高效的核酸提取与16S rRNA基因测序用于细菌群落特征分析

本实验的总体目标是从拭子样本中分离出高质量的DNA和RNA，并通过16S rRNA基因测序来确定其细菌组成。该方法可帮助研究人员识别特定人体样本中所含的细菌种类，并分析特定细菌与宿主特征或疾病状态之间的关联。尽管该方法最初设计用于研究人类阴道菌群，但也可应用于其他身体部位（如鼻腔、口腔、皮肤和直肠）以及其他生物体的细菌群落研究。

请注意，本视频重点介绍该实验方案中较难操作的部分，不包含测序步骤及测序数据分析。本实验操作将由我实验室的技术员 Brittany Bowman 进行演示。实验开始时，需使用如随附文档所述在湿冰上采集并保存的宫颈外口拭子样本。

在进行核酸提取前，先用漂白剂清洁生物安全柜的所有表面及放入柜内的所有物品，随后使用可去除RNase、DNase和DNA的去污剂进行处理。在生物安全柜内，为每个样本放置一个珠磨管。向每根管中加入500 µL NaCl-Tris-EDTA缓冲液、210 µL 20% SDS以及500 µL苯酚-氯仿-异戊醇。

谨慎处理拭子对于使用本方案获得清晰结果至关重要。转移拭子时需稍加练习以避免掉落，使用中空杆拭子（如此处所示）操作会更加方便。用无菌镊子将拭子从转运管转移至含珠的振荡管中。

将拭子头在试管内壁上充分旋转摩擦至少30秒。将试管置于冰上。然后更换手套，并对下一个样本重复拭子采样操作。

待所有样本充分擦拭后，将其置于冰上静置至少10分钟。10分钟后，用无菌镊子夹住拭子手柄，使用洁净的P200吸头，将拭子头部按压在离心管内壁上，以释放其中的液体，从而提高核酸的回收率。

将珠磨管放入珠磨仪中，在 4 °C 条件下均质化样品 2 分钟。然后，在 4 °C、6,000 ×g 条件下离心珠磨管 3 分钟，以沉淀碎片并分离水相和苯酚相。离心后，通常可见三个相。

上层为水相，含有 DNA 和 RNA；下层为有机相，含有细胞和拭子中的脂质及碎片；中间薄薄的白色层称为间相，含有蛋白质。

将水相（约500至600微升）转移至无菌的1.5毫升离心管中。加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇。通过倒置和短暂涡旋混合。

将离心管离心五分钟。离心结束后，将水相转移至新的无菌1.5毫升离心管中。注意避免转移中间相或下方的酚相物质。

记录转移的体积，并保留酚相以用于后续蛋白质分离。随后，加入0.8倍体积的异丙醇和0.1倍体积的3摩尔乙酸钠。通过倒置充分混匀，并短暂涡旋振荡。

通过将离心管置于20摄氏度下冷却至少两小时至过夜，使核酸沉淀。沉淀完成后，离心30分钟。离心结束后，小心使用移液器吸除上清液，保留沉淀物完整。

加入 500 微升 100% 乙醇。轻轻涡旋或吹打使沉淀松动，注意不要触碰沉淀。离心五分钟。

使用P10移液器尽可能吸除并弃去乙醇，注意不要扰动沉淀。将沉淀在室温下晾干15分钟。用20 µL UltraPure 0.1X-Tris-EDTA缓冲液重悬沉淀。

将样品置于冰上静置10分钟，反复吹打以确保充分重悬。使用分光光度计测定核酸浓度。如需要，可使用柱纯化试剂盒并按照制造商的说明书将DNA与RNA分离。

PCR 体系的建立是本实验的关键步骤。为尽量减少污染，必须确保试剂、PCR 操作台和手套的无菌状态。在将物品移入和移出操作台时，应迅速而谨慎地操作，并采用正确的实验技术。

在生物安全柜中放置一个用于微型离心管的洁净台式冷却架和一个PCR板冷却架。将带独立管盖的8联管做好标记后放入PCR冷却架中。每个引物对应的扩增反应应设置三个重复，并包含一个无模板的水阴性对照。

将微量离心管放入冰盒中用于配制主混合液。然后，针对每个样本，按照随附文档中的说明，加入UltraPure水、5X HF缓冲液、dNTPs、515F正向引物和3% DMSO。随后，向主混合液中加入聚合酶，并用移液器吹打混匀。

向第一个孔中加入 90 微升的主混合液和 2 微升的反向引物，充分混匀。然后向第四个孔（作为无模板对照）加入 23 微升的主混合液和 2 微升的水，并混匀。接下来，向第一个孔中加入 6 微升相应的样本。

充分混匀后，取25 µL转移至第二孔。更换吸头，然后从第一孔再转移25 µL至第三孔。为每孔牢固加盖。

注意不要触碰孔内或盖子内部。然后，对每个样本重复此操作。所有样本制备完成后，迅速离心条形管，将其转移至PCR仪，并运行程序。

运行结束后，迅速离心试管以收集管壁上的液体。随后，在洁净的实验台面上，将每个样本的三个重复PCR反应产物合并至已标记的无菌微量离心管中。取每个无模板对照的25 µL转移至单独的无菌试管中。

暂勿混合不同样本的扩增产物。为验证PCR扩增是否成功，取每个样本5 µL上样至1.5%琼脂糖凝胶，以120伏电压进行电泳30至60分钟，随后在紫外光下观察凝胶。

通过观察是否出现一条约380个碱基对的单一强条带，确认每个样本的扩增是否成功。若出现双条带，则使用不同的反向条形码重新扩增该样本。若完全无条带，则使用相同的反向条形码或带有新反向条形码的引物重新扩增该样本。

如果重新扩增不成功，样本中可能存在PCR抑制物，此时应进行基于柱法的DNA纯化以去除PCR抑制物。将剩余的70微升扩增产物于20摄氏度保存。若无模板对照未产生条带，则弃去剩余的20微升。

制备扩增子文库时，将每种扩增子各两到五微升加入同一无菌离心管中。若某样本的条带较弱，则相对于其他样本加入两倍体积的该扩增子。随后使用试剂盒去除PCR引物。

如适用，将不含引物的扩增子文库混合以构建最终文库。使用分光光度计或荧光定量系统测定文库的DNA浓度。最后，将样品稀释至2 nmol，并送样进行测序。

有关序列分析的详细信息请参见随附文档。已分离出高质量的DNA和RNA，其中DNA被用作PCR扩增16S rRNA基因V4区的模板，具体方法如本视频所述。通过凝胶电泳确认，每个使用模板扩增的样本均出现一条大小约为380个碱基对的单一条带。

无模板对照组使用相同的引物对平行扩增，未出现条带。随后将PCR扩增产物合并至同一管中，进行定量，并在测序前进一步稀释。此处显示的是测序读长各位置上序列质量得分的代表性柱状图。

序列质量在200个碱基对之后下降是正常现象，但平均质量值应保持在30以上。观看本视频后，您应能够充分掌握如何使用苯酚-氯仿法从拭子样本中提取DNA和RNA，扩增16S核糖体RNA基因的V4区，并构建适用于高通量测序的文库。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在两天内完成。在进行此实验过程中，必须格外注意防止样本采集、核酸提取及 PCR 扩增过程中的污染。切勿忘记，使用苯酚-氯仿具有极高的危险性，操作时应始终采取预防措施，例如在通风橱中操作，并佩戴防渗透手套、带侧护罩的安全眼镜以及实验服。