鼠后肢长骨解剖和骨髓隔离
April 14th, 2016
在这里，我们提出了一种从实验室小鼠解剖后肢长骨（股骨和胫骨）的方案。我们进一步描述了一种从这些骨骼中分离骨髓的快速技术，该技术利用离心从骨髓空间中取出骨髓。
这种长骨解剖和骨髓分离程序的总体目标是快速、系统地去除长骨并收集骨髓用于进一步的下游分析。这种方法可以帮助回答与骨髓生物学、癌症转移和免疫学相关的关键问题。这种技术的主要优点是解剖过程快速且标准化，骨髓分离程序相当无菌，首先将鼠标置于仰卧位。
然后将所有四个爪垫固定在踝关节下方，用 70% 乙醇喷洒鼠标，彻底浇湿腿部。接下来，在臀部上方的下腹部中线右侧做一个小切口，然后将切口向下延伸到腿部并经过踝关节。拉回皮肤。
然后切开锚定在股骨近端的股四头肌，露出大腿骨的前侧，用销钉与板成 45 度角将肌肉从腿部固定出来。用剪刀抵住股骨后侧，将腘绳肌从膝关节上剪下来。然后拉回固定在股骨近端的皮肤和腘绳肌，露出骨骼的后侧，并将腘绳肌从腿部固定出来，将固定针呈 45 度角放置。
用镊子抓住膝关节上方的股骨远端。然后将股骨干两侧的剪刀刀片引导至髋关节。到达股骨头后，扭动剪刀，将顶部刀片直接移动到股骨头上以使股骨脱臼。
现在用镊子抓住股骨干的顶部，将软组织从股骨头上切开，将股骨从髋臼中释放出来。然后将整个腿骨，包括股骨、膝盖和胫骨，向上拉离身体，并小心地切掉将腿附着在皮肤上的结缔组织和肌肉。去除所有结缔组织后，过度伸展踝关节并扭动剪刀，就像刚才演示的那样使胫骨脱臼。
抓住胫骨的远端，注意不要切断肌腱，将胫骨向上拉，远离身体和针板。然后去除附着在膝盖长骨上的任何剩余结缔组织，以及附着在股骨和胫骨上的任何其他肌肉或结缔组织。为了准备用于骨髓分离的长骨，请抓住股骨，髌骨朝外，股骨头朝下。
过度伸展膝关节并扭动剪刀，使胫骨与股骨脱臼。然后去除将股骨和胫骨固定在一起的任何结缔组织。接下来，抓住股骨，前侧朝外，股骨头朝下，将剪刀沿着股骨干向上引导至髁。
轻轻地来回旋转剪刀，去除髁突、髌骨和骨骺，露出干骺端。然后，使用镊子、剪刀和 Kimwipes 去除附着在股骨上的任何其他肌肉或结缔组织。接下来，抓住胫骨，前侧朝外，踝端朝下。
如果胫骨骨骺完好无损，将剪刀沿胫骨干向上引导至髁突，轻轻来回旋转剪刀以去除髁突和骨骺，露出胫骨干骺端。然后去除附着在胫骨上的任何其他肌肉或结缔组织，如刚才所示。要采集骨髓，首先将 18 号针头穿过 0.5 毫升微量离心管的底部。
然后将长骨头放入管中，膝盖端朝下，并盖上盖子。将 0.5 毫升微量离心管嵌套在 1.5 毫升微量离心管中，并在微量离心机中以大于或等于 10， 000 次 g 的速度离心管 15 秒。通过目视检查验证骨髓是否已从骨骼中分离出来。
骨头应呈白色，并且在较大的管中应可见一个大颗粒。然后丢弃 0.5 mL 微量离心管中的骨头，并将骨髓悬浮在适当的溶液中，以进行所需的下游分析。这种快速解剖技术适用于许多下游分析，包括组织形态学和组织学。
事实上，正如这种代表性的组织形态学显微 CT 3D 重建所证明的那样，松质骨和皮质壳都得到了保留，从而可以准确定量骨组织形态测定的标准化结构参数。在 H 和 E 染色的正式和固定脱钙胫骨的代表性组织学切片中，可以观察到钙化骨和细胞骨髓完整性的维持以进行组织学分析。此外，通过该程序分离的骨髓适用于许多下游应用，包括破骨细胞或成骨细胞的原代细胞培养。
一旦掌握，该技术可以在大约 7 分钟内完成，从长骨解剖到骨髓分离，如果执行得当。在尝试该过程时，请务必记住放置鼠标以便于解剖。按照此程序，可以执行其他方法，如 FACS 或其他单细胞过程来回答有关骨髓细胞群改变的其他问题。
看完这个视频，你应该对如何快速解剖小鼠的长骨和离心分离骨髓有了很好的了解。
概述
本文介绍了一种用于解剖实验鼠后肢长骨的方法，以及一种使用离心分离骨髓的快速技术。该方法旨在促进与骨髓生物学和免疫学相关的下游分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 骨髓生物学
- 癌症转移
- 免疫学
背景
- 长骨解剖对于研究与骨相关的疾病至关重要。
- 骨髓分离对于各种细胞分析至关重要。
- 标准化技术可提高研究的可重复性。
- 快速程序可节省实验工作流程中的时间。
研究目的
- 提供一种长骨解剖的系统方法。
- 实现高效的骨髓收集以供分析。
- 为下游应用保持骨骼和骨髓的完整性。
使用的方法
- 定位小鼠并准备解剖。
- 逐步解剖股骨和胫骨。
- 使用离心分离骨髓。
- 视觉验证髓液提取。
主要结果
- 该技术可以在约七分钟内完成。
- 骨髓完整性得以保留以供组织学分析。
- 适用于各种下游应用，包括细胞培养。
- 标准化参数允许在研究中进行准确的定量分析。
结论
- 这种快速解剖和分离技术是有效且高效的。
- 它支持对骨髓细胞群体进行进一步研究。
- 掌握该技术可提高相关领域的研究能力。
常见问题
Executive Industry Relevance
Efficient isolation of murine bone marrow enables high-throughput screening of hematopoietic and stromal cell populations, supporting target validation in oncology and immunology. Standardized dissection reduces variability in preclinical models, improving data reliability for go/no-go decisions. Rapid processing facilitates integration into discovery workflows where sample throughput impacts lead identification timelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of bone marrow niche mechanisms in cancer metastasis and immune cell regulation.
- Operational Value: Provides reproducible access to primary bone marrow cells for functional target de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Isolated marrow supports assay development for osteoclast/osteoblast differentiation and drug response profiling.
- Operational Value: Centrifugation-based method allows scalable processing of large cohorts for screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Preserved marrow integrity enables phenotypic screening of stromal and hematopoietic compartments in disease models.
- Operational Value: Standardized protocol supports cross-lab reproducibility in multicenter preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical efficacy testing by providing a reliable source of primary bone marrow cells.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing in bone-immune crosstalk and metastatic niche formation.
- Screening: Enables preparation of standardized cell inputs for drug sensitivity and cytotoxicity assays.
- Analytics: Yields quantifiable outputs for flow cytometry, cytokine profiling, and genetic analysis.
- Translational Research: Connects in vitro findings to preclinical validation through consistent cell sourcing.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for bone marrow-derived assays across multiple therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in bone marrow-dependent disease models.
- Operational Value: Standardization minimizes user variability and processing time.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid sample turnaround.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement through reliable preclinical data generation.
Implementation Considerations
- Requires training in murine anatomy and aseptic dissection technique.
- Needs access to microcentrifuge capable of ≥10,000 × g and sterile tubes.
- Demands standardization across users to ensure marrow yield and viability consistency.
- Adaptation considerations include adjusting bone size for different mouse strains or ages.
- Practical limitation: Protocol is optimized for murine long bones; not directly applicable to larger species without modification.
