调查Coronin A在早期饥饿反应中的作用粘菌通过聚集测定
2016年6月18日
社会变形虫 Dictyostelium disccoideum 在饥饿时经历发育转变为多细胞生物。进化上保守的蛋白冠蛋白 A 在发育的启动中起着至关重要的作用。使用聚集测定作为我们的主要方法，我们旨在阐明冠蛋白 A 在早期发育中的作用。
该实验程序的总体目标是研究盘状网柄菌 （Dictyostelium disccoideum） 的 Coronin-A 依赖性早期饥饿反应。这种方法可以帮助回答发育生物学领域的关键问题，例如识别参与盘基网柄菌早期发育的信号通路和因素。该技术的主要优点是它有可能为参与早期发育信号传导的发育诱导因子和蛋白质的自动化和高通量筛选提供一种工具。
通常，由于检测固有的多个变量，例如细胞密度、粘附时间和发育时间，刚接触这种方法的个体会很挣扎。要开始此程序，请在含有 HL-5 培养基的锥形瓶中，在 22 摄氏度的振荡培养箱中以 160 rpm 的速度培养 DH1.10 细胞或 corA 缺陷细胞。将细胞密度保持在每毫升 1 乘以 10 到 4 个细胞之间，以及每毫升 2 乘以 10 到 6 个细胞之间。
为了检查细胞聚集，收获 10 至 50 毫升对数期生长的 DH1.10 细胞或在 DH1.10 背景中产生的 corA 缺陷细胞。以 400 倍 g 离心 3 分钟。然后是 BSS 中的两次细胞。
然后用血细胞计数器计数细胞。随后，将细胞接种在 24 孔板中。让它们在 22 摄氏度的 BSS 中粘附 1 小时。
然后，用延时显微镜观察细胞聚集，并每 135 秒拍摄一次图像。为了检查外部施加的环状 AMP 脉冲对 DH1.10 细胞或 DH1.10 corA 缺陷细胞发育的影响，收获 10 至 50 毫升细胞并以 400 倍 g 离心 3 分钟。之后，在 BSS 中清洗两次。
使用血细胞计数器计数细胞。随后，在 BSS 中将细胞重悬至每毫升 7 个细胞的 1 倍 10 倍的密度。然后，在应用脉冲之前，将培养物在 22 摄氏度下以 160 rpm 摇动 2 小时。
接下来，使用定时器控制的蠕动泵施加循环 AMP 脉冲。对泵进行编程，使其在 5 小时内每 6 分半钟输送一次 5 秒的环状 AMP 脉冲。一个关键步骤是确保循环 AMP 进样的尖端不会连续浸没在溶液中，而只会周期性地浸没在摇床产生的波中。
环状 AMP 应用后，使用血细胞计数器再次计数细胞。然后，将细胞接种在 24 孔板中，并在 BSS 中粘附 1 小时。16 小时后，在 22 摄氏度下，使用 5 倍主观明场显微镜观察细胞聚集。
在此过程中，通过在 22 摄氏度下用 HL5 培养基从振荡培养物中收集对数期 DH1.10 细胞或 DH1.10 corA 缺陷细胞来制备新鲜的条件培养基。将细胞以 400 次 g 离心 3 分钟。之后，在 PBM 中洗涤 3 次。
随后，使用血细胞计数器对细胞进行计数，然后以 1 倍 10 的密度将它们重悬于 PBM 中，至每毫升 7 个细胞，并在 22 摄氏度下以 110 rpm 摇动 20 小时。接下来，将细胞以 400 x g 离心 3 分钟，然后收集条件培养基。然后，在 4 摄氏度下以 8， 000 x g 离心 15 分钟，澄清培养基。
然后，通过 0.45 微米过滤器过滤条件培养基，并在 PBM 中将其稀释三倍。使用血细胞计数器计数细胞，将它们接种在 24 孔板中，并让它们在 22 摄氏度下粘附 1 小时。接下来，将细胞的上清液与先前制备的条件培养基交换。
16 小时后，使用 5 倍主观用明场显微镜观察细胞聚集。在这里，缺乏 Coronin-A 的细胞在早期发育中表现出缺陷，并且无法形成多细胞聚集体，这是盘柄网柄菌发育周期的初始步骤。在该图中，营养型 Wild 和 corA 缺陷细胞被洗涤并饥饿 2 小时，然后每 6 分半钟用或不用 15 种动物或环状 AMP 脉冲，悬浮 5 小时。
应用外源性环状 AMP 脉冲，完全恢复了 Wild 型表型。在该图中，将指数生长的野生型和 corA 缺陷型细胞在 PBM 中洗涤，接种到多孔板中，并在从野生型或 corA 缺陷饥饿细胞获得的条件培养基中孵育。这些图像是在接种细胞后 16 小时拍摄的。
corA 缺陷的 Dictyostelium discoideum 能够产生发育诱导所需的所有因子，但无法对它们做出反应。一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在 20 小时内完成，包括孵育时间。在尝试此程序时，重要的是要记住，对于不同的菌株，需要调整测定的多个变量，例如细胞密度、粘附时间、发育时间。
在此程序之后，可以进行生化分级和随后的蛋白质组学分析，以确定参与盘状网柄菌早期饥饿反应的因素。看完这个视频后，人们应该对如何在水下条件下使用条件培养基和环状 AMP 脉冲诱导盘基网柄菌的早期发育有一个很好的了解。
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概览
本研究调查了coronin A在社会变形虫Dictyostelium discoideum早期饥饿反应中的作用。研究旨在阐明生物在饥饿期间向多细胞转变过程中涉及的信号通路。
关键研究组成部分
科学领域
- 发育生物学
- 细胞生物学
- 微生物学
背景
- Dictyostelium discoideum是研究细胞发育的模式生物。
- Coronin A是一种进化保守的蛋白，对发育启动至关重要。
- 该生物在饥饿条件下经历从单细胞到多细胞形式的显著转变。
- 理解这一过程可以提供有关发育信号机制的洞见。
研究目的
- 调查Dictyostelium discoideum中Coronin-A依赖的早期饥饿反应。
- 识别早期发育中涉及的关键信号通路和因子。
- 开发一种高通量筛选发育诱导因子的方法。
使用的方法
- 聚集测定以研究发育转变。
- 在HL-5培养基中培养DH1.10和corA缺陷细胞。
- 在实验期间保持特定的细胞密度。
- 使用振荡培养箱以获得最佳生长条件。
主要结果
- Coronin A在Dictyostelium discoideum的早期发育中起着重要作用。
- 识别了饥饿反应中涉及的关键因子和通路。
- 展示了自动筛选发育因子的潜力。
- 解决了新手使用该方法时面临的挑战。
结论
- 该研究增强了对Dictyostelium discoideum发育生物学的理解。
- Coronin A对于Dictyostelium discoideum多细胞发育的启动至关重要。
- 研究结果可能导致对发育信号通路的进一步研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Early-stage aggregation assays in Dictyostelium discoideum enable mechanistic de-risking of protein function upstream of key signaling cascades. This approach supports predictive confidence in target validation by isolating the role of coronin A in multicellular development initiation. The method provides a robust platform for functional interrogation of signaling components relevant to developmental and cell signaling research portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional dissection of protein roles in early developmental signaling.
- Supports biological de-risking by clarifying upstream pathway dependencies.
- Facilitates predictive confidence in target selection for further study.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological systems for high-throughput screening of development-inducing factors.
- Standardizes aggregation readouts for reproducibility and quantitative comparison.
- Enables scalable evaluation of protein function in multicellular transition models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns early mechanistic findings with downstream pathway analysis in disease-relevant systems.
- Provides continuity from discovery-stage functional assays to preclinical model development.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by clarifying pathway bottlenecks.
Pipeline & Workflow Integration
This aggregation assay positions upstream of cAMP signaling, bridging early discovery biology with downstream screening and analytics in the developmental signaling workflow.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing for protein function in starvation-induced development.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative aggregation outputs for comparative analysis.
- Analytics: Enables measurement of aggregation phenotypes and response to exogenous factors.
- Translational Research: Provides mechanistic insights that inform preclinical model selection.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable assay platform for functional genomics and pathway interrogation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes assay conditions for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency in early discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of signaling targets for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, aggregation assays, and time-lapse microscopy.
- Needs access to controlled incubators, peristaltic pumps, and quantitative imaging systems.
- Demands cross-team standardization of cell densities, adherence times, and development intervals.
- May require adaptation of assay variables for different genetic backgrounds or model systems.
- Dependent on precise control of exogenous factor delivery and environmental conditions.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Observe the Early Starvation Response of Dictyostelium discoideum by Time-lapse Microscopy
2:14
cAMP Pulsing of Dictyostelium discoideum Cells During Starvation
3:54
Induction of Dictyostelium discoideum Development Through Exposure to Conditioned Medium
5:32
Results: cAMP Pulses Rescue the Early Developmental Defect of corA- Dictyostelium discoideum
6:45
Conclusion
