的气管内管理流感嗜血杆菌在小鼠模型来研究气道炎症
March 2nd, 2016
我们演示了将流感嗜血杆菌气管内接种到小鼠下呼吸道的程序。这是研究小鼠模型中调节气道炎症的信号通路的非常有用的工具。
本实验的总体目标是研究细菌感染期间肺部的免疫反应。这个问题可以帮助回答肺部炎症领域的一些关键问题，例如抑制或促进肺部炎症的关键调控机制和基因是什么。该技术的主要优点是它非常有效且具有高度可重复性，因为细菌接种物直接输送到下呼吸道。
首先，将 NTHi 装在巧克力琼脂盘上。将板倒置孵育过夜，在 37 摄氏度下加入 5% 二氧化碳。第二天，在脑心输液液中培养细菌。
然后，在微量离心管中加入 1 毫升肉汤。在室温下以 4， 000 g 的浓度离心混合物 5 分钟。然后，弃去上清液，将沉淀重悬于 1 毫升 PBS 中。
再重复一次此洗涤步骤。接下来，在 900 微升 PBS 中稀释 100 微升重悬溶液，并在 600 纳米处测量培养物的吸光度。使用此信息将接种物调整为每毫升 2000 万 CFU。
接下来，确定接种物的活力和 CFU。在巧克力琼脂平板上培养 1 到 10 个连续稀释的肉汤，并将平板孵育过夜。首先麻醉鼠标，然后使用脚趾捏验证它是否已充分麻醉。
然后，将鼠标仰卧放置并剃掉脖子的腹侧区域。对裸露的皮肤进行消毒。现在，用大鼠牙钳提起颈部上腹侧部分的皮肤，然后用手术刀在胸腺上方做一个半到一厘米的切口。
然后，小心地分离肌肉以露出气管。向气管中缓慢注入 50 微升空气，然后注入 50 微升准备好的 NTHi，然后再注入 50 微升空气。对于阴性对照程序，注射生理盐水而不是 NTHi。
注射后，保持动物垂直约一分钟。然后，用组织粘合剂闭合切口，让鼠标横向斜躺并温暖约 10 分钟。感染后 24 小时，对受感染的动物实施安乐死，并用解剖剪刀打开腹腔。
然后，切开腹主动脉以使动物放血。接下来，暴露肺的腹侧部分以进入气管。用 20 号导管插管气管。
使用导管滴入 0.8 毫升 BALF 缓冲液，并通过牙科抽吸收集灌洗液。再重复此过程 3 次，将四个灌洗收集物汇集成一个悬浮液。取 100 微升等分试样，以 2， 000 RPM 的速度离心 2 分钟。
去除上清液并重悬于 RBC 裂解缓冲液中。将其旋转并用 1x PBS 重悬沉淀。现在，使用血细胞计数器在台盼蓝染色的 10 倍放大倍率下计数 100 微升悬浮液中的细胞总数。
然后，准备载玻片对细胞进行染色。将 100 μL BALF 悬浮液分装到细胞离心涂片的相应孔中，并以 500 g 的离心力旋转载玻片 5 分钟。然后，在室温下干燥载玻片 10 分钟，并根据制造商的方案使用改良的 Giemsa 染色剂对细胞进行染色。
将剩余的细胞用于后续分析，例如事实、共聚焦显微镜等。从受感染的肺部收集灌洗液后，取一块 20-40 毫克的肺，在 4 摄氏度的 RNA 稳定试剂中孵育过夜，然后在 80 摄氏度下长期储存。准备好后，在冷 PBS 中洗涤肺组织样品以去除 RNA 稳定试剂。
然后，将组织放入含有 β 巯基乙醇裂解缓冲液的 1.5 mL离心管中。接下来，用小剪刀将组织切成块，并使用电动杵将碎片均质化 20-40 秒。将裂解物在冰上放置 5 分钟，然后以 18， 000 g 的浓度离心 3 分钟。
小心地去除上清液并将其转移到新管中。然后加入一体积的 70% 乙醇并研磨混合物。让混合物在 25 摄氏度下静置 2 到 4 分钟。
然后，将多达 700 μL 的样品转移到 2 ml 收集管上的离心柱中，并以 9600 g 离心柱 15 秒。弃去流出液，加入 350 微升洗涤缓冲液并重复离心。接下来，将膜与 80 μL DNase I 溶液在室温下孵育 15 分钟。
然后，向色谱柱中加入 350 μL 洗涤缓冲液并重复离心。接下来，加入 500 μL RNA 洗涤缓冲液。重复短时间旋转，丢弃流出液。
用 RNA 洗涤缓冲液进行两次洗涤。最后，通过新的收集管，直接向色谱柱中加入 30-50 μL 不含 RNase 的水，并旋转 1 分钟，以收集流出液中的 RNA 样品。该程序按照正常、健康小鼠的描述进行。
与生理盐水处理对照相比，气管内安装导致接种 NTHi 的小鼠支气管肺泡灌洗液中白细胞的数量显着增加。白细胞的差异计数分析清楚地显示中性粒细胞浸润增加。对 BALF 中细胞的事实分析进一步证实了中性粒细胞数量的增加。
肺组织的 HNE 染色切片显示气道炎症增加。总的来说，这些数据表明气管内安装会诱导小鼠的气道炎症。在突变小鼠和对照小鼠的类似实验中，通过全转录组测序分析肺组织 RNA。
与野生型对照相比，瘙痒缺乏导致多个基因的差异表达。Itch 被认为是炎症信号通路的调节因子，因此这一结果可用于促进新的研究。在整个开发过程中，这项技术为肺部疾病领域的研究人员探索肺部感染和炎症期间免疫细胞中的细胞信号传导铺平了道路。
在尝试此程序时，重要的是要记住在手术过程中采取额外的预防措施，例如暴露气管和将细菌安装到气管中。一旦掌握，可以在 10 分钟内完成气管内安装，并在 10-15 分钟内收集样品瓶液体。在此程序之后，可以执行 RNA 测序、流式细胞术和免疫阻断等其他事项来解决其他问题，例如哪些是上调或下调的基因。
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概览
本文展示了将流感嗜血杆菌接种到小鼠下呼吸道的程序。这一技术对于研究调节小鼠模型中气道炎症的信号通路具有重要价值。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 微生物学
背景
- 细菌感染期间肺部的免疫反应对于理解肺部炎症至关重要。
- 关键的调节机制和基因在促进或抑制肺部炎症中起着重要作用。
- 气管内接种允许直接将细菌接种物送达下呼吸道。
- 这种方法高效且高度可重复。
研究目的
- 研究细菌感染期间肺部的免疫反应。
- 识别参与肺部炎症的关键调节机制。
- 加深对影响肺部炎症的基因的理解。
使用的方法
- 在小鼠中进行流感嗜血杆菌的气管内接种。
- 在巧克力琼脂平板上培养NTHi进行细菌培养。
- 在37摄氏度、5%二氧化碳环境下孵化培养板。
- 在脑心输液肉汤中培养细菌。
主要结果
- 成功将流感嗜血杆菌接种到小鼠的下呼吸道。
- 建立了一个研究气道炎症的可重复模型。
- 对细菌感染期间的免疫反应机制有了新的认识。
- 识别了肺部炎症治疗干预的潜在目标。
结论
- 气管内接种技术对于研究肺部炎症是有效的。
- 这种方法可以帮助阐明免疫反应中的调节通路。
- 进一步的研究可以导致对肺部炎症性疾病的更好理解和治疗。
常见问题
Executive Industry Relevance
Direct intra-tracheal administration of Haemophilus influenzae in mouse models enables precise interrogation of airway inflammatory mechanisms, supporting target validation and mechanistic de-risking in respiratory disease research. This approach enhances predictive confidence by minimizing delivery ambiguity and maximizing reproducibility, positioning it as a critical inflection point for early discovery and translational pipeline continuity. The method's quantitative outputs and compatibility with downstream analyses facilitate robust portfolio triage and risk-adjusted advancement decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct testing of inflammatory hypotheses in a controlled, disease-relevant system.
- Supports functional validation of immune regulatory genes and pathways in vivo.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating airway-specific immune responses.
- Provides reproducible data for target confidence and early portfolio prioritization.
Screening & Assay Development
- Establishes a validated in vivo model for quantitative assessment of airway inflammation.
- Delivers standardized immune cell and gene expression readouts for assay development.
- Supports reproducibility and scalability for screening of anti-inflammatory interventions.
- Enables reliable evaluation of compound effects on airway immune responses.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant endpoints such as leukocyte infiltration and gene expression changes.
- Provides continuity from mechanistic discovery to preclinical biomarker validation.
- Enables risk-adjusted decisions for advancing respiratory disease candidates.
- Supports translational biomarker identification through RNA and immune cell analyses.
Pipeline & Workflow Integration
This intra-tracheal model integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging hypothesis-driven target validation with translational biomarker development in respiratory research.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of immune regulatory mechanisms and gene function in airway inflammation.
- Screening: Provides reproducible, quantitative immune cell and gene expression outputs for assay readiness.
- Analytics: Enables comparative analysis of inflammatory responses and gene expression profiles across experimental conditions.
- Translational Research: Connects mechanistic findings to preclinical biomarker and endpoint validation in disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, reusable platform for diverse respiratory pathogen and intervention studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in airway inflammation studies.
- Operational Value: Delivers high reproducibility, standardization, and efficient model establishment.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital allocation by providing robust in vivo data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of respiratory disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surgical techniques and animal handling for tracheal access.
- Needs access to instrumentation for cell counting, flow cytometry, and RNA analysis.
- Demands cross-team standardization of inoculum preparation and immune cell quantification.
- Adaptable to various pathogens and genetically modified mouse models for broader applicability.
- Careful procedural execution is critical to minimize variability and ensure data integrity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
Culturing Non-typeable Haemophilus influenzae (NTHi) and Preparing the Inoculum
2:14
Intra-tracheal (i.t.) Instillation
3:27
BALF (Broncho-alveolar Lavage Fluid) Collection
5:17
Homogenization of Lung Tissue and RNA Isolation
7:37
Results: BALF Analysis on NTHi Inoculated Mice
8:47
Conclusion
