><td>Miltex</td><td>33-36</td><td>直径 = 6 mm</td></tr><tr><td>阿罗尼卡 α</td><td>Toagosei Co., Ltd.</td><td></td><td>瞬干胶</td></tr><tr><td>万能试验机（UTM）</td><td>Instron</td><td>5583</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>SPL life science</td><td>60015</td><td>1.5 ml</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>SPL life science</td><td>10090</td><td>90 × 15 mm</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td>1× PBS 成分</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma</td><td>S5136</td><td>1× PBS 成分</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Duchefa biochemie</td><td>S0520.5000</td><td>1× PBS 成分</td></tr><tr><td>恒温振荡培养箱</td><td>Lab companion</td><td>SIF6000R</td><td></td></tr><tr><td>ICR 小鼠</td><td>Orient bio</td><td>Normal ICR mouse</td><td>6 周龄，30–35 g，雄性</td></tr><tr><td>替来他明-唑拉西泮（Zoletil 50）</td><td>Virbac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪（Rompun）</td><td>Bayer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; 针头（18 G）</td><td>BD</td><td>302032</td><td>18 G</td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Whatman</td><td>1001 125</td><td>直径 = 125 mm</td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Bemis Flexible Pakaging</td><td>PM996</td><td></td></tr></tbody></table>

tape：一种受植物中普遍存在的化合物启发而研发的可生物降解止血胶，用于外科手术应用

TAPE: A Biodegradable Hemostatic Glue Inspired by a Ubiquitous Compound in Plants for Surgical Application

本视频介绍了一种制备可生物降解外科胶水的最简协议，该胶水具有有效的止血能力，且防水粘附强度优于市售组织粘合剂。由于医用粘合剂使用便捷、创伤极小，作为缝合线和缝合钉的潜在替代工具已受到广泛关注。尽管目前已有一些组织粘合剂的制备方案，包括市售的纤维蛋白胶和氰基丙烯酸酯类材料，但大多数方案需要进行一系列有机分子的化学合成，或在生物来源材料的情况下采用复杂的蛋白质纯化方法即，纤维蛋白胶）。此外，开发兼具高黏附性能和可生物降解性的外科胶黏剂仍面临挑战，主要难点在于难以在体内湿润环境中实现良好的黏附效果。本文介绍一种新型医用胶黏剂（TAPE）的制备方法，该方法通过物理混合一种源自植物的耐水黏附分子与另一种组分，形成不溶于水的超分子聚集体，再依据质量差异进行分离而获得。&#160;T安尼克 Acid（TA）以及一种广为人知的生物聚合物聚乙二醇（PEG）。通过我们的方法，TAPE在水存在条件下表现出高粘附强度，是商用纤维蛋白胶的2.5倍。此外，TAPE在生理条件下可生物降解，可用作有效的止血胶以应对组织出血。我们预期TAPE将在多种医疗场景和药物递送应用中得到广泛应用，例如用于黏膜黏附的聚合物、药物储库等。

TAPE 是一种超分子聚集体，通过将含有单宁酸（TA，1 g/ml 溶于蒸馏水）和聚乙二醇（PEG，1 g/ml 溶于蒸馏水）的两种水溶液按 2:1 的体积比混合后离心而形成（图 1A）。混合比例是实现高粘附强度的关键因素；当以 2:1 的比例混合时，25 个 TA 单元中的 20 个羟基（-OH）与 PEG 中的每个醚键（-O-）相互作用，从而形成最多的分子间氢键，获得最佳的粘附性能。剩余的 5 个 -OH 单元似乎与 TA 分子内相邻的羰基（C=O）发生分子内氢键结合（图 1B）。当任一组分超过 2:1 的体积比时，粘附强度显著下降25。氢键也可能是与组织发生作用的关键分子级相互作用。调控 TA 与 PEG 之间用于内聚作用的分子间和分子内氢键，以及 TA 与组织之间用于粘附作用的氢键，可能是 TAPE 作为一种有效外科粘合剂的合理作用机制。
为测量粘附强度，...

我们描述了一种制备具有有效止血能力的可生物降解医用胶的最简单方案。TAPE 是一种由单宁酸（广泛存在于植物中的化合物）与聚乙二醇混合形成的不溶于水的超分子聚集体，其耐水粘附力比商用纤维蛋白胶高出 2.5 倍。

TAPE：一种受植物中普遍存在的化合物启发而研发的可生物降解止血胶，用于外科手术应用

本视频介绍了制备具有有效止血能力和更强防水性的可生物降解手术胶的最简单方案……

本实验方案的总体目标是开发一种可生物降解的止血胶，用于外科手术，其设计灵感来源于植物中普遍存在的一种化合物。该方法有助于我们理解生物材料在生物医学应用中的防水粘附机制，例如组织粘合剂和密封剂。该技术的主要优势在于制备TAPE的过程极为简单、可规模化且环境友好。首先，在磁力搅拌器上，于一个 4 毫升玻璃小瓶中配制单宁酸溶液。加入 1 毫升蒸馏水和 1 克单宁酸，在 200 rpm 条件下搅拌。一小时后，单宁酸将完全溶解，形成棕色溶液。接下来，将一毫升蒸馏水加入一克聚乙二醇（PEG）粉末中，涡旋混合形成白色浆液。将该浆液在60摄氏度下保温10分钟，应变为完全透明。然后，将其恢复至室温。接着，在一个微量离心管中，将329微升PEG溶液与671微升单宁酸溶液混合。由于两种溶液均较为黏稠，吸取时应缓慢操作。用窄刮刀将溶液轻轻混合成蜂蜜状混合物。在固定角转子中以12,300 × g离心3分钟。随后，小心吸去尽可能多的上清液，留下已完全形成的TAPE。将TAPE在4至8摄氏度下保存数周。为测量TAPE的粘附强度，使用猪活检皮肤穿孔组织制备测试样本。去除所有脂肪后，制备两个直径为6毫米的测试组织样本。将商用氰基丙烯酸酯胶水涂抹于每块组织的外侧，并将测试仪器可夹持的杆状物或类似物体粘附其上。接着，在组织的一侧滴加一滴TAPE，并在两块组织内侧之间均匀涂抹，使两者粘合。随后，反复连接和分离组织数次，以形成均匀混合、完全覆盖界面的结合层。接下来，将杆件连接到测试装置上。首先施加 20 牛顿的力，持续 1 分钟。然后以每分钟 1 毫米的速度将杆件拉开，直至组织完全分离。数据以力-距离曲线形式给出。若需测试在水存在条件下的粘附强度，可在两个组织之间的分离区域加入20微升水，然后立即用TAPE将湿润的表面粘合。重复之前的测试步骤，其余条件均不改变。首先，剪下一个微型离心管上直径为八毫米的管盖并称重。接着，将管盖中加入150毫克TAPE，并测量总重量。加样时不要超过管盖边缘，该边缘将作为阻挡屏障使用。向75平方厘米的细胞培养瓶中加入50毫升PBS缓冲液。将装有样品的瓶盖放入培养瓶中并浸入液体。将培养瓶置于37摄氏度、转速为50 rpm（不可更高）的摇床中孵育。在预定时间取下瓶盖，用氮气吹干，然后称重。接着，更换烧瓶中的 PBS，继续在温和振荡条件下孵育，直至下一个时间点。根据测量结果，计算相对剩余重量。取一只经过足趾夹捏测试的六周龄雄性小鼠，确保其处于完全麻醉状态。在开始手术前，务必在其眼睛上涂抹兽医用眼膏。现在，通过腹部正中切口暴露肝脏，并在肝脏下方放置已知质量的滤纸以固定肝脏。接着，使用18号针头刺破肝脏以诱导出血。在用无菌纱布吸收血液的同时，立即在切口部位施加100微升TAPE。对于阳性对照，使用氰基丙烯酸酯或类似的胶水；对于阴性对照，则不进行任何处理。无需进一步缝合。放置胶水后，将损伤部位的血液收集到纸片上。每30秒更换一次滤纸，持续两分钟。测量四张滤纸上吸收血液的质量。应处死动物。测试了多种比例的TA与PEG，发现制备TAPE的最佳组合为两体积比一体积。将该TAPE应用于两片直径为六毫米的猪皮之间，随后按照所述方法在拉伸试验机上进行测试。最初测得分离两片猪皮所需的力为200千帕，经过多次循环后该力增加至250千帕。每次粘附/脱离循环后，当皮肤样本被润湿时，粘合强度最初降至90千帕，并在20次循环后进一步下降至50千帕。TAPE的耐久性在生理光照条件下，通过在PBS中稀释成小体积并震荡进行测试。采用二比一配比配方可维持质量达21天。在这些条件下，TAPE的1:1配比制剂仅能维持13天。接下来进行了体内止血试验，将TAPE封闭的肝脏与商用纤维蛋白胶进行比较。经TAPE封闭的肝脏出血量显著少于经纤维蛋白胶封闭的肝脏。若操作得当，熟练掌握后制备TAPE可在五分钟内完成。在进行该操作时，需特别注意保持单宁酸与聚乙二醇（PEG）之间的最佳比例，因为该比例会显著影响TAPE的粘附力。该技术问世后，为生物识别领域的研究人员探索仿生方法解决防水粘合材料研发中的现有问题开辟了道路。尽管该方法可为止血材料的研究提供启示，但也可应用于其他系统，例如用于伤口愈合的组织密封剂以及用于药物递送的可植入贴片。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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