双荧光联合检测 原位 小鼠脑切片中三种基因表达检测的杂交与免疫标记联合方法

本实验的总体目标是利用双重荧光原位杂交结合免疫染色技术，同时检测脑组织切片中三种不同基因的表达。该方法有助于回答神经科学领域中的关键问题，例如：何种细胞类型表达我感兴趣的基因？该技术的主要优势在于，无需针对目标基因的优质抗体，即可将其表达定位到特定细胞类型。

总结该实验流程：第一天，对固定的组织切片进行切片处理，并与两种不同标记的 RNA 探针在室温下杂交过夜。第二天，将切片与靶向 FITC 标记探针的抗体在室温下孵育过夜。该抗体偶联了辣根过氧化物酶，在第三天可催化荧光酪胺的沉积。

然后，使用碱性磷酸酶标记的抗体来识别地高辛（DIG）标记的探针。在第四天，当与Fast Red溶液孵育时，该酶会催化形成荧光沉淀。随后，切片与针对目标蛋白的一抗在4℃孵育过夜。

最后，在第五天，使用荧光染料标记的二抗对这种蛋白进行可视化检测。开始该实验时，选择一个含有目的基因cDNA序列的DNA克隆，该克隆应位于带有RNA聚合酶启动子的质粒中。接下来，扩增该DNA克隆，使用小量质粒纯化试剂盒提取质粒，并利用T7和SP6通用引物对其进行测序。

用一种在cDNA有义链5'端切割的限制性内切酶消化10至20微克的质粒DNA。在37摄氏度下孵育1.5小时。然后取少量等分试样在琼脂糖凝胶上电泳，以确认质粒已完全线性化。

为纯化线性化质粒，加入十分之一体积的 3 M 醋酸钠、一体积的 10 mM Tris-HCl 平衡酚和一体积的氯仿-异戊醇。在室温下以 16,000 ×g 离心一分钟，收集上层水相。然后加入一体积的氯仿-异戊醇（IAA）。

在16,000 G下离心一分钟，收集上层水相。重复此步骤一次。然后加入两倍体积的乙醇，于-20摄氏度放置一小时或过夜。

随后，在 4°C 条件下以 16,000 ×g 离心 10 分钟。弃去上清液，并用 70% 冷乙醇洗涤沉淀。然后将沉淀重悬于 TE 缓冲液中，浓度为每 2.5 µL 含 1 µg cDNA。

合成两种探针时，首先选择合适的RNA聚合酶，然后配制体外转录反应体系，并用经DEPC处理的水将终体积调至20 µL。在37 °C下孵育1.5小时。

随后，取一微升转录反应产物在1%琼脂糖凝胶上电泳，以检测反应是否成功。凝胶应显示出线性模板以及一条明亮的探针条带。在此步骤中，使用冷冻切片机对冷冻组织切取15微米厚的切片。

将切片收集到显微镜载玻片上，并将载玻片放置干燥一小时，以确保组织牢固黏附于载玻片。该实验步骤成功最关键的要素是切片的质量。这在一定程度上取决于灌注和固定良好的组织，另一方面则依赖于切片技术，以获得平整且无RNase污染的切片。

然后，将两种探针加入预热至65摄氏度的杂交缓冲液中稀释，并充分混匀。每个载玻片上加300微升杂交混合液，盖上经烘箱烘烤过的盖玻片。随后，将载玻片置于湿盒中，于65摄氏度过夜孵育。

第二天，将切片转移至含有预热洗涤缓冲液的考普林瓶中，在65摄氏度下每次洗涤30分钟，重复两次。随后，在室温下用MABT洗涤液每次洗涤10分钟，重复三次。在此步骤中，使用疏水笔在组织切片周围画圈。

然后将切片置于湿盒中，于室温下用原位杂交封闭缓冲液孵育1小时。接着，将切片在4摄氏度下与辣根过氧化物酶标记的抗FITC抗体共同孵育过夜。随后，将切片放入盛有PBST的考普林瓶中。

用 PBST 每次 10 分钟，共洗涤三次，每次更换新鲜的 PBST。随后，向切片中加入荧光素酰胺，室温孵育 10 分钟。将切片放入考普林瓶中，用 PBST 每次 10 分钟，共洗涤三次。

随后，将切片在室温下用原位杂交封闭缓冲液孵育一小时。然后，将切片在4摄氏度下与碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体共同孵育过夜。之后，用MABT缓冲液洗涤三次，每次10分钟。

接下来，在室温下用 pH 8.2 的 0.1 摩尔 Tris-HCl 溶液洗涤载玻片两次，每次 5 分钟。过滤快红溶液，并将载玻片置于湿化 chamber 中，于 37 摄氏度下用快红溶液孵育。由于最佳显色时间可能有所不同，需定期使用荧光显微镜观察载玻片，以监测沉淀物的形成情况。

然后，用PBST洗涤三次，每次10分钟。进行免疫组织化学染色时，将切片置于湿盒中，于室温下用IHC封闭缓冲液孵育1小时。接着，将切片在4°C条件下与一抗溶液孵育过夜。

第二天，用PBST洗涤载玻片，每次10分钟，共洗涤三次。在室温下用二抗溶液孵育一小时。然后，再用PBST洗涤三次，每次10分钟。

随后，将切片在室温下部分干燥，并使用荧光封片剂封片。将切片放置干燥后再使用共聚焦显微镜进行成像。图中显示的是 Aspa 和 Mbp 的原位杂交结果，随后进行 OLIG2 的免疫染色以及钩染（hook-staining）的代表性图像。

Aspa 在部分皮层和胼胝体中的 MBP 阳性 OLIG2 阳性细胞中有表达。部分 Mbp 阳性 OLIG2 阳性细胞不表达 Aspa。进行该操作时，需注意保持切片及所有溶液无 RNase 污染。

观看本视频后，您应能充分理解如何利用 N-柠檬荧光蛋白抑制化和免疫组织化学技术研究基因表达模式。该技术可适用于多种不同来源和发育阶段的组织。