Name: 聚糖节点分析:自下而上的方法，以糖原组学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: 学习自下而上的糖原组学方法，通过GC-MS检测分析生物流体中的聚糖特征。该技术将复杂的糖链结构分解为单糖信号，有助于识别疾病状态下的聚糖改变，为癌症早期检测提供新的分析工具。

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本工作得到了亚利桑那州立大学文理学院为CRB提供的实验室启动资金支持。同时，本研究还获得了弗林基金会（Flinn Foundation）资助（资助号：1977）以及美国国立卫生研究院国家癌症研究所的资助（资助号：R33CA191110）。JA得到了美国国立卫生研究院普通医学科学研究所的本科后研究教育项目（PREP）的资助（资助号：R25GM071798）。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

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作者无任何利益冲突需要披露。

通常，由己糖成功制备部分甲基化醛糖醇乙酸酯（PMAAs）所面临的困难较少，且方法更为稳健，相较于成功制备 N-N-乙酰基己糖胺（HexNAc）PMAAs。该现象在本实验流程的每一步骤中所涉及的确切机制尚不明确，但必然与独特的化学性质相关 N乙酰基（而非羟基），这是与己糖相比，己糖胺（HexNAcs）所特有的基团。该现象在酸水解中的作用机制已在其他文献中加以阐述。43 总之，其能力在于 N甲基乙酰胺基在酸水解过程中带正电荷，使得糖苷键对酸水解具有抗性。这解释了上述分析中N-乙酰己糖胺（HexNAc）相对于己糖的产量较低（占总HexNAc与己糖信号的11.3%，而非50%）的原因。 N-N-乙酰乳糖胺。值得注意的是，尽管HexNAc的产率相对较低，但在复杂的生物流体和组织中仍不难检测，也不会妨碍对来源于大型复杂聚糖的聚糖节点进行便捷检测。例如2,4-甘露糖、2,6-甘露糖、3,4,6-甘露糖和3,4-氨基葡萄糖 图2).33 鉴于聚糖节点的XIC峰面积归一化方式（步骤6.3）...

糖脂、糖蛋白、蛋白聚糖和氨基聚糖构成了四类主要的复杂且具有异质性的碳水化合物，统称为聚糖。作为细胞质膜、糖萼以及细胞外基质和体液中普遍存在且不可或缺的组分，聚糖参与多种多样的生物化学过程，包括内吞作用、细胞内转运、细胞运动、信号转导、分子识别、受体激活、细胞黏附、宿主-病原体相互作用、细胞间通讯、免疫监视以及免疫应答的启动1。在几乎所有生命领域中均存在一类被称为糖基转移酶的酶，它们通过与糖苷水解酶（也称为糖苷酶，负责降解聚糖）协同作用，构建、重塑并最终生成成熟的聚糖聚合物2。尽管每种糖基转移酶可能作用于不同的糖缀合物，但通常情况下，糖基转移酶通过将特定活化核苷酸糖供体（例如，GDP-岩藻糖）中的单糖部分转移至某一类亲核受体（例如，脂质、多肽、核酸或正在延伸的寡糖链）上，形成具有特定连接方式和异头构型的糖苷键。据估计，超过50%的蛋白质（尤其是膜蛋白和分泌蛋白）在翻译后会经历糖基化修饰3。初步的组合计算有助于理解糖基化赋予糖蛋白的高度变异性、多功能性和特异性；例如，若一个多肽底物仅有10个糖基化位点，且每个位点均可与3种不同单糖还原端中的任意一种形成糖苷键，则理论上最终的糖蛋白可呈现310 = 59,049种不同的结构形式。在糖蛋白中，糖苷键通常与Asn-X-Ser/Thr序列中天冬酰胺残基侧链上的氮原子相连，形成N-聚糖2，或与丝氨酸和苏氨酸残基侧链上的羟基相连，形成O-聚糖4。一个细胞的糖组（即其全部糖基化产物的集合）具有独特性并受到限制，因为除少数例外情况外，糖基转移酶对供体、受体及连接方式均表现出严格的特异性5。许多病理状态，尤其是癌症和炎症性疾病，会导致糖基转移酶的表达和活性异常，进而引起重要且丰富的血浆糖蛋白发生异常糖基化6–24
主要由于表观遗传因素，糖组（glycome）的多样性、动态性和复杂性显著高于蛋白质组和转录组。25,26 尽管哺乳动物基因组中仅有约1%的基因参与糖链的形成、修饰和组装过程，27 糖基化过程并不依赖模板进行，这与多肽和核酸的生物合成有明显区别。糖基化酶的相对数量与活性，以及营养物质和前体物质的可获得性等环境因素之间的相互作用，最终决定了糖基化的性质、速率和程度。5,28 胚胎发生（例如，细胞命运决定与分化）、细胞活化以及细胞周期的进程均会影响基因表达（即转录与翻译），从而改变可用糖基转移酶的种类和数量，而这些酶的活性是决定细胞糖链谱型的直接上游因素。由于癌细胞的某些增殖、黏附和侵袭特性与普通胚胎细胞相似，糖链生物合成通路中的特定改变（例如，前体物质积累、表达失调、异常修饰、结构截短或新结构生成）可作为通用的癌症生物标志物，用于指示肿瘤发生、发展、迁移和侵袭的不同阶段。29 尽管糖基化过程极为复杂，但显然仅有少数几项糖基化改变即可促进癌变和转移；某些&#34;异常&#34;糖基化产物确实有助于癌细胞逃避免疫识别，并在不利的血管内及转移环境中适应迁移需求而存活下来。28,30,31 不足为奇的是，实验已表明，干扰或阻止异常的基因表达模式和异常糖链的形成，能够抑制肿瘤发生。29 然而，在生物流体样本（例如，尿液、唾液、血浆或血清）中检测到的异常糖链可能并非癌症（或其他疾病）的直接指标，而更可能是免疫系统发生细微但显著变化的下游结果，或是某一不可预测器官中恶性病变所导致的可量化后果。32
尽管基于分子相互作用的糖组学技术（例如凝集素/抗体芯片以及代谢/共价标记）能够提供有关糖组的普遍信息，但这些方法依赖于对完整糖链结构的检测，无法提供关于单个糖链的详细结构信息。相比之下，质谱法（MS）能够帮助鉴定和定量单个糖链结构，并揭示其与多肽核心的连接位点等结构信息。单一糖基转移酶的表达或活性失调即可在多个糖基化通路中引发一系列有害的分子事件。由于每种糖基转移酶可能作用于多种糖缀合物底物，并参与不同生长中糖链聚合物的合成，因此失调的生物合成级联反应会导致某一种糖链产物异常大量增加，同时在细胞内或细胞外液体中产生多种异质性的异常糖链33。然而，由于与大量正常调控的糖链相比，这些独特的异常糖链仅占极小比例，即使使用高灵敏度的质谱技术也常常难以检测，因此它们有时被认为不适合作为癌症或其他糖链相关疾病的生物标志物。例如，在细胞内和细胞外体液中，蛋白质浓度范围极广（跨越八个数量级），高丰度蛋白可能掩盖低丰度糖蛋白，从而阻碍其检测32。此外，测定糖基转移酶活性仍面临重大的实践与理论挑战，因为许多糖基转移酶在临床体液中缺失，或在体外（ex vivo）失去活性。尽管持续检测和定量极微量的独特完整糖链存在困难，质谱技术的研究人员已在将完整糖链用作临床标志物方面取得了巨大进展。我们近期开发了一种分析完整糖链的互补方法，该方法利用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS），可检测赋予每种糖链独特性的所有组成分支点及连接特异性单糖（&#34;糖链节点&#34;），这些单糖在许多情况下可直接作为分子替代物，用于量化致病糖基转移酶的相对活性。
自1958年首次报道将气相色谱法（GC）直接应用于聚糖分析以来，该技术已被证明是分析全甲基化单糖和二糖的有力手段34，可用于确定其异头构型和绝对构型，并实现分离以进行后续质谱分析35。1984年至2007年间，Ciucanu及其同事开发并优化了一种基于固相的聚糖全甲基化技术，该方法采用氢氧化钠和碘甲烷，随后通过水和氯仿进行液-液萃取以分离全甲基化的聚糖35,36。2005年至2008年间，Kang及其合作者在全甲基化步骤中引入了一种节省时间的离心柱方法37,38。2008年，Goetz研究组设计了一种基于基质辅助激光解吸电离（MALDI）质谱的定量固相全甲基化聚糖谱型分析方法，用于比较并可能区分侵袭性和非侵袭性乳腺癌细胞39；随后在2009年，Goetz团队结合酶法与化学释放技术，在强碱性固相全甲基化体系中从完整糖蛋白上裂解O-聚糖40。尽管Goetz方法实现了O-聚糖的同时全甲基化与化学释放，但其仅适用于预先分离的糖蛋白。我们在2013年对该技术进行了改进，并通过引入三氟乙酸（TFA）水解、还原和乙酰化步骤，将其适配于未经分级的完整生物流体及匀浆组织样本33。这些额外步骤还可从糖脂以及糖蛋白的N-连接聚糖中释放聚糖，并将其转化为部分甲基化的醛糖醇乙酸酯（PMAAs，图1），其特有的甲基化与乙酰化模式有助于通过GC-MS进行分析，并可独特表征原始完整聚糖聚合物中的各个聚糖结构单元41（图2）33。最终，该方法能够基于对独特聚糖特征（如&#34;核心岩藻糖基化&#34;、&#34;6-唾液酸化&#34;、&#34;双分叉GlcNAc&#34;和&#34;β1-6分支&#34;）的直接相对定量，生成复杂生物流体中所有聚糖的综合图谱——每个特征均源自单一GC-MS色谱峰。本文进一步优化了全甲基化、乙酰化、分离和纯化步骤，并改进了相对定量方式。

<table><tbody><tr><td>氢氧化钠珠粒&amp;nbsp;</td><td>367176</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>20-40目，试剂级，纯度97%</td></tr><tr><td>0.9 ml 离心柱</td><td>69705</td><td>赛默飞世尔科技皮尔斯分公司&amp;nbsp;</td><td>包括&amp;nbsp; 塞子和聚乙烯筛板&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>GC-MS 自动进样瓶（硅烷化）*</td><td>C4000-9</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Target DP 高回收率小瓶，1.5&amp;nbsp;毫升，12&amp;nbsp;毫米 × 32&amp;nbsp;毫米，包含带聚四氟乙烯衬里的可穿刺瓶盖</td></tr><tr><td>1.5 ml 聚丙烯离心管</td><td>05-402-25</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>带卡扣盖的盖子</td></tr><tr><td>2 ml 聚丙烯试管</td><td>05-408-138</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>旋盖式瓶盖</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>D8418</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>分子生物学用生化试剂，试剂级 &gt;99.0%</td></tr><tr><td>碘甲烷&amp;nbsp;</td><td>I8507</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>含铜作为稳定剂，ReagentPlus 99%</td></tr><tr><td>乙腈</td><td>A955-4</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>Optima LC/MS</td></tr><tr><td>微型离心机</td><td>75002436：Sorvall Legend Micro 17 离心机</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>24 x 1.5/2.0 角转子，配备 ClickSeal 生物安全盖。转子目录号：75003424</td></tr><tr><td>13 x 100 玻璃试管（硅烷化）*</td><td>53283-800</td><td>VWR</td><td>13 mm × 100 mm 螺口螺帽硼硅酸盐玻璃试管</td></tr><tr><td>玻璃试管帽</td><td>14-930-15D</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>Kimble&amp;trade; 黑色酚醛螺旋盖；13&amp;nbsp;mm-415 GPI 螺纹；聚四氟乙烯覆面橡胶衬里</td></tr><tr><td>氯化钠&amp;nbsp;</td><td>S7653</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>&gt;99.5% 纯度</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>4440-08</td><td>Macron Fine Chemicals&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸&amp;nbsp;</td><td>299537</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>经重蒸馏纯化至99%，适用于蛋白质测序&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>硼氢化钠</td><td>71321</td><td>Fluka 分析&amp;nbsp;</td><td>99%</td></tr><tr><td>氨水溶液&amp;nbsp;</td><td>320145</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>NH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 28.0-30.0%</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>AH230-4</td><td>霍尼韦尔 伯迪克 &amp;和杰克逊</td><td>HPLC 级</td></tr><tr><td>乙酸&amp;nbsp;</td><td>320099</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>99.70%</td></tr><tr><td>塑料真空干燥器&amp;nbsp;</td><td>任何足够尺寸的模型</td><td>FoodSaver</td><td></td></tr><tr><td>乙酸酐&amp;nbsp;</td><td>539996</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>99.50%</td></tr><tr><td>二氯甲烷&amp;nbsp;</td><td>D143SK-4</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>稳定化HPLC级</td></tr><tr><td>丙酮&amp;nbsp;</td><td>9006-03</td><td>J.T.Baker</td><td>贝克分析&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>加热蒸发歧管（主装置）</td><td>pi18823</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>赛默飞世尔科技* Reacti-Therm* 加热搅拌模块；三孔加热搅拌型</td></tr><tr><td>加热蒸发装置（旋转蒸发仪）</td><td>pi18826</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>ThermoScientific* Reacti-Vap 浓缩仪，27 孔；配合三区 Reacti-Therm 加热模块使用</td></tr><tr><td>用于蒸发歧管的铝制样品支架块</td><td>pi18816</td><td>赛默飞世尔科技&amp;nbsp;</td><td>铝块，Reacti-Block S-1，可容纳13个&amp;nbsp;毫米直径试管，13 孔（14&amp;nbsp;毫米直径 × 45&amp;nbsp;毫米深）</td></tr><tr><td>气相色谱仪</td><td>Model A7890</td><td>安捷伦&amp;nbsp;</td><td>配备 CTC PAL 自动进样器</td></tr><tr><td>质谱仪&amp;nbsp;</td><td>GCT Premier（飞行时间）</td><td>沃特斯&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>分流模式衬管（去活化/硅烷化）</td><td>5183-4647</td><td>安捷伦</td><td>含一小团硅烷化玻璃棉</td></tr><tr><td>DB-5ms 气相色谱柱</td><td>122-5532</td><td>安捷伦</td><td>30 m × 0.25 mm 内径 × 0.25 微米膜厚</td></tr><tr><td>氯三甲基硅烷</td><td>95541</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>玻璃真空干燥器（用于玻璃器皿硅烷化）</td><td>EW-06536-30</td><td>Cole-Parmer</td><td>12&quot; 宽；230 毫米板尺寸</td></tr><tr><td colspan="4">玻璃器皿的硅烷化在大型玻璃真空干燥器中使用三甲基氯硅烷蒸气在内部完成，过夜进行。</td></tr></tbody></table>

聚糖节点分析：糖组学的自下而上方法

Glycan Node Analysis: A Bottom-up Approach to Glycomics

聚糖是由一类称为糖基转移酶的酶通过非模板驱动过程合成的，在多种重要的细胞内和细胞外事件中发挥关键作用。许多病理状态（尤其是癌症）会影响基因表达，进而导致糖苷水解酶和糖基转移酶的相对丰度及活性水平失调。由失调的糖基转移酶（或其组合）产生的独特异常完整聚糖，常以痕量形式存在于复杂的生物流体中，使其检测变得困难且有时具有随机性。然而，通过适当的样品制备，质谱技术中最古老的形式之一——气相色谱-质谱联用（GC-MS）——能够常规检测复杂生物流体中存在的分支点和连接特异性的单糖单元（“聚糖节点”）。与传统的自上而下式糖组学技术相辅相成，本文讨论的方法涉及将样品中每个组成单元的聚糖节点收集并浓缩为单一独立的分析信号，从而提供关于整体糖组变化的详细结构和定量信息，并揭示可能失调的糖基转移酶。本文所提供的甲基化修饰及后续液/液萃取步骤的改进，通过尽量减少全甲基化聚糖暴露于碱性水相条件的时间，提高了实验的重复性和总体产率。对乙酰化步骤的优化进一步提升了反应程度和总体产率。尽管该方法具有良好的重复性，但结果显示，N-乙酰己糖胺（HexNAc）部分甲基化醇乙酸酯（PMAA）的总体产率本质上仍低于其相对于己糖PMAA的理论预期值。通过计算每个单独的己糖PMAA（或HexNAc PMAA）在提取离子色谱图（XIC）中的峰面积与其对应所有己糖（或HexNAc）XIC峰面积总和的比值，可建立一种新的归一化方法，从而实现对样品中各个聚糖节点的相对定量。尽管该方法在当前的绝对检测限方面仍存在一定限制，但它显著加快了临床生物流体的分析速度，并作为传统自上而下式糖组学的补充手段展现出广阔的应用前景。

总离子流色谱图（TIC）显示了人血浆样本在正确完成全甲基化、水解、还原和乙酰化反应后的结果，同时展示了两个关键的全甲基化步骤操作不当时的情况，如图3所示。
相对于己糖的N-乙酰己糖胺绝对得率：
N-乙酰基己糖胺（HexNAc）的部分甲基化醇乙酸酯（PMAAs）产率通常低于己糖。43 为估算HexNAc相对于己糖的绝对产率，分析了六份每份10 µg的N-乙酰乳糖胺（一种Gal1-4GlcNAc二糖）溶于10 µl水中的样品。对末端半乳糖（t-Gal）和4-GlcNAc的总离子流（TIC）峰面积进行积分。4-GlcNAc占t-Gal与4-GlcNAc总量的百分比为11.3 ± 0.7%（标准误）。尽管HexNAc的产率具有可重复...

本文介绍了一种改进的自下而上糖组学技术，该技术通过将未分级生物流体中的糖链化学降解为其具有连接特异性的单糖组分，并利用气相色谱-质谱法（GC-MS）进行检测，从而分析糖链的总体组成谱型。该方法的潜在应用包括癌症及其他糖链相关疾病的早期诊断。

由称为糖基转移酶的酶通过非模板驱动过程合成，聚糖在多种重要的细胞内和细胞间……中起着关键作用

本实验的总体目标是在保留单糖组成和连接信息的前提下，完全降解生物样本中的所有聚糖，从而将特定的聚糖特征（如唾液酸化和双分叉N-乙酰氨基葡萄糖）简化为单一的分析信号。该方法有助于直接回答糖组学领域中的关键问题，例如在特定疾病状态下哪些独特的聚糖特征发生了改变。该技术的主要优势在于，可将疾病中常发生改变的聚糖特征（如 β1-6 分支和核心岩藻糖基化）浓缩为单一的分析信号，而非分散在多个完整的聚糖中。通常，采用该方法的研究人员常因对新甲基化后的聚糖处理不当，导致 N-乙酰半胱氨酸产率低下。样品制备时，首先将每种生物分析物各 9 微升转移至独立的 1.5 毫升离心管中。向每个样品中加入 1 µL 去离子水和 270 µL 高纯度 DMSO，然后通过涡旋剧烈混匀。样品制备完成后，按照文本方案中的描述组装载有氢氧化钠的离心柱。使用分析用注射器，向每种分析物中加入105 µL碘甲烷，并立即盖紧管盖。充分涡旋混匀样品。取之前制备好的离心柱，拔去塞子后于2,400 ×g离心15秒。弃去收集管和流出液后，重新插入柱塞，并将离心柱放入一组新的已标记对应分析物的收集管中。使用1000微升移液头将每种分析物溶液转移至相应的离心柱中。加入分析物溶液后，从200微升移液头尖端末端约两毫升处压紧，并将该尖端留在柱中作为搅拌器使用。每两到三分钟，用移液头尖端轻轻搅拌离心柱一次。11 分钟后，拔下层析柱并以 2,400 ×g 离心 15 秒。立即取出离心柱，放入新的收集管中，保留穿流液但弃去柱塞。向柱中加入 300 µL 乙腈，然后以 9,600 ×g 离心 30 秒。现在将第一次完全甲基化后的穿流液转移至含有 3.5 mL 磷酸钠缓冲液的硅烷化玻璃试管中。确保转移的上清液澄清，且未转移任何固体物质。塑料管底部会形成少量白色沉淀。避免转移任何明显的固体物质，否则将导致N-乙酰半胱氨酸-葡萄糖胺糖链的得率降低。所有样品转移完成后，立即对批次中的每个样品进行涡旋振荡。然后将乙腈穿流液与各试管中剩余的液体合并。此步骤中应避免转移任何固体白色残留物。盖上盖子，立即涡旋振荡混合溶液，然后进行下一个样品操作。在完全甲基化后，在通风橱内向每支试管中加入1.2毫升氯仿。随后盖紧试管，剧烈振荡混匀内容物。为分离各层，将溶液在 3,000 Gs 条件下短暂离心。使用移液管吸出并弃去大部分上层水相，保留约 3 毫升的液体。加入 3.5 毫升 0.2 摩尔磷酸钠缓冲液，然后盖紧试管，混匀并离心。此液-液萃取步骤共重复三次。最后一次提取时，保留约一毫升水相。现在使用洁净的硅化巴斯德移液管，按照文本方案中的描述，小心地将氯仿相转移至洁净且已标记的硅化玻璃试管中。在预热至75摄氏度的蒸发装置中，用温和的氮气流干燥样品。确保气体流速足以扰动液体表面，但不会引起飞溅。待样品完全干燥后，即可进行水解。向每个样品中加入325微升2摩尔的三氟乙酸（TFA），充分混匀。在向所有样品中添加试剂后，应立即盖紧每个样品管，以防止在后续加热步骤中三氟乙酸（TFA）挥发和样品损失。将样品在121摄氏度下孵育两小时，以水解糖链。在样品孵育期间，再次准备75摄氏度的蒸发仪。孵育后，在蒸发多联管中用稳定的氮气流吹干样品。需频繁检查样品，确保以最短的干燥时间完成干燥。向每个样品中加入475微升浓度为10克/升的硼氢化钠溶液。然后充分混匀样品以溶解任何残留物。盖上试管盖，使还原反应继续进行一小时。接着，向每个样品中加入63 µL甲醇。在氮气环境下，于75摄氏度混合并干燥样品。向每个样品中加入125 µL甲醇-乙酸溶液。再次在氮气环境下，于75摄氏度混合并干燥样品。将样品置于真空条件下20分钟，确保其完全干燥。干燥后，向每个样品中加入18 µL去离子水。然后短暂离心样品，并充分混匀以溶解任何沉淀物。接下来，向每个试管中加入 250 µL 乙酸酐。盖紧试管，充分涡旋混匀，并将样品置于水浴中超声处理 2 分钟，以确保残留物完全溶解。然后在 50 °C 下孵育样品 10 分钟。向每个样品中加入230 µL浓TFA。盖上盖子并混匀样品后，在50 °C内部温度下孵育10分钟。向每个样品中加入1.8 mL二氯甲烷，并充分混匀。接下来，向试管中加入 2 mL 去离子水，进行两次液-液萃取。使用硅烷化巴斯德移液管头收集二氯甲烷层。转移至自动进样瓶中，然后在 74 °C 下用氮气吹干样品。在进行气相色谱-质谱分析之前，每份样品分别加入120微升丙酮，盖紧并充分混匀。在分流模式下，使用自动进样器将每份样品各1微升注入气相色谱分流衬管中。对于飞行时间质谱仪，建议采用40:1的分流比，并以0.8毫升/分钟的恒定流速通入氦气。使用两步梯度升温至325摄氏度分析样品。对流出的样品组分进行电子轰击电离。对于飞行时间质谱分析器，以0.1秒脉冲累积速率分析质荷比（M/Z）为40至800的碎片。为了证明本方案的灵敏度，对一份生物样品进行了仔细处理。所得色谱图在目标产物峰之间呈现出足够的强度，便于进行比较和分析。随后，采用相同步骤对同一样品起始的生物样品进行了处理。但将过甲基化溶液通过NAOH柱离心后，其中的白色残留物被带入后续的液/液萃取混合物中。色谱图显示出相同关键样品产物的峰强度比例不同。直接比较时，差异显著。第二张色谱图中4位连接的N-乙酰葡萄糖胺峰明显降低，是甲基化不完全及提取失败的一个可识别特征。为了体现该方法在检测疾病状态下聚糖组成差异方面的实用性，将正常人血浆样本与癌症患者血浆样本的提取离子色谱图针对2-连接的甘露糖进行归一化处理后叠加。诸如β-1,6分支以及唾液酸化不足等特异性聚糖结构的定量差异清晰可见。观看本视频后，您应能充分理解如何开展自下而上的糖组学糖链节点分析，从而将复杂的糖链特征（如核心岩藻糖基化、唾液酸化及双分叉糖链结构）有效转化为单一的分析信号。

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化学

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学习自下而上的糖原组学方法，通过GC-MS检测分析生物流体中的聚糖特征。该技术将复杂的糖链结构分解为单糖信号，有助于识别疾病状态下的聚糖改变，为癌症早期检测提供新的分析工具。

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