聚糖节点分析：糖组学的自下而上方法

本实验的总体目标是在保留单糖组成和连接信息的前提下，完全降解生物样品中的所有聚糖，从而将特定的聚糖特征（如唾液酸化和双分叉 N-乙酰氨基葡萄糖）简化为单一的分析信号。该方法有助于直接回答糖组学领域中的关键问题，例如在特定疾病状态下哪些独特的聚糖特征发生了改变。

该技术的主要优势在于，疾病中常发生改变的聚糖特征（如β1-6分支和核心岩藻糖基化）被浓缩为单一的分析信号，而非分散在多个完整的聚糖中。通常，操作者在采用该方法时会因对新近完全甲基化的聚糖处理不当，导致N-乙酰半胱氨酸产率较低而面临困难。样品制备时，首先将每种生物分析物各9微升转移至不同的1.5毫升离心管中。

向每个样品中加入 1 µL 去离子水和 270 µL 高纯度 DMSO，然后通过涡旋剧烈混匀。样品制备完成后，按照文本方案中的描述组装载有氢氧化钠的离心柱。

使用分析用注射器，向每种分析物中加入105 µL碘甲烷，并立即盖紧管盖。充分涡旋混匀样品。取之前制备好的离心柱，拔下塞子后于2,400 ×g离心15秒。弃去收集管及流出液后，重新插上塞子，将离心柱放入一组新的已标记对应分析物的收集管中。

使用1000微升移液头将每种分析物溶液转移至相应的离心柱中。加入分析物溶液后，从200微升移液头尖端末端约两毫升处压紧，并将该尖端留在柱中用作搅拌器。每两到三分钟，使用移液头尖端轻轻搅拌离心柱一次。

11 分钟后，拔下层析柱并以 2,400 ×g 离心 15 秒。立即取出离心柱，放入新的收集管中，保留穿流液但弃去柱塞。向柱中加入 300 µL 乙腈，以 9,600 ×g 离心 30 秒。现在将第一次完全甲基化后的穿流液转移至含有 3.5 mL 磷酸钠缓冲液的硅烷化玻璃试管中。确保转移的上清液澄清，且未转移任何固体物质。

塑料管底部会形成少量白色沉淀。避免转移任何明显的固体物质，否则将导致N-乙酰半胱氨酸-葡萄糖胺糖链产物的得率降低。

在所有样品转移完成后，立即对批次中的每个样品进行涡旋振荡。然后将乙腈穿流液与各试管中剩余的液体合并。此步骤中应避免转移任何固体白色残留物。

在进行下一个样品操作前，立即盖紧、振荡并涡旋混合已合并的溶液。在完全甲基化后，在通风橱内向每支试管中加入1.2毫升氯仿。然后盖紧试管，剧烈混合内容物。

为分离各层，将溶液在 3,000 G 下短暂离心。使用移液管吸出并弃去大部分上层水相，保留约 3 毫升的液体。加入 3.5 毫升 0.2 摩尔磷酸钠缓冲液，然后盖紧试管，混匀并离心。此液-液萃取步骤共进行三次。

最后一次提取时，保留约一毫升水相。然后按照文本方案所述，使用洁净的硅化巴斯德移液管头，小心地将氯仿相转移至洁净且已标记的硅化玻璃试管中。在预热至75摄氏度的蒸发装置中，用温和的氮气流干燥样品。

确保气流扰动液体表面，但不要引起飞溅。样品干燥后，即可进行水解。向每个样品中加入325 µL的2 M三氟乙酸（TFA），并充分混匀。

在向所有样品中添加试剂后，应立即盖紧每个样品管，以防止在后续加热步骤中三氟乙酸（TFA）挥发和样品损失。将样品在121摄氏度下孵育两小时，以水解糖链。在样品孵育的同时，再次准备75摄氏度的蒸发浓缩仪。

孵育后，在蒸发装置中用稳定的氮气流吹干样品。需频繁检查样品，确保以最短的干燥时间完成干燥。向每个样品中加入475 µL浓度为10 g/L的硼氢化钠溶液。

然后充分混匀样品，以溶解任何残留物。盖紧试管，使还原反应继续进行一小时。接着，向每个样品中加入 63 µL 甲醇。

在氮气环境下，于75摄氏度混合并干燥样品。向每个样品中加入125 µL甲醇-乙酸溶液。再次在氮气环境下，于75摄氏度混合并干燥样品。

将样品置于真空条件下20分钟，确保其完全干燥。干燥后，向每个样品中加入18 µL去离子水。然后短暂离心样品，并充分混匀以溶解任何沉淀物。

接下来，向每支试管中加入 250 µL 乙酸酐。盖紧试管，充分涡旋混匀，并将样品置于水浴中超声处理 2 分钟，以确保残留物完全溶解。然后在 50 °C 下孵育样品 10 分钟。

向每个样品中加入230 µL浓TFA。盖上盖子并混匀样品后，在50 °C内部温度下孵育10分钟。向每个样品中加入1.8 mL二氯甲烷，并充分混匀。

接下来，向试管中加入 2 mL 去离子水，并进行两次液-液萃取。使用硅烷化巴斯德移液管头收集二氯甲烷层。转移至自动进样瓶中，然后在 74 °C 下用氮气吹干样品。

在进行气相色谱-质谱分析之前，每份样品分别加入120微升丙酮，盖紧并充分混匀。在分流模式下，使用自动进样器将每份样品各1微升注入气相色谱分流衬管中。对于飞行时间质谱仪，建议采用40:1的分流比，并以0.8毫升/分钟的恒定流速通入氦气。

使用两步梯度程序分析样品，升温至325摄氏度。对流出的样品组分进行电子电离。对于飞行时间质谱分析器，以0.1秒的脉冲累积速率分析质荷比（M/Z）为40至800的碎片。

为了证明本方案的灵敏度，对一份生物样本进行了仔细处理。所得色谱图在目标产物峰之间呈现出足够的强度，便于进行比较和分析。随后，使用相同步骤对同一样本起始的生物样本进行了处理。

但将过甲基化溶液通过NAOH柱离心后，其中的白色残留物被带入后续的液/液萃取混合物中。色谱图显示出相同关键样品产物的峰强度比例不同。直接比较时，差异显著。

第二张色谱图中，4-位连接的N-乙酰葡萄糖胺峰明显降低，这是甲基化修饰和提取不成功的可识别特征。为了体现该方法在检测疾病状态下聚糖组成差异方面的实用性，将正常人血浆样本和癌症患者血浆样本的提取离子色谱图针对2-连接的甘露糖进行归一化处理并叠加。诸如β-1,6分支以及唾液酸化不足等特异性聚糖结构的定量差异清晰可见。

观看本视频后，您应能充分理解如何开展自下而上的糖组学糖链节点分析，从而将复杂的糖基化特征（如核心岩藻糖基化、唾液酸化及双分叉糖链结构）有效转化为单一的分析信号。