Name: 过程评价絮凝剂的效率的分散粒子的从植物提取物的去除 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: 了解如何使用实验设计方法评估絮凝剂在植物提取物中去除分散颗粒的效率。该方法通过优化聚合物类型和工艺参数，显著提高过滤能力并降低生产成本。

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感谢 Thomas Rademacher 博士提供转基因烟草种子，以及 Ibrahim Al Amedi 在烟草植株培养方面的协助。感谢 Richard M Twyman 博士在编辑方面提供的帮助，以及 Rainer Fischer 教授在富有成效的讨论中给予的指导。本工作部分由欧洲研究理事会高级资助项目“Future-Pharma”（项目编号 269110）、弗劳恩霍夫未来基金会（Fraunhofer-Zukunftsstiftung）以及弗劳恩霍夫协会内部项目资助（资助编号 Attract 125-600164）提供资金支持。

1. 制定充分的实验策略
<ol>
	<li>确定与待建立或优化的絮凝过程相关的环境和工艺参数， 即 哪些因素对絮凝作用的影响最强。通常，存在多个此类参数，因此可采用近期所述的实验设计（DoE）方法 20 由于缺乏机制模型，这是必要的。
	<ol>
		<li>根据文献数据选择参数（因素） 12缓冲液 pH、缓冲液电导率、孵育时间与温度，以及聚合物类型和浓度等是影响该系统的典型因素，需具备相关的先验知识与操作经验。 15,16,27.</li>
		<li>使用相同的参考文献（参见 1.1）来确定各数值因子的有意义取值范围以及分类因子的水平。</li>
		<li>定义需监测并用于评估絮凝效率的实验结果（响应）。根据具体体系的不同，这些结果可包括滤液或上清液浊度、沉降速度、聚集体尺寸，或后续过滤装置的处理能力 16,23,28-30.</li>
		<li>确保用于检测反应的分析方法具有定量性、稳健性以及可重复性/可再现性，以便后续实验或由其他操作人员完成的实验能够对所得的高质量数据进行补充。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据待研究因素的数量以及对系统已有知识的掌握程度，选择一种合适的实验设计（DoE）类型。参考现有文献以确定一种适当的实验设计（DoE）类型 20.
	<ol>
		<li>如果对所研究的絮凝系统了解较少、需要筛选的参数较多，或对参数的有效范围知之甚少时，应选择筛选性实验设计。典型的筛选设计包括全因子和部分因子设计。若预计参数具有非线性影响，则应在设计中包含中心点。 例如 超过某一阈值的饱和度 19.</li>
		<li>选择响应面法（RSM）， 例如 中心复合设计（CCD） 31 或最佳 32,33，如果只需精确表征少数几个具有明确范围的因素。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用适当的软件设置实验设计（DoE），确保 先验的 满足设计空间比例等质量标准 20.</li>
</ol>
2. 准备絮凝实验
<img alt="藻类处理步骤：提取、絮凝、袋式过滤、深层过滤；方法比较。" src="/files/ftp_upload/53940/53940fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：植物提取物絮凝工作流程：中试规模（左）与台式规模（右）。使用水相缓冲液进行蛋白质提取后，通过添加絮凝剂使分散的细胞碎片颗粒聚集。随后通过袋式过滤与深层过滤的级联过程去除聚集体，这些滤器的通量能力及滤液浊度可直接用于评估絮凝效率。
<ol>
	<li>建立通用实验工作流程图1).
	<ol>
		<li>使用一种提取装置，使其产生的颗粒尺寸分布与最终应用规模下预期（或已观察到）的颗粒尺寸分布相同。 例如 一种专用的匀浆器。如果可能，按照烟草叶片匀浆的方法，设计提取装置的缩小模型 10.</li>
		<li>定义絮凝实验中使用的提取物体积（此处为 20 ml）。选择的体积应确保反应容器中存在具有代表性的颗粒数量。 例如 在20 ml等分试样中进行的絮凝实验，对含有约7% [w/v] 固体的烟草提取物获得了可重复且可放大的结果 34 和粒径约为 ~0.5 µm 约 3 毫米 16.</li>
		<li>设计所有监测和絮凝后操作时，应确保其具有最终应用规模的代表性， 例如 选择与生产规模所用滤器具有相同颗粒截留特性的滤器。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养将用于提取物制备的植物。
	<ol>
		<li>使用相同的植物品系，此处 Nicotiana tabacum 品种 Petit Havana SR1，以及生产过程中将采用的栽培条件，如先前所述 33.</li>
		<li>若需处理其他原料，应将这些原料制备成能够代表最终应用规模的形式， 例如 使用真实的缓冲液，考虑过程中任何稀释步骤，并严格遵循预期的pH值和电导率，此处为pH 7.5和电导率30 mS/cm-1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备过滤装置、浊度监测设备和采样容器。
	<ol>
		<li>将滤膜材料裁剪至所需尺寸（此处为 15 x 15 cm）2，如果它们不是即用型模块。确保所有监测和分析设备正常工作，并标记所有样品管。</li>
		<li>尽管这些是简单的任务，也需及时准备好这些物品，以确保在实际絮凝实验过程中不会造成中断。应避免延误，因为絮凝是一个与时间相关的过程，延迟可能干扰实验结果。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制絮凝剂储备液。注意：操作絮凝剂时应穿戴适当的个人防护装备。 例如 手套。材料可能具有危险性（根据欧洲联盟指令 67/548/CEE、1999/45/CE 的危险标签包括 N、Xi 或 Xn）。避免产生粉尘，并参阅材料安全数据表。在通风橱中操作。
	<ol>
		<li>选择每种絮凝剂的储备浓度，此处为 80.0 g L-1 对于所使用的两种PEI絮凝剂，应尽可能选择高浓度，以避免添加絮凝剂时对样品造成稀释，从而降低颗粒浓度并影响絮凝效率。</li>
		<li>考虑聚合物制剂中可能存在的预稀释情况，该情况反映了生产商的配方。 例如 如果聚合物已以50% [w/v]的水溶液形式提供。迄今为止，发现4-8% [w/v]的絮凝剂储备液最为合适。</li>
		<li>考虑到上述讨论的因素，需确保絮凝剂浓度不会产生高黏度溶液，以免影响移液操作，从而因最终絮凝剂浓度未准确调整而引入误差。</li>
		<li>尽可能使用相同储备浓度的所有絮凝剂，因为这将有助于建立移液方案（2.5），从而降低出错的可能性。</li>
		<li>调节每种絮凝剂储备液的 pH 和电导率，使其与提取物的条件一致，此处为 pH 4−10 和电导率 15−55 mS cm⁻¹-1若对同一种絮凝剂测试多组 pH 值和/或电导率条件，应为其配制单独的母液。</li>
		<li>现配制絮凝剂储备液，使用前存放时间不超过48小时。尽管储存超过4周的聚合物储备液仍可诱导絮凝，但由于在高或低pH条件下发生聚合物水解，其效率可能下降。具体细节请参见生产商说明书。</li>
		<li>确保实验过程中针对每个样本所选的实验设计（DoE）参数均可被精确调整， 例如 确保准备有加热/冷却浴装置，以便调节孵育温度，此处 4 °C, 20 °C 和 37 °C若絮凝过程中的混合是实验的一部分，应确保混合装置在功率输入等关键参数上能代表最终应用规模。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将实验设计（DoE）计划表转换为移液方案。
	<ol>
		<li>将待测试的不同絮凝剂浓度换算为需添加到提取样品中的储备液体积：用最终絮凝剂浓度除以储备液浓度，再乘以絮凝实验中所用的样品体积。确定所得最终体积中的最大值， 例如 如果将20 ml样品与最多2 ml絮凝剂储备液混合，总体积将为22 ml。</li>
		<li>根据待添加的絮凝剂储备液的最大体积，计算所需缓冲液体积，以确保所有絮凝反应 aliquot 的最终体积保持一致。 例如 如果需向样品中加入 0.75 ml 絮凝剂储备液，则需添加 1.25 ml 缓冲液以维持最终样品体积为 22 ml（2.5.1）。</li>
		<li>汇总每种聚合物和絮凝条件下的絮凝剂储备液体积，以计算实验设计（DoE）所需的储备液绝对体积。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收获烟草叶片并制备提取物。
	<ol>
		<li>从合适生长阶段的烟草植株上摘除顶部六片叶片（或根据操作说明中指定的数量摘除） 例如 6 周龄，并转移至合适的提取装置，例如匀浆器或螺旋压榨机。</li>
		<li>每克生物量加入三倍体积的提取缓冲液， 例如 每100克加入300毫升，搅拌8分钟。</li>
		<li>如果需要测试不同的pH值和/或电导率，则应使用适当的缓冲液分别制备提取物。此处包括在搅拌机或榨汁机中将植物材料匀浆3次，每次30秒 34.</li>
		<li>或者，以能够代表所研究工艺的方式制备提取物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分装提取物并加入缓冲液。
	<ol>
		<li>在整个过程中手动充分搅拌提取物，以确保样品均匀且颗粒分布一致。</li>
		<li>将提取物通过倾注方式精确分配至预先标记的反应管中，每管 20 ml。使用可直立的 50 ml 管可简化操作，适用于 20 ml 样品。</li>
		<li>使用合适的移液器，向每个单独的反应管中加入所需体积的提取缓冲液，以维持固定的最终体积。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用不同聚合物对植物提取物进行絮凝
<ol>
	<li>根据实验设计（DoE）中指定的随机运行顺序，依次向样品中加入所需体积的絮凝剂储备液，此处为 0.1−2.0 ml。在加入絮凝剂后，立即通过剧烈手动振荡 20 秒，彻底混匀每个样品。
	<ol>
		<li>如有需要，可根据其他原料调整振荡时间以确保充分混合，但必须严格保证所有样品的混合时间一致。需注意，过长的混合时间可能导致絮体不可逆地破碎，而振荡过程中施加的力不一致也会影响絮凝结果的可重复性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可选：修改上述步骤，以实现两种或多种絮凝剂的同时施加。
	<ol>
		<li>选项 1：不使用单一聚合物，而是加入两种或多种絮凝剂的混合物，此处为 PEI 和壳聚糖。采用实验设计（DoE）中定义的絮凝剂组合。在实验设计设置（1.1）过程中，将聚合物的比例和绝对浓度作为独立参数纳入考虑。</li>
		<li>选项 2：将两种或多种聚合物依次加入提取液中。
		<ol>
			<li>在实验设计设置中，将各聚合物的浓度、类型以及每次加入之间的孵育时间作为额外的影响因素。</li>
			<li>也可采用此方法测试单个聚合物重复添加是否可改善絮凝效果。通过分步添加模拟絮凝剂的缓慢加入过程，e.g. 分四步，每步向 20 ml 体积中加入 0.25 ml 80 g L-1 絮凝剂储备液，持续 4 分钟，可模拟流速为 0.25 ml min-1 的絮凝剂添加过程。</li>
			<li>在所有情况下，通过将所有絮凝剂的最大体积加至样品体积中，确定该设置下的新最大终体积（此处仍为 22 ml），并根据需要重新计算絮凝剂储备液和缓冲液的调整体积。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照实验设计（DoE）中规定的时间孵育样品，通常为 3–30 分钟，以允许絮体形成。确保所有其他孵育条件（e.g. 温度）也根据实验设计设定。</li>
	<li>观察并记录絮体形成过程。根据需要记录絮体形成进程，e.g. 通过测量沉降固体的高度，以每分钟沉降的毫米数（mm/min）表示。如有必要，可延长絮凝时间，例如过夜。</li>
	<li>过滤絮凝后的提取液。
	<ol>
		<li>使用先前准备好的滤材（2.3）在适当孵育时间后澄清絮凝提取液，将絮凝后的样品倾倒通过滤材，流入洁净容器或反应管中。
		<ol>
			<li>过滤前不得重新悬浮已沉降的絮体，并以约 300 ml min-1 的速率将提取液施加于滤材，相当于 20 ml 样品在 3–4 秒内完成过滤。</li>
			<li>若台式实验中使用的滤材与最终工艺不同，应确认该过滤步骤的性能，e.g. 通过测量两类样品中颗粒尺寸分布来评估颗粒截留效果11。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>根据需要使用适当的设备（e.g. 浊度计）对滤液进行浊度和/或颗粒尺寸分布分析。</li>
		<li>可选：在延长孵育时间（e.g. 12–24 小时）后重复分析，以研究不稳定絮体的形成或再形成情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据预定义的响应指标（1.1.3）分析样品。
	<ol>
		<li>从滤液中取样，并分析其他响应参数，e.g. 不同目标蛋白或有价值产物的浓度。</li>
		<li>可选：对截留物（主要为固体）进行相同参数的分析，以完成工艺的质量平衡。特别是通过比较经絮凝处理与未处理样品后残留的固体质量，量化絮凝剂对液体回收率的影响。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确认数据质量，并将结果导入实验设计（DoE）软件。
	<ol>
		<li>检查收集到的响应数据中是否存在极端值，e.g. 意外的高值。</li>
		<li>确保所有响应数据与其对应的实验条件正确匹配。</li>
		<li>将结果输入实验设计（DoE）软件，并确保标准运行顺序与随机化运行顺序未被混淆。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 评估实验设计
<ol>
	<li>使用 DoE 软件内置的数据分析工具，按照先前所述方法建立预测模型 20.
	<ol>
		<li>如有需要，选择适当的数据转换方法以利于模型构建，此处为对数转换10. 最大值的比值大于10 与 最小的响应值表明可能需要进行数据转换。使用适当的统计工具确定最合适的转换方法。 例如 Box-Cox 图 35.</li>
		<li>选择一个基础模型，该模型需（i）符合所选的实验设计（DoE）（1.2），以及（ii）根据DoE软件的方差分析（ANOVA）工具对所研究系统的先前认知具有一致性。 例如 二阶多项式通常比一阶多项式更能较好地拟合孵育时间的观察效应。</li>
		<li>去除不显著的模型因子， 例如 p &gt;0.05，或通过取消选择因子交互项来迭代简化，从而降低模型复杂度并提高其预测能力。</li>
		<li>通过比较 R 来确认模型质量2，调整后 R2 和预测的 R2 以及学生化残差的正态概率图、残差与实验顺序图、预测值与实测值图和Box-Cox图 36. 所有 R2 数值应在 0.2 范围内。</li>
		<li>确保最终模型符合物理学和热力学的基本假设， 例如 不会预测出负浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用该模型预测所研究系统最有利的条件，此处为低浊度。
	<ol>
		<li>选择最重要的响应及其首选状态， 例如 浊度最低。通过最大化合意性函数或类似工具来整合这些选择，此类工具是多种实验设计（DoE）软件包的内置功能。 36.</li>
		<li>根据模型的预期应用，选择确认性实验以验证最优条件和/或模型的整体预测能力， 例如 如果预测为最有利的条件未包含在初始实验设计（DoE）中，则应将其选为后续实验。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 改进模型并验证预测能力
<ol>
	<li>将初始设计空间缩小至最理想的操作条件， 例如 在0−1,000散射浊度单位（NTU）范围内，浊度较低，依据模型预测（4.2）。</li>
	<li>在这些范围内建立一个新的实验设计（DoE），仅包含已确定为显著或相关的因素（4.1.2）。 
	注意：某个因子在模型分析中可能具有显著性，但对于实际过程而言可能是无关的， 即 其对反应的影响是 &lt;1%，相较于其他因素。</li>
	<li>重复步骤1-5.2，直至模型预测的质量达到要求。 例如 模型的标准差由软件指示，对于预期应用已足够。如有必要，针对这些迭代修改实验策略。 例如 精炼过程中仅使用一种絮凝剂。</li>
	<li>将小规模模型的结果转移并验证至中试规模或最终生产规模。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

设计用于表征颗粒絮凝的实验设计（DoE）时，最重要的考虑因素是：该设计在原则上必须能够检测并描述预期或可能产生的效应。 36,38, 例如 pH、聚合物类型和聚合物浓度的影响 16因此，在开始实际实验之前评估设计空间分数（FDS）非常重要。FDS 是指由设计因素所覆盖的多维实验空间中被有效设计覆盖的部分所占的比例， 例如 在已知系统变异性的条件下，能够检测出两种实验结果之间预定义差异的 pH 范围 例如 检测在 125 NTU 变异性条件下 250 NTU 浊度的差异。可通过增加实验次数来提高 FDS，旨在指导工艺控制的设计其 FDS 应 ≥0.95 36此外，如果运行次数不足以在一天内完成整个实验，则应在实验设计（DoE）中预先定义区组，以考虑批间和日间变异。在处理植物材料时，应在每个区组中加入参考运行例如 未经处理的对照组）有助于补偿变异性，从而实现对多次实验数据的比较，每次实验数据均归一化至其相应的参照实验。在此情况下，增加实验设计（DoE）中的重复实验次数也是有益的。
<p class...

植物被广泛用于生产果汁等食品商品，但也可被开发为生产高价值生物制药产品的平台1-3。在这两种情况下，下游加工（DSP）通常始于从叶片或果实等组织中提取液体，随后对含有颗粒的提取物进行澄清4,5。在生物制药生产中，下游加工的成本可占总生产成本的高达80%6,7，这部分反映了采用刀片式匀浆等破坏性方法制备的提取物中存在较高的颗粒负荷8,9。尽管根据提取物中颗粒粒径分布合理选择滤层可提高过滤容量并降低成本10,11，但其改善程度始终无法超越澄清过程中单位过滤面积必须截留的颗粒数量所决定的绝对容量上限。
如果在过滤系统中到达最细过滤器表面的颗粒物较少，则可提高过滤通量，而通过将分散的颗粒物与已知可促进聚集成较大絮状物的聚合物（称为絮凝剂）混合，便可实现这一效果12。此类絮状物可被更上游的较粗且成本较低的袋式过滤器截留，从而减少到达更细且更昂贵的深层过滤器的颗粒负荷。这些聚合物必须具备适用于其用途的安全性特征，例如，用于生物制药时必须符合药品生产质量管理规范（GMP）要求，且通常其摩尔质量必须&#62;100 kDa，可为中性或带电荷13。中性絮凝剂通常通过交联分散颗粒引发其聚集，并形成直径&#62;1 mm的絮状物11，而带电聚合物则通过中和分散颗粒的电荷，降低其溶解度，从而导致沉淀14。
通过调整缓冲液的 pH 值或电导率、聚合物的种类或浓度等参数，使其与提取物的性质相匹配，可改善絮凝效果15,16。对于经 0.5–5.0 g L-1 聚乙烯亚胺（PEI）预处理的烟草提取物，在 100 L 规模的中试工艺中，深层过滤器的处理能力提高了两倍以上。该聚合物的成本低于 €10 kg-1，因此将其引入工艺后，每批次在滤器和耗材方面可节省约 €6,000 的成本16，若与基于纤维素的助滤剂联用，节省成本可能更高17。尽管如此，仍需要建立预测模型来评估絮凝剂在事前（a priori）的经济效益，因为添加絮凝剂可能需要 15–30 分钟的持留步骤16,18，从而导致储罐设备的额外投资成本。然而，由于絮凝过程的复杂性，目前尚无可用的机理模型能够预测此类实验的结果。因此，本文介绍了一种更为合适的实验设计（DoE）方法19。该通用 DoE 程序的详细方案最近已发表20。
目前已有可用于絮凝条件高通量筛选的小型化设备21。然而，这些设备可能无法真实模拟植物提取物絮凝过程中的实际条件，因为反应容器的尺寸（如96孔板中孔的直径约为7 mm）与颗粒或絮体的尺寸之间的差异可能不足一个数量级，这会影响混合模式，从而降低模型的预测能力。此外，由于混合行为和沉淀物稳定性存在非线性变化，涉及沉淀的工艺在缩小规模时可能难以实现22。因此，本文介绍了一种台式规模的筛选系统，每日可处理50至75个样品，其结果可从初始20 ml的反应体积线性放大至100 L的中试规模工艺16。结合实验设计（DoE）方法，该系统可建立具有预测能力的模型，用于工艺优化和文件记录，作为质量源于设计（quality-by-design）理念的一部分。
下述方法也可适用于基于细胞培养工艺生产的生物制药，其中絮凝剂也被视为一种节约成本的工具23。该方法还可用于模拟从粗提物中沉淀目标蛋白质的过程，作为纯化策略的一部分，已在芥菜籽、玉米和大豆中生产的β-葡萄糖醛酸酶中得到验证24,25。有关絮凝剂特性的详细描述可参见其他文献16,26，并需确保聚合物浓度在最终产品中为无毒或低于有害水平11。

<table><tbody><tr><td>2100P 便携式浊度计</td><td>Hach</td><td>4650000</td><td>浊度计</td></tr><tr><td>2G12 抗体</td><td>Polymun</td><td>AB002</td><td>参考抗体</td></tr><tr><td>Biacore T200</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9750-01</td><td>SPR 仪器</td></tr><tr><td>BP-410</td><td>Furh</td><td>2632410001</td><td>袋式过滤器</td></tr><tr><td>Catiofast VSH</td><td>BASF</td><td>79002360</td><td>絮凝剂</td></tr><tr><td>Centrifuge 5415D</td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td>离心机</td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>Labomedic</td><td>2017106</td><td>反应管</td></tr><tr><td>50 ml 自立式离心管</td><td>Labomedic</td><td>1110504</td><td>反应管</td></tr><tr><td>壳聚糖</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>5375.1</td><td>絮凝剂</td></tr><tr><td>Design-Expert(R) 8</td><td>Stat-Ease, Inc.</td><td>n.a.</td><td>实验设计软件</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>&amp;nbsp;4984.3&amp;nbsp;</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>Ferty 2 Mega</td><td>Kammlott</td><td>5.220072</td><td>肥料</td></tr><tr><td>Forma -86C 超低温冰箱</td><td>ThermoFisher</td><td>88400</td><td>冰箱</td></tr><tr><td>温室</td><td>n.a.</td><td>n.a.</td><td>用于植物培养</td></tr><tr><td>Grodan 岩棉块 10 × 10 cm</td><td>Grodan</td><td>102446</td><td>岩棉块</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9105.3</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>K700P 60D</td><td>Pall</td><td>5302305</td><td>深层过滤层</td></tr><tr><td>KS50P 60D</td><td>Pall</td><td>B12486</td><td>深层过滤层</td></tr><tr><td>Miracloth</td><td>Labomedic</td><td>475855-1R</td><td>滤布</td></tr><tr><td>MultiLine Multi 3410 IDS</td><td>WTW</td><td>WTW_2020</td><td>pH 计 / 电导率计</td></tr><tr><td>Osram 冷白光 36 W</td><td>Osram</td><td>4930440</td><td>光源</td></tr><tr><td>植物生长室</td><td>Ilka Zell</td><td>n.a.</td><td>用于植物培养</td></tr><tr><td>Polymin P</td><td>BASF</td><td>79002360</td><td>絮凝剂</td></tr><tr><td>POLYTRON PT 6100 D</td><td>Kinematica</td><td>11010110</td><td>配备定制刀头的均质化装置</td></tr><tr><td>Protein A</td><td>Life technologies</td><td>10-1006</td><td>抗体结合蛋白</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P029.2</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>Synergy HT</td><td>BioTek</td><td>SIAFRT</td><td>荧光酶标仪</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>4855.3</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9127.3</td><td>培养基组分</td></tr><tr><td>VelaPad 60</td><td>Pall</td><td>VP60G03KNH4</td><td>过滤器外壳</td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>Malvern</td><td>ZEN3600</td><td>DLS 粒径分布测量仪</td></tr></tbody></table>

评估絮凝剂去除植物提取物中分散颗粒效率的实验步骤

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

植物对人类的重要性不仅在于其能够提供食物、饲料和原材料等商品，更在于其正日益被用作生产高附加值产品（如生物制药）的制造平台。在这两种情况下，可能都需要对液态植物提取物进行澄清，以去除其中的颗粒物。最佳的澄清效果可通过提高过滤和离心的操作容量与设备寿命，从而降低相关成本。这一目标可通过引入称为絮凝剂的带电聚合物来实现，这些絮凝剂可交联分散的颗粒，促进固液分离。然而，目前尚无适用于植物提取物等复杂混合体系的机理性絮凝模型，因此通常采用经验模型。本文介绍了一种实验设计方法，可用于快速筛选不同类型的絮凝剂，优化植物提取物的澄清过程，并显著降低浊度。所建立的预测模型有助于确定稳健的工艺条件，并筛选出具有互补特性的聚合物组合，例如，在特定电导率的提取物中实现高效絮凝。本文以烟草叶片提取物为例所得结果，可轻松推广至其他植物种类或组织，从而推动商品及植物源性药物下游加工过程向更具成本效益的方向发展。

利用不同聚合物对烟草提取物进行絮凝
上述方法已成功用于开发一种在生产单克隆抗体（HIV中和抗体2G12）和荧光蛋白（DsRed）过程中对烟草提取物进行絮凝的工艺（图1）16，并已推广应用于其他蛋白质，包括凝集素、疟疾疫苗候选蛋白和融合蛋白（未发表数据）。通常情况下，使用絮凝剂可将经袋式过滤的植物提取物的浊度从提取后的约10,000 NTU降低至袋滤后约6,000 NTU，最终降至约1,000 NTU。在初步筛选实验中，采用包含91次运行的IV型最优设计，测试了18种不同的聚合物在三种不同浓度下的效果（因为该因素会影响絮凝效率13,27），并在约12小时的孵育期间内观察絮凝情况（图2A 和 图2B）。较长的孵育时间对于确定絮凝过程有意义的时间范围具有重要意义。同时测试了pH值为4–8的条件，因为在未来的工艺中，...

本文介绍的实验设计方法可用于评估不同絮凝剂在聚集植物提取物中分散颗粒方面的性能，从而降低浊度以及下游加工的成本。

植物对人类至关重要，不仅因为它们提供了食物、饲料和原材料等商品，而且越来越因为它们可以被用于……

以下实验的总体目标是鉴定能够提高从植物提取物中去除分散颗粒的絮凝剂。通过建立实验设计，确定对这些分散颗粒聚集过程最有效的聚合物及控制参数，从而实现这一目标。第二步定义了工作流程，该流程对应于大规模应用中所采用的单元操作。接下来，在不同条件下制备用于絮凝剂的叶片提取物，并对其进行分析，以测定浊度和产物回收率。结果展示了基于实验设计模型评估（我们简称为DoE）所得的最佳絮凝条件及聚合物。与仅使用深层过滤的传统澄清方法相比，该技术的主要优势在于可使过滤器容量提高数倍，从而降低整体工艺成本。絮凝可以增加颗粒的有效直径，从而促进通过离心或过滤将其去除。因此，必须首先确定与絮凝过程相关的环境工艺参数。通常，这类参数有多个。因此，在缺乏机理模型的情况下，采用实验设计（DoE）方法是合适的。通过参考文献数据和先验知识来选择参数，从而建立实验设计。典型参数包括孵育时间以及聚合物类型和浓度。用于评估絮凝效率的实验结果（如滤过性）也需在实验前予以定义。随后将这些信息输入适合所研究因素数量及对该系统已有认知程度的实验设计（DoE）类型中。制定一个工作流程，以涵盖植物提取物絮凝及实验室规模加工的所有相关步骤。分装体积应足够小，以实现高通量样品处理。实验室设备的性能应与工艺规模设备的性能相一致。植物的培养方式应能够代表最终的生产工艺。在开始提取和絮凝实验之前，需准备好所有器具。配制絮凝剂储备液时，应仔细考虑生产商是否已进行预稀释。为所有絮凝剂选择相同的储备浓度，可简化后续移液操作，降低出错概率。每种新鲜絮凝剂储备液的缓冲液成分、pH 值和电导率均需配制为与提取物条件相匹配。将实验设计（DoE）方案转换为移液方案，明确各储备液需添加至植物提取物样品中的体积。植物提取物样品通过收获的烟草叶片制备，所用缓冲液需与实验设计（DoE）中拟测试的条件相匹配。搅拌提取物的同时，按预设体积分装等分试样，以确保所有样品中颗粒分布均匀。向每份等分试样中加入提取缓冲液，使得在加入絮凝剂储备液后，各样品体积保持一致。根据实验设计（DoE）中定义的体积，将储备溶液按照随机化的运行顺序依次加入样品中。每次加入聚合物后立即振荡试管，使聚合物在样品中均匀分布，这也有助于确保絮凝结果的可重复性。该方法可轻松修改，用于测试多种絮凝剂的组合或同一种絮凝剂的重复添加。但这必须在实验设计（DoE）中予以实施。絮凝形成通常需要3至30分钟的孵育时间。遵循实验设计（DoE）中规定的孵育时间，是获得可重复结果的必要条件。絮体的沉降速度或滤液的浊度及过滤能力均可用于评估絮凝剂的性能。同时，还需确认聚合物不会对蛋白质等产品产生干扰。在确认数据质量后，可将信息导入实验设计（DoE）软件中。使用实验设计（DoE）软件内置的工具对实验数据进行分析，包括数据转换、因子筛选和质量控制工具。除使用这些工具外，最终模型还应符合物理学和热力学的基本定律。在确认模型质量后，即可利用该模型预测絮凝过程的最佳条件。根据模型预测结果，可将设计空间缩小至最相关的区域，并在此基础上建立新的实验设计（DoE），重复前述过程。随后可在中试或生产规模上验证结果。在本项代表性研究中，采用实验设计（DoE）方法评估了23种不同的合成絮凝剂和4种天然絮凝剂对烟草叶片提取物的絮凝能力。综合考虑聚合物浓度和类型等聚合物特异性参数，以及孵育时间、温度、缓冲液 pH 值和电导率等工艺参数。通过包含约 200 份 20 mL 提取液等分试样的四重嵌套 IV-最优设计实验序列，我们发现，在 pH 4 至 8 范围内，只要温度介于 4 至 30 摄氏度之间，Polymin P 是烟草提取物最有效的絮凝剂。15 分钟的孵育时间足以实现絮凝，但当电导率超过 40 mS/cm 时，其效果下降。然而，实验设计（DoE）方法表明，Catiofast VSH 与 Polymin P 具有互补性，在电导率大于 40 mS/cm 的条件下可实现有效的絮凝。当将这些絮凝剂引入烟草提取物的下游加工过程后，所用深层过滤器的处理容量提高了 3.2 至 5.7 倍，从而相应降低了该步骤的生产成本。我们证实，这些絮凝剂不会降低目标蛋白的回收率，包括单克隆抗体、荧光蛋白、凝集素以及多种疫苗候选蛋白。最佳絮凝条件还在100 L中试规模批次中得到验证。实验设计（DoE）的结果也成功应用于使用螺旋压榨机而非刀片式均质器制备的烟草提取物，凸显了所获得信息的广泛适用性。我们还改进了该方法以测试絮凝剂组合，结果同样有效。观看本视频后，您应了解如何采用实验设计（DoE）方法为植物提取物建立絮凝实验。

procedure-to-evaluate-efficiency-flocculants-for-removal-dispersed

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

过程评价絮凝剂的效率的分散粒子的从植物提取物的去除

本研究建立了一种利用人腺病毒加标来确定小体积水样中最佳病毒浓度条件的方法。文中所述技术可用于确定其他病毒目标物的浓缩参数，并可应用于大规模病毒浓缩实验。...

一种用于从水中浓缩病毒的小体积方法

稳定的功能性油墨配方对于拓展增材制造的应用至关重要。而要有效配制油墨，必须了解分散剂与颗粒之间结合机制的相关知识。本文介绍了漫反射傅里叶变换红外光谱法（DRIFTS），作为一种简单且低成本的方法，可用于深入研究这些机制。...

功能油墨中分散剂/颗粒结合机制的漫反射红外光谱鉴定

本文介绍了针对大气气溶胶中表面活性剂的靶向提取方法，以及测定其在水中的绝对浓度和表面张力曲线（包括临界胶束浓度（CMC））的方法。...

大气气溶胶中表面活性剂的提取与表征

以颗粒形式存在的养分在农业排水水中可能对总负荷产生显著贡献。本研究描述了一种新方法，可在整个排水事件期间采集来自农田渠道排水的流量加权水样及悬浮颗粒物。...

在排水事件期间采集农业沟渠中流量加权的水样及悬浮颗粒物

在自然环境中观察到的海洋环境中黏土与细菌细胞之间的相互作用及其沉降过程，最适合在受控的实验室条件下进行研究。本文描述了一种详细的实验方案，介绍了一种测量黏土与蓝细菌絮凝物沉降速率的新方法。...

黏土/蓝细菌絮凝体沉降速率的测定

本文描述了在载玻片上利用蓝莓或蔓越莓花提取物监测真菌病原体Colletotrichum...

Colletotrichum fioriniae 在水和基于氯仿的蓝莓与蔓越莓花提取物中的发育

联合粒径与密度分馏（CSDF）是一种通过物理方法将土壤按质地（颗粒大小）和矿物学（密度）差异分离成不同组分的方法。其目的是分离出对土壤有机质（SOM）具有不同反应活性的组分，以更深入地理解有机质-矿物相互作用及土壤有机质的动态变化过程。...

结合土壤粒径与密度分级法研究有机质-矿物相互作用

在此方案中，将一种基于 DsRed 的表位配体固定化，以制备高选择性亲和树脂，用于从粗制植物提取物或细胞培养上清液中捕获单克隆抗体，可作为 Protein A...

用于快速开发亲和层析树脂的活化交联琼脂糖——以抗体捕获为例

从环境水和废水样品中浓缩病毒是一项具有挑战性的任务，主要用于病毒的鉴定与定量。尽管已有多种病毒浓缩方法被开发和验证，本文展示了超滤法和脱脂乳絮凝法在不同样品类型中对RNA病毒的有效性。...

利用脱脂牛奶絮凝与超滤法从环境水和废水样品中浓缩病毒颗粒

可通过多种方法检测植物对咀嚼式昆虫食草动物的抗性。本文中，我们展示了如何利用模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）建立选择性和非选择性实验，以鉴定其对害虫小菜蛾（Pieris...

用于检测拟南芥对咀嚼式昆虫抗性的选择与非选择试验

了解如何使用实验设计方法评估絮凝剂在植物提取物中去除分散颗粒的效率。该方法通过优化聚合物类型和工艺参数，显著提高过滤能力并降低生产成本。

评估絮凝剂去除植物提取物中分散颗粒效率的实验步骤

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