Name: 方法在成纤维细胞迁移的规律研究大分子复合物含MRP4， (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: 学习利用高内涵显微镜和FRET成像技术研究MRP4调控成纤维细胞迁移的方法。该方法可实时监测细胞内环磷酸腺苷动态变化，为药物发现和细胞生物学研究提供重要工具。

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本研究工作得到了美国国立卫生研究院基金 R01-DK080834 和 R01-DK093045 的资助。我们感谢辛辛那提儿童医院医疗中心医学撰稿人 J. Denise Wetzel 对稿件的编辑工作。

1. Ingenuity 通路分析
<ol>
	<li>上传蛋白质相互作用组数据集
	<ol>
		<li>将感兴趣的蛋白质/基因及其唯一的基因标识符（建议使用质谱数据获得的基因符号和基因标识符编号）输入电子表格中。</li>
		<li>在电子表格中分配一列用于基因标识符编号，另一列用于观测值例如，倍数变化或 p 值）。选择“包含列标题”选项以查看列标题。</li>
		<li>在IPA中点击“上传数据集”标签，选择上述电子表格，上传数据集。选择“灵活格式”标签，并选定相应的基因标识符类别。 
		注意：数据集的灵活格式可克服上传时的格式要求。</li>
		<li>数据集出现后，选择 ID 和观察值列。通过查看数据集摘要标签页，确保所有蛋白质（通过质谱鉴定的 MRP4 相互作用组）均已映射。此时，该数据集已准备好进行所需的分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析 
	注意：此处描述的是本研究中所使用的 IPA 功能的部分应用。
	<ol>
		<li>上传 MRP4 相互作用组数据并以基因名称作为唯一标识符后，点击“新建”，然后在 IPA 软件左上角菜单中选择“核心分析”。</li>
		<li>根据实验类型设置强度的表达阈值（建议分析时采用100的强度值）。</li>
		<li>若涉及对照组和实验组条件，在准备数据集时计算表达量的变化倍数，并在需要进行比较分析时将其作为数据集文件的一部分纳入（通常建议分析时采用1.5倍变化作为阈值）。 
		注意：核心分析完成后，可获得多个分析部分。第一个标签页显示所有分析的汇总结果，并根据置信水平（p 值）计算，按 p 值升序排列，提示最显著的典型通路、上游调节因子、分子与细胞功能以及相关网络等。</li>
		<li>打开主要的经典通路（使用“打开通路”选项），以大型分子网络的形式直观展示相互交叉、重叠及受影响的信号通路。 
		根据 p 值（p < 0.05）查看主要涉及的经典通路列表 &#60;0.05 被视为具有显著性。 
		注意：经典信号通路的显著性值通过 Fisher 精确检验（右尾）计算得出。该显著性表示仅凭随机概率，数据集中的分子与经典信号通路发生关联的可能性。</li>
		<li>在每条通路所涉及的蛋白质列表中确认输入蛋白（通过质谱鉴定的MRP4相互作用组）。 
		注意：使用此选项可观察到细胞肌动蛋白细胞骨架信号网络是主要受影响的通路，以及输入蛋白如何整合到该通路中（图1该方法有助于确定哪些分子网络会与受试蛋白密切相关并受到影响。</li>
		<li>在分析中使用“网络”选项卡，根据焦点分子的数量确定可能与特定蛋白质网络相关的最显著疾病和功能。 
		注：评分值基于确定为网络组成部分的已知蛋白质而给出 例如细胞组装与组织网络，通过文献知识和实验证据，整合数据集中鉴定出的关键分子，使其成为网络的一部分。随后，该网络首先根据关键分子的数量进行筛选。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 高内涵显微镜技术
<ol>
	<li>细胞准备 
	注意：所有细胞培养操作均在水平层流细胞培养罩内进行。
	<ol>
		<li>使用96孔微孔板进行伤口愈合实验。</li>
		<li>用1%纤连蛋白溶液（以PBS配制）包被微孔板，并将板置于标准CO2培养箱中37 °C孵育2小时。</li>
		<li>从培养箱中取出在25 cm²细胞培养瓶中生长的Mrp4-/-和Mrp4+/+小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），用PBS洗涤1次，加入1 ml 4倍胰蛋白酶-EDTA溶液消化5分钟。</li>
		<li>用完全培养基（含10% FBS和1%青霉素/链霉素的DMEM）洗涤细胞，并将细胞重悬于5 ml完全培养基中。</li>
		<li>吸除各孔中的纤连蛋白溶液，使用血细胞计数板计数细胞，并将30,000个细胞（细胞数量需根据细胞类型优化）接种至每孔。</li>
		<li>将细胞在标准CO2培养箱中37 °C培养24小时，使其达到100%汇合度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制造伤口
	<ol>
		<li>确保所有孔中均含有液体。将未使用的孔加入PBS，以防止损伤制伤工具（例如，WoundMaker）。</li>
		<li>确认细胞达到100%汇合后，将96孔板置于金属底板上的制伤工具内，压下96孔针头模块。</li>
		<li>用PBS洗涤细胞三次，以去除脱落的细胞，并加入100 µl完全培养基。</li>
		<li>在此阶段加入待测化合物——H-89（50 µM；使用DMSO中50 mM母液按1:1,000比例稀释至完全培养基中）或Latrunculin B（1 µM；使用DMSO中1 mM母液按1:1,000比例稀释至完全培养基中）。</li>
		<li>将实验板放入读板仪中，在37 °C条件下监测整个实验期间的细胞迁移情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>监测细胞迁移 
	注意：使用高内涵显微成像系统配套的显微镜和软件进行细胞迁移监测。使用96孔微孔板可确保显微镜自动扫描伤口区域，并由软件完成图像注册。
	<ol>
		<li>在软件中设置定时扫描功能，每小时扫描一次迁移实验。选择“定时扫描”选项卡，并设定开始时间，至少在将实验板放入读板仪后15分钟再开始，以确保成像前系统达到平衡状态。</li>
		<li>选择托盘类型，设定容器类型（96孔微孔板）和实验类型（划痕伤口）。</li>
		<li>选择10倍物镜，并设定相差成像参数。通过“编辑扫描模式”选项选择需要扫描的孔。</li>
		<li>通过选择“属性”选项卡并建立板图来指定处理组及重复样本。可根据实验条件随时停止扫描。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析
	<ol>
		<li>扫描完成后，选择该实验板的“容器视图”选项卡。进入分析任务工具，选择“启动新分析任务”。</li>
		<li>设定任务类型为“划痕伤口”，并选择分析的时间范围（从0时间点至24小时时间点）。</li>
		<li>通过单击选择用于分析的孔，点击“确定”开始分析。分析完成后，使用“导出至图表”功能，以图形方式可视化每个时间点各孔的相对伤口密度（RWD）数据。</li>
		<li>使用“查看图像”选项卡查看对应不同时间点的各孔相差图像集。通过点击板图选择特定孔，从时间范围选项卡中选择特定时间点，然后点击“查看图像”选项卡。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 傅里叶共振能量转移（FRET）
<ol>
	<li>细胞准备
	<ol>
		<li>用100 µl 1% 纤连蛋白溶液（如第2.1节所述）包被35 mm玻璃底培养皿，并将其置于标准CO2培养箱中，37 °C孵育2小时。</li>
		<li>吸除培养皿中的纤连蛋白溶液，向其中接种等量的HEK293细胞（每皿10,000个细胞），加入完全培养基。</li>
		<li>将细胞在包被有纤连蛋白的玻璃底培养皿中，于标准CO2培养箱中37 °C培养24小时，使其融合度达到60–70%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转染
	<ol>
		<li>按照生产商说明书，使用商用转染试剂进行所有瞬时转染操作。</li>
		<li>为每个35 mm培养皿分别取250 µl完全培养基，分装至两个独立的1.5 ml&#160;无菌离心管中。</li>
		<li>在一个管中加入2 µg DNA（pmAKAR3或pmAKAR3-TA），在另一管中加入5 µl转染试剂（为DNA浓度的2.5倍）。</li>
		<li>室温孵育20分钟，然后将稀释后的DNA转移至含有转染试剂的管中。</li>
		<li>充分混匀后，于37 °C再孵育30分钟。</li>
		<li>吸除细胞培养基，用PBS洗涤一次。向细胞中加入1 ml含10% FBS的无抗生素DMEM/F-12培养基。</li>
		<li>向每皿细胞中加入507 µl含DNA-脂质复合物的培养基，轻轻混匀，置于CO2培养箱中37 °C继续培养48小时。每皿使用2 µg DNA（1 µg/µl储存液）和5 µl脂质试剂，适用于10,000–50,000个细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>活细胞成像
	<ol>
		<li>转染48小时后，移除生长培养基，用预热至37 °C的Hank's平衡盐溶液（HBSS）洗涤细胞两次。向洗涤后的细胞中加入终体积1.9 ml的HBSS，并将其置于倒置宽场显微镜系统中，在定制的维持37 °C的培养室内进行FRET成像。 
		注意：该系统中激发光由300 W氙灯提供，通过透光率为50%的中性密度滤光片衰减。</li>
		<li>使用60倍物镜。手动对细胞聚焦，并通过显微镜设定最佳视野。在软件中使用Focus &#34;F&#34;选项，在计算机屏幕上激活所选视野。进行FRET测量时，手动选择合适的滤光片组（CFP/YFP滤光片组，包含430/25 nm激发滤光片、双二向色镜，以及两个发射滤光片（CFP为470/30 nm，FRET为535/30 nm））。</li>
		<li>首先选择CFP/YFP/FRET通道选项，然后点击打开荧光标签，观察荧光信号。通过相机标签中的增益工具提高信号强度。</li>
		<li>选择表达pmAKAR3或pmAKAR3-TA的细胞，避免信号强度饱和。使用采集窗口启动FRET测量。</li>
		<li>选择时间序列选项，设置总时长为30分钟、时间间隔为30秒的时间扫描。勾选FRET选项，并将曝光时间设为100毫秒。输入图像标签后点击开始，启动测量。</li>
		<li>在获得前五个时间点并建立基线后，向细胞中加入25 µM佛司可林（将5 µl 10 µM乙醇储存液用100 µl HBSS稀释），加入时避免扰动培养皿，继续监测细胞共30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析 
	注意：使用比率计算模块进行数据分析。
	<ol>
		<li>点击图像窗口左侧的选择工具，从下拉菜单中选择实心矩形。将矩形拖动至图像中无细胞区域，并右键单击将其设为背景，用于背景扣除。</li>
		<li>进入掩膜（mask）界面，使用“创建新掩膜”选项。返回选择工具，从下拉菜单中选择画笔工具，手动围绕细胞绘制掩膜以选定待测细胞。每种条件下至少选择4–6个细胞。</li>
		<li>选择Mask标签页，执行掩膜统计分析。</li>
		<li>勾选“整个掩膜”，展开跨通道选项，选择供体归一化FRET（N-FRET）（FRET/CFP）。N-FRET值代表细胞膜上的PKA活性。</li>
		<li>使用注释功能添加时间戳、伪彩标尺（look-up table）和比例尺。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

细胞迁移是一个复杂的过程，在许多重要的生理事件中发挥着不可或缺的作用，包括伤口愈合1,2。异常的细胞迁移可能导致灾难性事件，如肿瘤转移和血管生成24,25。因此，必须对细胞迁移进行精细调控，以维持机体正常功能。
利用高内涵显微镜技术18，我们证明了与野生型成纤维细胞相比，MRP4缺陷型MEF细胞的迁移速度更快14。与传统的划痕伤口实验不同，本方法中的显微镜以自动化、便捷、一致且高通量的方式进行伤口愈合实验。软件基于三个独立的指标分析细胞迁移速率：i）伤口宽度的变化，ii）伤口区域内细胞汇合度的变化，以及iii）相对伤口密度（RWD）。RWD是一种自归一化的指标，用于测量伤口区域内相对于伤口区域外的空间细胞密度。因此，该指标不受细胞增殖引起的细胞密度变化的影响，能够提供关于细胞迁移的特异性信息，而这些信息通过传统的划痕伤口实验难以获得26。在初始时间点（0时），RWD为0%；当伤口完全愈合时，RWD将达到100%。所有这些指标均由定制软件通过内置算法进行计算，并为每个时间点自...

细胞迁移是一个复杂的多步过程。研究表明，在迁移过程中，细胞会极化为前端和后端。前端通过黏附于细胞外基质，为细胞体向前移动提供必要的牵引力。最后，后端释放尾部的黏附连接，完成迁移循环1,2。
细胞极化通过细胞内信号通路的空间分离来调控高效的细胞迁移。细胞内的第二信使（如cAMP）介导了精细调节定向细胞迁移所需的信号事件的区室化3,4。cAMP及其依赖性激酶PKA在细胞前缘的优先富集，在定向细胞迁移过程中发挥关键作用5,6。PKA通过磷酸化小GTP酶，如Ras相关C3肉毒毒素底物（Rac）和细胞分裂周期蛋白42同源物（Cdc42），在细胞前缘激活肌动蛋白相关蛋白2/3（Arp 2/3），从而诱导片状伪足的形成7-9。PKA还可磷酸化一种抗封端蛋白——血管扩张刺激磷蛋白（VASP），进而调控细胞膜伸展与回缩的振荡循环10,11。
在细胞中，cAMP 水平由三个主要过程调控：i）腺苷酸环化酶催化合成，ii）磷酸二酯酶介导降解，以及 iii）膜结合外排转运蛋白介导的转运3。多药耐药蛋白 4（MRP4）属于 ATP 结合盒（ABC）膜转运蛋白家族，可作为环核苷酸的内源性外排转运蛋白发挥作用。因此，MRP4 能够调节细胞内 cAMP 水平及 cAMP 依赖性细胞信号传导11-13。我们先前的研究表明，在 Mrp4-/- 成纤维细胞中，环核苷酸水平相对较高，且其迁移速度较 Mrp4+/+ 成纤维细胞更快14。我们还报道了环核苷酸对成纤维细胞迁移具有双相效应。基于以往研究以及我们发现 Mrp4-/- 成纤维细胞在迁移过程中具有更明显的 cAMP 极化现象，我们提出假设：MRP4 对成纤维细胞迁移的调控作用依赖于 cAMP。为了阐明其下游机制，我们采用了一种直接且多角度的研究方法。
为了鉴定与 MRP4 相关并与其相互作用的蛋白质，我们从过表达 MRP4 的 HEK293 细胞中免疫沉淀了含有 MRP4 的大分子复合物。通过质谱分析，我们鉴定了多个与 MRP4 相互作用的蛋白质，并利用 Ingenuity Pathway Analysis（IPA）分析了它们之间的相互关联性。IPA 是一种有效的工具，可根据文献和实验证据分析蛋白质-蛋白质之间（包括结构和功能层面）的相互作用，并探究其在特定生理和病理事件中的作用15,16。IPA 结果表明，在细胞迁移过程中，F-肌动蛋白是 MRP4 的一个重要下游靶点，其中 cAMP 和 cGMP 是关键的信号分子17。这些结果进一步通过高内涵显微镜技术得到验证。高内涵显微镜能够以更便捷、准确且高通量的方式捕获和分析细胞行为，例如细胞迁移18。高内涵显微镜数据显示，当肌动蛋白细胞骨架被破坏或蛋白激酶 A（PKA）被抑制时，MRP4 对成纤维细胞迁移的影响完全消失17。
此外，我们使用了一种基于荧光共振能量转移（FRET）的蛋白激酶A（PKA）传感器，以实时监测迁移细胞中PKA的动态变化。基于FRET的激酶传感器通常由特定的磷酸化底物肽段组成，该肽段两侧分别连接CFP和YFP荧光基团19-21。pmAKAR3是一种经过优化并靶向细胞膜的基于FRET的PKA传感器，包含叉头相关结构域1（FHA1）以及PKA底物序列LRRATLVD5,22。当PKA催化亚基对pmAKAR3进行磷酸化时，会增强CFP与YFP之间的FRET信号19。通过在传感器中插入脂质修饰结构域，可将其靶向定位于质膜，从而特异性地监测膜区室中的PKA动态变化23。
利用 pmAKAR3，我们证明了迁移中的 Mrp4-/- 成纤维细胞前沿表现出比 Mrp4+/+ 成纤维细胞更强的极化 PKA 活性，从而增强了细胞前沿皮层肌动蛋白的形成17。这些事件共同导致在缺失 MRP4 的情况下，细胞极化更显著且定向迁移速度更快。我们采用的这一特异且直接的方法，鉴定了 MRP4 的关键下游靶点，揭示了一种重要但迄今尚未被探索的 MRP4 依赖性调控成纤维细胞迁移的机制。

<table><tbody><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)&amp;nbsp;</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen (美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)&amp;nbsp;</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>IncuCyte Zoom</td><td>Essen BioScience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔IncuCyte Image-Lock微孔板&amp;nbsp;</td><td>Essen BioScience</td><td>4493</td><td></td></tr><tr><td>Latrunculin B</td><td>Sigma-Aldrich (美国密苏里州圣路易斯)。</td><td>L5288</td><td>以DMSO配制储存液</td></tr><tr><td>H-89</td><td>Enzo Life Sciences (美国纽约州法明代尔)</td><td>BML-EI196</td><td>以DMSO配制储存液</td></tr><tr><td>35 mm玻璃底培养皿&amp;nbsp;</td><td>(MatTek Corporation; 美国马萨诸塞州阿什兰)</td><td>P35G-1.5-20-C&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich (美国密苏里州圣路易斯)。</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM低血清培养基</td><td>Invitrogen (美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)&amp;nbsp;</td><td>31985-088</td><td></td></tr><tr><td>FRET显微成像系统</td><td>Olympus倒置显微镜 (IX51)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD相机&amp;nbsp;</td><td>Hamamatsu，日本</td><td>ORCA285</td><td></td></tr><tr><td>SlideBook 软件 5.5</td><td>Intelligent Imaging Innovation (美国科罗拉多州丹佛)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ingenuity 通路分析软件</td><td>IPA, QIAGEN Redwood City</td><td></td><td></td></tr><tr><td>福斯高林</td><td>Tocris (美国密苏里州埃利斯维尔)。&amp;nbsp;</td><td>1099</td><td>以100%乙醇配制储存液</td></tr><tr><td>DMEM F-12&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen (美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)&amp;nbsp;</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen (美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)&amp;nbsp;</td><td>14025-134</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)&amp;nbsp;</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA溶液 (TE)</td><td>Invitrogen(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)&amp;nbsp;</td><td>R-001-100</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Invitrogen(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)&amp;nbsp;</td><td>15140-122</td><td></td></tr></tbody></table>

研究含 mrp4 大分子复合物在成纤维细胞迁移调控中的方法

Methods to Study Mrp4-containing Macromolecular Complexes in the Regulation of Fibroblast Migration

多药耐药蛋白4（MRP4）属于ATP结合盒膜转运蛋白家族，是环核苷酸的内源性外排转运体。通过调节细胞内环核苷酸浓度，MRP4可调控多种依赖环核苷酸的细胞事件，包括细胞迁移。我们先前的研究表明，在缺失MRP4的情况下，成纤维细胞内的环核苷酸水平更高，并且迁移速度更快。为了深入理解这一现象的潜在机制，我们采用了一种直接而多层面的研究方法。首先，通过在MRP4过表达细胞系统中进行免疫共沉淀联合质谱分析，分离出MRP4潜在的相互作用蛋白复合物。在鉴定出MRP4相互作用组中的特异性蛋白后，我们利用Ingenuity信号通路分析（IPA）探讨这些蛋白质-蛋白质相互作用在信号转导背景下的作用。我们阐明了MRP4蛋白复合物在细胞迁移中的潜在作用，并确定F-肌动蛋白是介导MRP4对细胞迁移影响的主要因子。本研究还强调了cAMP和cGMP在细胞迁移过程中的关键作用。通过高内涵显微镜技术，我们开展了细胞迁移实验，发现破坏肌动蛋白细胞骨架或抑制cAMP依赖性蛋白激酶A（PKA）可完全消除MRP4对成纤维细胞迁移的影响。为了实时观察迁移细胞内的信号调控变化，我们使用基于FRET的传感器检测PKA活性，结果发现与Mrp4+/+成纤维细胞相比，Mrp4-/-成纤维细胞迁移前沿区域表现出更强的极化PKA活性。这种极化活性进一步促进了皮层肌动蛋白的形成，从而增强了细胞迁移过程。我们的研究方法能够识别位于MRP4下游发挥作用的蛋白质，为理解MRP4依赖性调控成纤维细胞迁移的机制提供了整体性视角。

为了研究 MRP4 对成纤维细胞迁移的影响，我们采用了一种利用高内涵显微镜的伤口愈合实验14。在分别来自 Mrp4-/- 或 Mrp4+/+ 小鼠的汇合单层小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）上制造精确的划痕，并以每小时一次的频率连续成像24小时。我们观察到，与 Mrp4+/+ MEFs 相比，Mrp4-/- MEFs 的迁移速率更高（图2）。Mrp4-/- MEFs 在不到15小时的时间内即完全闭合伤口，而 Mrp4+/+ MEFs 则几乎需要20小时才能完成伤口覆盖。
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MRP4 调控多种环核苷酸依赖性信号事件，其中包括最近阐明的在细胞迁移中的作用。我们描述了一种直接但多方面的研究方法，用于揭示 MRP4 的下游分子靶点，从而鉴定出一个独特的 MRP4 相互作用组，该相互作用组在成纤维细胞迁移的精细调控中发挥关键作用。

研究含 Mrp4 大分子复合物在成纤维细胞迁移调控中的方法

多药耐药蛋白4（MRP4）属于ATP结合盒膜转运蛋白家族，是一种内源性外排转运蛋白，可转运……

本实验流程的总体目标是观察 MRP4 对成纤维细胞迁移的环磷酸腺苷（cAMP）依赖性调控。高内涵显微镜技术有助于回答细胞生物学领域中的关键问题。例如，MRP4 除了赋予细胞耐药性外，还可通过调节细胞内环核苷酸浓度来调控细胞迁移等生理过程。我们今天将尝试使用的 FRET 成像技术的主要优势在于，能够以实时方式监测细胞内环磷酸腺苷及其依赖性激酶的动态变化。高内涵显微镜的意义在于其可用于药物发现研究。一旦系统建立并完成仪器设置，该基于微孔板的操作将无需人工干预。尽管该方法可用于研究细胞迁移，但它也可应用于其他系统，例如脂滴细胞的非干扰性高内涵成像、免疫细胞杀伤、细胞稀释、血管生成、细胞增殖、趋化作用以及叶绿体迁移等过程。在细胞培养超净台内准备用于高内涵显微镜观察的细胞时，使用含 1% 纤连蛋白的 PBS 溶液包被 96 孔板的孔壁。将该板置于 37 °C 的 CO2 培养箱中孵育

methods-to-study-mrp4-containing-macromolecular-complexes-regulation

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

方法在成纤维细胞迁移的规律研究大分子复合物含MRP4，

本文介绍了利用活细胞成像技术测定白细胞对特定配体的趋化反应，并鉴定细胞表面受体与胞质蛋白之间相互作用的方法。...

白三烯B4介导的细胞迁移及BLT1与β-arrestin相互作用的实时成像

细胞迁移等细胞过程传统上是在二维刚性塑料表面进行研究的。本报告描述了一种技术，可直接观察蛋白质定位，并分析在更接近生理条件的三维基质中迁移细胞内的蛋白质动态变化。...

活细胞成像观察在三维基质中迁移并表达荧光标记蛋白的细胞

采用延时显微镜和图像处理技术，在环境可控的生物反应器中对成纤维细胞介导的凝胶收缩及纤维蛋白纤维重排进行为期48小时的观察与分析 时期。...

观察与定量成纤维细胞介导的纤维蛋白凝胶收缩

细胞迁移是一种生物学现象，参与多种生理过程（如伤口愈合和免疫反应）以及病理生理过程（如癌症）。三维胶原基质迁移实验是一种多功能工具，可用于分析不同类型细胞在类似三维生理环境中的迁移特性。...

三维胶原基质中细胞迁移的分析

细胞外基质的力学性质和微观结构对细胞的三维迁移具有显著影响。 体外...

用于研究基质微环境对三维细胞迁移生物物理作用的同心凝胶系统

本实验方案的目的是评估促迁移和抗迁移因子对细胞在三维纤维蛋白基质中迁移的影响。...

在三维环境中表征细胞迁移 体外 伤口环境

我们介绍了如何利用微操作和光操控技术（如荧光漂白恢复技术FRAP和光激活技术），来测定迁移细胞内蛋白质的运动参数及其时空动态。实验读出结果包括运动调控因子或其下方肌动蛋白细胞骨架的亚细胞动态行为与更新速率。...

允许分析细胞骨架调节因子形态发生动力学与周转的显微操作技术

该方法可用于定量分析贴壁依赖性细胞在纤连蛋白上的早期黏附和铺展动态。此外，该实验还可用于研究氧化还原稳态改变对细胞铺展和/或细胞黏附相关胞内信号通路的影响。...

在氧化应激条件下研究上皮细胞在纤连蛋白上的细胞黏附与铺展动态过程

获得成纤维细胞的纯种群体对于研究其在伤口修复和纤维化中的作用至关重要。本文详细描述了一种从正常和损伤的小鼠心脏中分离成纤维细胞和肌成纤维细胞的方法，并通过免疫荧光、逆转录PCR（RTPCR）、荧光辅助细胞分选以及胶原凝胶收缩实验对细胞的纯度和功能特性进行表征。...

成年心脏成纤维细胞与肌成纤维细胞的分离与鉴定

癌症因其能够转移至不同器官而成为一种致命疾病。确定癌细胞在各种治疗条件下的迁移和侵袭能力，对于评估治疗策略至关重要。本方案介绍了一种用于评估胶质母细胞瘤细胞系实时转移能力的方法。...

基于阻抗的癌细胞迁移与侵袭实时检测

本方案旨在测量铺展细胞边缘突起的动态参数（突起、回缩、皱褶）。...

利用活细胞显微镜测量细胞边缘突出在铺展过程中的动态变化

学习利用高内涵显微镜和FRET成像技术研究MRP4调控成纤维细胞迁移的方法。该方法可实时监测细胞内环磷酸腺苷动态变化，为药物发现和细胞生物学研究提供重要工具。

研究含 Mrp4 大分子复合物在成纤维细胞迁移调控中的方法

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