海藻酸钙微珠中多酶共固定化用于辅因子再生及提高重复使用性

本实验方案的总体目标是展示一种将偶联的全细胞生物催化体系固定化于海藻酸盐微球中，以提高产物产率和可重复使用性的方法。这是我的研究方向，我已在生物催化领域回答了若干关键问题，包括生物催化剂的固定化、稳定性、辅因子再生以及全细胞生物催化剂的应用。该技术的主要优势在于，为通过依赖辅因子的代谢途径高效生产多种重要生物分子提供了一种简单而灵活的策略。

本方案中使用两种重组大肠杆菌菌株：表达NADH氧化酶的SpNOx大肠杆菌，以及表达L-阿拉伯糖醇脱氢酶的HjLAD大肠杆菌。由于两种大肠杆菌菌株的操作步骤相同，以下仅以HjLAD大肠杆菌为例进行演示。

挑取单个 HjLAD E coli 菌落接种于 3 毫升 LB 培养基中，培养基中添加 15 微克/毫升的 Ket-A-My-Sin，在摇床培养箱中过夜培养。次日，将菌液按 1:100 的比例稀释至 200 毫升含 15 微克/毫升 Ket-A-My-Sin 的新鲜 LB 培养基中，于 37 摄氏度、250 RPM 条件下培养，直至 OD 600 达到约 0.6。向培养基中加入 0.1 毫摩尔的 IPTG 以诱导 HjLAD 蛋白表达，并在 25 摄氏度、200 RPM 条件下继续培养 6 小时。

在4 ℃条件下，以3200 × g离心20分钟收集诱导后的细胞。弃去上清液，并按照下一节所示方法处理细胞沉淀。开始本操作时，分别将HjLAD大肠杆菌和SpNox大肠杆菌的细胞沉淀悬浮于50 mmol/L Tris-HCl缓冲液中，细胞密度为每升5克干重细胞。

在14毫升圆底试管中，加入600微升浓度为每升5克干菌重的HjLAD大肠杆菌、600微升浓度为每升5克干菌重的SpNOx大肠杆菌、100微升20毫摩尔NAD+，以及150微升2摩尔L-阿拉伯醇。加入550微升50毫摩尔Tris-HCl，将反应体系补足至2毫升。将反应混合物于30摄氏度、200转/分钟条件下孵育8小时。

孵育8小时后，在4°C、3200 × g条件下离心10分钟，收集反应上清液。为通过比色法测定L-木酮糖的生成量，取100 µL收集的上清液加入1.5 mL离心管中。依次加入50 µL 1.5%半胱氨酸溶液、900 µL 70%硫酸溶液和50 µL溶于乙醇的0.1%卡巴匹林（Kar-Piz-All），轻轻翻转管子3次以混匀。

将反应混合物在37摄氏度、200转/分钟条件下孵育20分钟。使用分光光度计在560纳米处测定反应混合物的光吸收值。通过配制4%的海藻酸钠溶液开始固定化实验步骤。

将0.8克海藻酸钠加入20毫升蒸馏水中，加热使海藻酸钠溶解。向1.2毫升4%海藻酸钠溶液中加入600微升每升5克干菌体重量的HjLAD大肠杆菌和600微升每升5克干菌体重量的SpNOx大肠杆菌。轻轻吹打混匀细胞与海藻酸钠溶液，避免产生气泡。

为确保形成大小均匀、形态一致且硬度适中的海藻酸盐微球，必须将细胞-海藻酸盐悬浮液缓慢地以逐滴方式加入足量的氯化钙溶液中，滴加高度需保持适当，并确保溶液足以浸没所有微球。用注射器配合针头吸取细胞-海藻酸盐悬浮液，然后在持续搅拌条件下逐滴加入盛有100毫升0.3摩尔氯化钙溶液的烧杯中。将微球置于氯化钙溶液中，在室温下静置2至3小时，不进行搅拌，以使交联反应充分进行。

小心地将氯化钙溶液倒入15毫升锥形管中，使小球沉淀不被扰动，从而分离上清液。将剩余的小球转移至另一个50毫升锥形管中。为去除过量的氯化钙和未包埋的细胞，用50毫摩尔/升的Tris-HCl缓冲液洗涤小球。

向珠子中加入 10 毫升缓冲液，静置三到五分钟。待珠子沉降至底部后，将缓冲液倾倒至另一个容器中。以此方式洗涤珠子三次。

在任何步骤中均不得离心珠子，否则珠子会破裂。不要丢弃使用过的 Tris-HCl 洗涤缓冲液。将之前收集的使用过的氯化钙溶液与 30 毫升使用过的洗涤缓冲液一并吸取。

通过在3200 × g 条件下离心20分钟，沉淀未固定的 E. coli 细胞，离心对象为已吸取的氯化钙和Tris-HCl溶液。将洗涤后的珠子转移至一支离心管中。随后，按照细胞沉淀所用的相同步骤检测L-木酮糖的生物合成，但以全部洗涤后的珠子替代细胞沉淀。

为了评估用于L-木酮糖生产的固定化生物催化剂的稳定性，需在凝胶珠形成后将其收集，并按照之前所述方法，用10毫升50毫摩尔Tris-HCl缓冲液洗涤两次，且不进行离心。将所有洗涤后的凝胶珠用于进行L-木酮糖生产的反应，操作方法如前所述。

通过比色法测定L-木酮糖的产量，方法如前所述。针对所需的生产周期重复L-木酮糖生成反应，并测定每个周期反应上清液中产生的L-木酮糖量。该偶联的全细胞生物催化系统可提高L-木酮糖的产量。

以150毫摩尔/升L-阿拉伯糖醇为初始浓度，单独使用HjLAD大肠杆菌生物催化剂可产生79%的L-木酮糖产率。相比之下，使用HjLAD大肠杆菌和SpNOx大肠杆菌细胞以1:1比例组合时，L-木酮糖产率达到96%。对影响生物催化剂固定化效率的参数进行评估后发现，在1%至3%范围内，随着海藻酸钠浓度的增加，固定化效率也随之提高。

然而，海藻酸钠浓度高于2%会导致L-木酮糖产率下降。使用2%的海藻酸钠浓度时，确定用于固定化和L-木酮糖产率的最佳氯化钙浓度为0.3摩尔。对生物催化剂的可重复使用性进行了评估。

在此图中，固定化偶联全细胞生物催化剂和游离偶联全细胞生物催化剂在连续重复使用七轮过程中的L-木酮糖产量分别以深灰色和浅灰色表示。尽管固定化偶联全细胞生物催化剂达到的最大L-木酮糖产率低于游离偶联全细胞系统，但固定化显著提高了其可重复使用性。在连续重复使用七轮后，固定化生物催化剂仍保持稳定，并保留了原始L-木酮糖产率的65%。

该技术发展之后，为生物催化领域的研究人员探索全细胞生物催化剂的产率以及涉及辅因子的主要反应铺平了道路。