Name: 藻酸盐珠多生物催化剂辅因子再生和可重用性改进的固定化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 了解利用大肠杆菌全细胞生物催化剂共固定化于海藻酸钙珠中的方法，以提高辅因子再生效率和生物催化剂的可重复使用性。该技术为生物催化领域的生物分子生产提供了简单灵活的解决方案。

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本研究由韩国国家研究基金会（NRF）通过教育科学技术部资助的基础科学研究中心项目（NRF-2013R1A1A2012159 和 NRF-2013R1A1A2007561）、建国大学、密歇根大学化学工程系及MCubed项目资助。

1. 全细胞生物催化剂的制备 &#160;
注意：携带 pET28a-SpNox31 或 pET28a-HjLAD28 的重组 E. coli 细胞此后分别称为 E. coliSpNox 和 E. coliHjLAD。
<ol>
	<li>将一株大肠杆菌E. coliHjLAD单菌落接种于3 ml&#160;添加卡那霉素（50 µg/ml）的LB（Luria-Bertani）培养基中，于37 oC、250 rpm条件下在摇床培养箱中过夜培养。</li>
	<li>将上述菌液按1:100比例转接至200 ml&#160;含50 µg/ml&#160;卡那霉素的新鲜LB培养基中，于37 oC、250 rpm条件下培养至OD600达到约0.6。</li>
	<li>向培养基中加入0.1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）以诱导HjLAD蛋白表达，并于16 oC、180 rpm条件下继续培养16小时。
	<ol>
		<li>或者，若当天进行后续L-木酮糖生物合成（见下文步骤2），可在25 oC、200 rpm条件下诱导6小时&#160;。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在4 oC条件下，以3,200 × g离心20分钟收集诱导后的E. coliHjLAD细胞，弃去上清液，随后进行步骤2处理菌体沉淀。</li>
	<li>同时，对E. coliSpNox执行步骤1.1至1.4。</li>
</ol>
2. 通过偶联大肠杆菌E. coliHjLAD与E. coliSpNox实现辅因子再生以生物合成L-木酮糖
<ol>
	<li>分别将 E. coliHjLAD 和 E. coliSpNox 的细胞沉淀重悬于 50 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）中，细胞密度为 5.0 g 干细胞重量（gDCW）/L。 
	注意：可建立 gDCW 与在 600 nm 处测得的光密度（OD600）之间的相关性，以方便实验操作。本方案中使用的公式为 1 gDCW/L = 0.722 × OD600 - 0.0965，该公式可能因不同分光光度计而有所差异。</li>
	<li>在 14&#160;ml&#160;圆底试管中加入 600 µl&#160;5.0 gDCW/L 的 E. coliHjLAD、600 µl&#160;5.0 gDCW/L 的 E. coliSpNox、100 µl&#160;20 mM NAD+ 以及 150 µl&#160;2 M L-阿拉伯糖醇，并加入 550 µl&#160;50 mM Tris-HCl（pH 8.0）将反应体积调至 2 ml&#160;。 
	注意：可优化两种全细胞生物催化剂的用量比例以提高产物的生物合成效率。对于本描述体系，E. coliSpNox:E. coliHjLAD = 1:1 的比例对 L-木酮糖的生物合成最为理想（图 1B）。</li>
	<li>将反应混合物在 30 oC、200 rpm 条件下孵育 8 小时。</li>
	<li>在 4 oC、3,200 × g 条件下离心 10 分钟后收集上清液，并按照下文步骤 3 所述方法测定 L-木酮糖的产量。</li>
</ol>
3. L-木酮糖定量的比色法检测
<ol>
	<li>从步骤 2.4 收集的反应上清液中吸取 100 µl&#160;至 1.5 ml&#160;离心管中。</li>
	<li>加入 50 µl&#160;1.5% 半胱氨酸溶液、900 µl&#160;70% 硫酸溶液和 50 µl&#160;溶于乙醇的 0.1% 卡巴唑溶液，轻轻翻转离心管 3 次以混匀。</li>
	<li>将反应混合物在 37 oC、200 rpm 条件下孵育 20 分钟。</li>
	<li>使用分光光度计在 560 nm 处测定反应混合物的光吸收值（A560）。
	<ol>
		<li>若 A560 读数超过 1，则对反应混合物进行稀释。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 重组全细胞催化剂在海藻酸钙小球中的固定化
<ol>
	<li>将4 g海藻酸钠溶解于100 ml水中&#160;蒸馏水。通过将海藻酸钠加入水中来配制海藻酸钠溶液，以避免形成团块。必要时可加热混合物。</li>
	<li>加入 600 µl&#160;5.0 gDCW/L E. coliHjLAD 和 600 µl&#160;5.0 gDCW/L E. coliSpNox 在 1.2 ml 中&#160;将第4.1步制备的4%海藻酸钠与细胞轻柔吹打混匀，避免产生气泡。</li>
	<li>用针头将海藻酸盐/细胞悬液吸入注射器，然后逐滴加入0.3 M氯化钙（CaCl₂）溶液中2) 溶液于100 ml&#160;烧杯中持续搅拌。 
	注意：CaCl₂ 的体积2 用于海藻酸盐微球形成的溶液应足量，以确保海藻酸盐液滴完全浸没。此外，注射器针头与氯化钙溶液液面之间的距离必须保持在最佳范围内，以保证形成均匀的球形微球。该最佳距离范围可通过实验确定，并取决于针头的内径。据估算，对于内径为0.6 cm的注射器针头，约15 ± 5 cm的距离较为适宜。</li>
	<li>将珠子留在 CaCl₂ 溶液中2 溶液处理 2 - 3 小时&#160;室温下静置，不搅拌，以促进交联和凝胶微珠的形成。</li>
	<li>倒出 CaCl2 溶液，注意不要扰动珠子，需小心倾倒 CaCl2 溶液转移至50 ml&#160;锥形管，并转移剩余的珠子至 CaCl2 将溶液转移至另一个50 ml离心管中&#160;锥形管</li>
	<li>用10 ml缓冲液洗涤磁珠&#160;用50 mM Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液洗涤三次，以去除过量的CaCl₂2 未包封的细胞。 
	注意： 在任何步骤中均不得离心珠子，因为离心会导致珠子破裂。若需将珠子与溶液分离，可将悬浮液静置 3 - 5 分钟，待珠子沉降至底部后，将洗涤缓冲液倾入另一容器中。
	<ol>
		<li>做 不 弃去用过的洗涤缓冲液。将用过的 Tris-HCl 洗涤缓冲液（30 ml）与用过的 CaCl₂ 洗涤缓冲液合并。2 步骤 4.5 中收集的溶液</li>
	</ol>
	</li>
	<li>沉淀未固定的 E. coli 通过离心汇集的CaCl2 并以3,200 × g离心20分钟收集步骤4.6中的Tris-HCl溶液。为测定固定化效率，按照步骤2.1所述方法计算沉淀中未包埋细胞的干重密度（gDCW/L）。</li>
	<li>将步骤 4.6 中洗涤后的珠子转移至一个离心管中。按照步骤 2.2 - 3.4，使用全部洗涤后的珠子代替细胞沉淀，检测 L-木酮糖的生物合成。</li>
</ol>
5. 固定化生物催化剂生产L-木酮糖的稳定性测定
<ol>
	<li>收集步骤 4.8 中的珠子，并用 10 ml&#160;不含离心步骤的 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液洗涤两次（如步骤 4.6 所述）。</li>
	<li>使用全部洗涤后的珠子，按照步骤 2.2 - 3.4 所述进行反应。</li>
	<li>根据需要重复步骤 5.1 -&#160;5.2 的生产循环次数，并测定每个循环中反应上清液中产生的 L-木酮糖的量。</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。本文旨在报告一种固定于海藻酸盐微球中的偶联全细胞生物催化系统的详细制备方法。相关科学创新已在先前的研究中报道16。

近年来的技术进步推动了重组生物治疗药物的商业化进程，导致其在生物技术产业中的市场价值逐步上升。其中一项重要进展是重组微生物中代谢工程的应用，该技术在建立可放大的工业系统方面展现出巨大潜力38。与大多数工艺类似，由基因工程微生物生产的重组生物分子能否成功实现商业化，在很大程度上取决于系统的生产产量39。这促使了“&#34; brute force &#34;”遗传学方法的快速发展39，其中通过定向进化生物催化酶以提高生物催化剂活性3。然而，对于某些代谢途径（如氧化还原途径），仅提升生物催化剂性能并不足以实现生产过程的经济化，因为其他关键反应条件（例如昂贵的辅因子）具有显著影响。即使使用了性能改善的生物催化剂，此类系统的放大生产仍会导致生产成本增加。因此，针对涉及辅因子化学计量比的生物反应，需要采用额外的战略性方法来实现商业化。此外，生物催化剂的可重复使用性对于提高生物工艺的经济可行性也至关重要。为克服辅因子快速消耗以及全细胞生物催化剂重复使用性差的限制，我们此前已开发出一种固定化的耦合全细胞生物催化系统，用于辅因子再生和稳定重复利用16</s...

利用微生物进行还原性全细胞生物转化已成为化学-酶法合成具有商业和治疗价值的生物分子的广泛应用方法1-3与使用分离酶相比，它具有多项优势，特别是能够省去成本高昂的下游纯化过程，并表现出更长的使用寿命4-7对于需要辅因子才能生成产物的生物催化途径，全细胞系统有可能提供 原位 通过添加廉价的电子供体共底物实现辅因子再生5,8,9然而，对于需要化学计量浓度的稀有或昂贵共底物的反应，这种能力会减弱10-13结合全细胞重复利用性差的问题，这阻碍了可扩展且连续化生产系统的建立。为了克服上述局限性，需要对依赖辅因子的全细胞生物转化系统进行战略性改造。特别是，协同作用的全细胞生物催化剂组合已被证明能显著提高所含酶的生产效率和稳定性14这些因素对于实现具有商业可行性的产品的大规模生产往往至关重要，而通过共固定化生物催化微生物可进一步优化这些条件。15我们最近开发了一种简单且可重复使用的全细胞生物催化系统，该系统可同时实现辅因子再生和生物催化剂固定化，用于L-木酮糖的生产16在本研究中，该系统被用作示例，以说明应用这两种策略提高生物转化产率和生物催化剂可重复使用性的实验步骤。
L-木酮糖属于一类名为稀有糖的生物有用分子。稀有糖是一类在自然界中极为罕见的独特单糖或糖类衍生物，但在生物活性分子中作为识别元件发挥着关键作用17,18它们具有多种应用，范围涵盖甜味剂、功能性食品到潜在的治疗剂19L-木酮糖可作为多种α-葡萄糖苷酶的潜在抑制剂，也可用作肝炎或肝硬化的指示标志物17,20. 已有文献报道，在全细胞体系中可高效将木糖醇转化为L-木酮糖 Pantoea ananatis21,22, 产碱菌属 sp. 701B23, Bacillus pallidus Y2524,25 和 大肠杆菌26。在 大肠杆菌， 然而，这仅在使用低（&#60;67 mM 木糖醇浓度26 由于初始木糖醇浓度高于100 mM可能对木糖醇-4-脱氢酶活性产生抑制作用21,26木酮糖与木糖醇之间的热力学平衡强烈倾向于生成木糖醇25,27此外，木酮糖的产量受限于在缺乏某种条件时需添加的昂贵辅因子的用量 在 原位 辅因子再生系统。这些因素共同限制了L-木酮糖生物合成向可持续体系放大的潜力。
为了克服这些局限性并提高L-木酮糖的生物转化产率，首先采用辅因子再生策略，构建了偶联的全细胞生物催化系统。具体而言，选用了来自Hypocrea jecorina（HjLAD）的L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶（EC 1.1.1.12），该酶是真菌L-阿拉伯糖分解代谢途径中的一种酶，可催化L-阿拉伯糖醇转化为L-木酮糖28,29。与许多生物合成酶类似，HjLAD的主要局限在于其催化反应需要化学计量比的昂贵辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+，即NADH的氧化形式）。来自Streptococcus pyogenes（SpNox）的NADH氧化酶已被证明具有高效的辅因子再生能力30,31。利用SpNox的这一特性，将表达HjLAD的E. coli细胞（用于生产L-木酮糖）与表达SpNox的E. coli细胞（用于再生NAD+）进行偶联，从而通过图1A所示的偶联反应显著提高L-木酮糖的产量。在最优条件下，使用初始浓度为150 mM的L-阿拉伯糖醇，L-木酮糖的最大产率可达96%，使该系统效率显著高于文献报道的其他系统。
接下来采用全细胞固定化策略，以进一步提高偶联生物催化系统的可重复使用性。常用的全细胞固定化方法包括吸附/共价连接至固相载体、交联/包埋以及在聚合物网络中的封装32。在这些方法中，最适合细胞固定化的是海藻酸钙微球封装法。其温和的凝胶化特性、惰性的水相基质以及高孔隙率有助于保持被封装生物材料的生理特性和功能活性33。因此，将含有携带HjLAD或SpNox的E. coli细胞的偶联生物催化系统固定化于海藻酸钙微球中，以实现L-木酮糖的多批次生产（图2）。该固定化生物催化系统表现出良好的操作稳定性，在连续重复使用7个循环后，仍能保持第一个循环转化率的65%，而游离细胞系统则几乎完全丧失了催化活性。

<table><tbody><tr><td>LB 肉汤&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022-6X1KG</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Fisher</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>异丙基-&amp;beta;-D-硫代半乳糖苷（IPTG）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6758-10G</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Fisher</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水合物</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N7004-1G</td><td></td></tr><tr><td>L-阿拉伯糖醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3506-10G</td><td></td></tr><tr><td>L-半胱氨酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>168149</td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320501-500ML</td><td></td></tr><tr><td>咔唑</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5132</td><td></td></tr><tr><td>乙醇&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>BP2818-4</td><td></td></tr><tr><td>海藻酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W201502</td><td></td></tr><tr><td>二水氯化钙</td><td>Sigma Aldrich</td><td>223506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Excella E24 摇床培养箱</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cary 60 紫外-可见分光光度计</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R 离心机</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>烧杯</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>针头</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pioneer 分析与精密电子天平</td><td>Ohaus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

海藻酸钙微珠中多酶共固定化用于辅因子再生及提高重复使用性

Immobilization of Multi-biocatalysts in Alginate Beads for Cofactor Regeneration and Improved Reusability

我们近期开发了一种简单、可重复使用且耦合的全细胞生物催化系统，该系统具备辅因子再生和生物催化剂固定化的能力，可提高产物产率并实现持续合成。本文详细描述了此类系统的实验构建方法，该系统由两种表达功能互补酶的 E. coli 菌株组成。这两种酶可协同作用，介导昂贵辅因子的再生，从而提高生物反应的产物产率。此外，本文还报道了通过将全细胞包埋于海藻酸钙微球中，制备固定化耦合生物催化系统的方法。作为示例，我们展示了通过耦合表达L-阿拉伯糖醇脱氢酶或NADH氧化酶的 E. coli 细胞，实现由L-阿拉伯糖醇高效生物合成L-木酮糖的过程。在最优条件下，使用150 mM初始浓度的L-阿拉伯糖醇，L-木酮糖的最大产率可达96%，高于文献报道的水平。固定化的耦合全细胞生物催化剂表现出良好的操作稳定性，在连续重复使用7个循环后，仍能保持第一个循环产率的65%；而游离细胞系统则几乎完全丧失催化活性。因此，本文所报道的方法提供了两种策略，不仅有助于提升L-木酮糖的工业化生产水平，也可广泛应用于其他依赖辅因子的高附加值化合物的生产。

为了实现辅因子再生，采用包含E. coliHjLAD和E. coliSpNox细胞的偶联全细胞生物催化系统进行L-木酮糖的合成。在优化各项参数后，通过将该系统固定于海藻酸钙小球中，提高了其可重复使用性（图2）。
通过偶联 E. coliHjLAD 和 E. coliSpNox 细胞实现辅因子再生以生产 L-木酮糖。<...

本文介绍了共固定化全细胞生物催化剂以实现辅因子再生并提高其可重复利用性的实验方案，以L-木酮糖的生产为例。通过偶联两种表达功能互补酶的Escherichia coli菌株实现辅因子再生；全细胞生物催化剂的固定化则通过将细胞包埋于海藻酸钙小球中完成。

我们最近开发了一种简单、可重复使用且耦合的全细胞生物催化系统，具有辅因子再生和生物催化剂循环利用的能力……

本实验方案的总体目标是展示一种将偶联的全细胞生物催化体系固定化于海藻酸盐微球中，以提高产物产率和可重复使用性的方法。这是我的研究方向，我已在生物催化领域回答了若干关键问题，包括生物催化剂的固定化、稳定性、辅因子再生以及全细胞生物催化剂的应用。该技术的主要优势在于，为通过依赖辅因子的代谢途径高效生产多种重要生物分子提供了一种简单而灵活的策略。本方案中使用两种重组大肠杆菌菌株：表达NADH氧化酶的SpNOx大肠杆菌，以及表达L-阿拉伯糖醇脱氢酶的HjLAD大肠杆菌。由于两种大肠杆菌菌株的操作步骤相同，以下仅以HjLAD大肠杆菌为例进行演示。挑取单个 HjLAD E coli 菌落接种于 3 毫升 LB 培养基中，培养基中添加 15 微克/毫升的 Ket-A-My-Sin，在摇床培养箱中过夜培养。次日，将菌液按 1:100 的比例稀释至 200 毫升含 15 微克/毫升 Ket-A-My-Sin 的新鲜 LB 培养基中，于 37 摄氏度、250 RPM 条件下培养，直至 OD 600 达到约 0.6。向培养基中加入 0.1 毫摩尔的 IPTG 以诱导 HjLAD 蛋白表达，并在 25 摄氏度、200 RPM 条件下继续培养 6 小时。在4 ℃条件下，以3200 × g离心20分钟收集诱导后的细胞。弃去上清液，并按照下一节所示方法处理细胞沉淀。开始本操作时，分别将HjLAD大肠杆菌和SpNox大肠杆菌的细胞沉淀悬浮于50 mmol/L Tris-HCl缓冲液中，细胞密度为每升5克干重细胞。在14毫升圆底试管中，加入600微升浓度为每升5克干菌重的HjLAD大肠杆菌、600微升浓度为每升5克干菌重的SpNOx大肠杆菌、100微升20毫摩尔NAD+，以及150微升2摩尔L-阿拉伯醇。加入550微升50毫摩尔Tris-HCl，将反应体系补足至2毫升。将反应混合物于30摄氏度、200转/分钟条件下孵育8小时。孵育8小时后，在4°C、3200 × g条件下离心10分钟，收集反应上清液。为通过比色法测定L-木酮糖的生成量，取100 µL收集的上清液加入1.5 mL离心管中。依次加入50 µL 1.5%半胱氨酸溶液、900 µL 70%硫酸溶液和50 µL溶于乙醇的0.1%卡巴匹林（Kar-Piz-All），轻轻翻转管子3次以混匀。将反应混合物在37摄氏度、200转/分钟条件下孵育20分钟。使用分光光度计在560纳米处测定反应混合物的光吸收值。通过配制4%的海藻酸钠溶液开始固定化实验步骤。将0.8克海藻酸钠加入20毫升蒸馏水中，加热使海藻酸钠溶解。向1.2毫升4%海藻酸钠溶液中加入600微升每升5克干菌体重量的HjLAD大肠杆菌和600微升每升5克干菌体重量的SpNOx大肠杆菌。轻轻吹打混匀细胞与海藻酸钠溶液，避免产生气泡。为确保形成大小均匀、形态一致且硬度适中的海藻酸盐微球，必须将细胞-海藻酸盐悬浮液缓慢地以逐滴方式加入足量的氯化钙溶液中，滴加高度需保持适当，并确保溶液足以浸没所有微球。用注射器配合针头吸取细胞-海藻酸盐悬浮液，然后在持续搅拌条件下逐滴加入盛有100毫升0.3摩尔氯化钙溶液的烧杯中。将微球置于氯化钙溶液中，在室温下静置2至3小时，不进行搅拌，以使交联反应充分进行。小心地将氯化钙溶液倒入15毫升锥形管中，使小球沉淀不被扰动，从而分离上清液。将剩余的小球转移至另一个50毫升锥形管中。为去除过量的氯化钙和未包埋的细胞，用50毫摩尔/升的Tris-HCl缓冲液洗涤小球。向珠子中加入 10 毫升缓冲液，静置三到五分钟。待珠子沉降至底部后，将缓冲液倾倒至另一个容器中。以此方式洗涤珠子三次。在任何步骤中均不得离心珠子，否则珠子会破裂。不要丢弃使用过的 Tris-HCl 洗涤缓冲液。将之前收集的使用过的氯化钙溶液与 30 毫升使用过的洗涤缓冲液一并吸取。通过在3200 × g 条件下离心20分钟，沉淀未固定的 E. coli 细胞，离心对象为已吸取的氯化钙和Tris-HCl溶液。将洗涤后的珠子转移至一支离心管中。随后，按照细胞沉淀所用的相同步骤检测L-木酮糖的生物合成，但以全部洗涤后的珠子替代细胞沉淀。为了评估用于L-木酮糖生产的固定化生物催化剂的稳定性，需在凝胶珠形成后将其收集，并按照之前所述方法，用10毫升50毫摩尔Tris-HCl缓冲液洗涤两次，且不进行离心。将所有洗涤后的凝胶珠用于进行L-木酮糖生产的反应，操作方法如前所述。通过比色法测定L-木酮糖的产量，方法如前所述。针对所需的生产周期重复L-木酮糖生成反应，并测定每个周期反应上清液中产生的L-木酮糖量。该偶联的全细胞生物催化系统可提高L-木酮糖的产量。以150毫摩尔/升L-阿拉伯糖醇为初始浓度，单独使用HjLAD大肠杆菌生物催化剂可产生79%的L-木酮糖产率。相比之下，使用HjLAD大肠杆菌和SpNOx大肠杆菌细胞以1:1比例组合时，L-木酮糖产率达到96%。对影响生物催化剂固定化效率的参数进行评估后发现，在1%至3%范围内，随着海藻酸钠浓度的增加，固定化效率也随之提高。然而，海藻酸钠浓度高于2%会导致L-木酮糖产率下降。使用2%的海藻酸钠浓度时，确定用于固定化和L-木酮糖产率的最佳氯化钙浓度为0.3摩尔。对生物催化剂的可重复使用性进行了评估。在此图中，固定化偶联全细胞生物催化剂和游离偶联全细胞生物催化剂在连续重复使用七轮过程中的L-木酮糖产量分别以深灰色和浅灰色表示。尽管固定化偶联全细胞生物催化剂达到的最大L-木酮糖产率低于游离偶联全细胞系统，但固定化显著提高了其可重复使用性。在连续重复使用七轮后，固定化生物催化剂仍保持稳定，并保留了原始L-木酮糖产率的65%。该技术发展之后，为生物催化领域的研究人员探索全细胞生物催化剂的产率以及涉及辅因子的主要反应铺平了道路。

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