小鼠后肢长骨解剖与骨髓分离

本长骨解剖及骨髓分离操作的总体目标是快速、系统地取出长骨，并收集骨髓用于后续下游分析。该方法有助于回答与骨髓生物学、癌症转移及免疫学相关的关键科学问题。该技术的主要优势在于解剖过程快速且标准化，骨髓分离操作具有较高的无菌性。首先将小鼠置于仰卧位。

然后将踝关节下方的四个脚掌垫用针固定，并用70%乙醇喷洒小鼠，彻底浸湿腿部。接着，在下腹部中线右侧、髋关节上方做一个小切口，将切口沿腿部向下延伸，越过踝关节。将皮肤向后拉开。

然后剪断附着在股骨近端的股四头肌，以暴露股骨的前侧面，并以与解剖板呈45度角的方向用大头针将肌肉从腿部固定展开。将剪刀紧贴股骨的后侧面，剪断附着于膝关节的腘绳肌。接着向后拉开附着在股骨近端的皮肤和腘绳肌，以暴露骨骼的后侧面，并用大头针以45度角将腘绳肌从腿部固定展开。

用镊子夹住股骨远端膝关节上方位置。然后将剪刀刀片沿股骨干两侧向髋关节方向引导。到达股骨头后，扭转剪刀，使上部刀片正对股骨头，以使股骨脱位。

现在用镊子夹住股骨干上端，剪除股骨头周围的软组织，使股骨从髋臼中游离出来。然后将包括股骨、膝关节和胫骨在内的整个腿骨向上并远离躯体方向牵拉，仔细剪除连接腿部与皮肤的结缔组织和肌肉。当所有结缔组织均被去除后，过度背屈踝关节，并如前所示旋转剪刀以使胫骨脱位。

握住胫骨远端，注意不要切断肌腱，将胫骨向上并远离身体和插针板方向拉起。随后，清除附着在膝关节处长骨以及股骨和胫骨上残留的任何肌肉或结缔组织。为准备进行骨髓分离，用手握住股骨，使髌骨朝向远离操作者的方向，股骨头朝下。

过度伸展膝关节，并扭转剪刀使胫骨与股骨脱位。随后去除连接股骨与胫骨之间的任何结缔组织。接着，握住股骨，使其前面朝外、股骨头朝下，将剪刀沿股骨干向上引导至髁部。

轻轻来回旋转剪刀，去除髁突、髌骨和骨骺，暴露干骺端。然后使用镊子、剪刀和擦镜纸清除附着在股骨上的任何多余肌肉或结缔组织。接着，用镊子夹住胫骨，使前面朝外、踝端朝下。

如果胫骨骨骺完整，将剪刀沿胫骨干向上引导至髁部，轻轻来回旋转剪刀以去除髁和骨骺，暴露胫骨干骺端。然后去除附着在胫骨上的其他肌肉或结缔组织，方法如前所述。为采集骨髓，首先将一根18号针头穿过0.5毫升微量离心管底部。

然后将长骨放入离心管中，膝端朝下，并盖上管盖。将0.5毫升微量离心管套入1.5毫升微量离心管中，在微量离心机中以不低于10,000 × g的离心力离心15秒。通过肉眼观察确认骨髓已从骨组织中完全离出。

骨骼应呈现白色，且在较大的离心管中可见较大的沉淀物。然后将0.5毫升微量离心管中的骨骼弃去，并将骨髓悬浮于适当的溶液中，用于后续所需的分析。该快速解剖技术适用于多种下游分析，包括骨组织形态计量学和组织学。

事实上，如本代表性组织形态计量学显微CT三维重建所示，松质骨和皮质骨壳均得以保持，从而能够对骨组织形态计量学的标准结构参数进行准确定量。在本例经福尔马林固定、脱钙处理并进行苏木精-伊红染色的小腿胫骨代表性组织切片中，可观察到钙化骨组织及细胞骨髓结构的完整性均得到良好保存，适用于组织学分析。此外，通过本方法分离获得的骨髓适用于多种后续应用，包括破骨细胞或成骨细胞的原代细胞培养。

一旦掌握，若操作得当，从长骨解剖到骨髓分离的整个技术可在约七分钟内完成。进行该操作时，重要的是要注意将小鼠摆放于便于解剖的位置。在完成该步骤后，可进一步采用其他方法，如流式细胞术（FACS）或其他单细胞处理技术，以探究骨髓细胞群体变化的相关问题。

观看本视频后，您应能够很好地掌握如何快速解剖小鼠的长骨，并通过离心法分离骨髓。