Name: 预测与基因调控元件的验证激活过程中维甲酸诱导胚胎干细胞分化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 学习利用ChIP-seq和荧光素酶报告基因检测技术识别并验证增强子功能的方法，适用于胚胎干细胞分化研究。该流程可适配多种细胞模型系统，为基因调控研究提供可靠实验方案。

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作者谨此感谢 Bence Daniel 博士、Matt Peloquin、Endre Barta 博士、Balint L Balint 博士以及 Nagy 实验室成员对本文手稿的讨论和意见。L.N. 的研究得到了匈牙利科学基金（OTKA K100196 和 K111941）的资助，并由欧洲社会基金、欧洲区域发展基金以及匈牙利脑研究计划共同资助——资助编号：KTIA_13_NAP-A-I/9。

1. 基于Chip-seq分析的增强子筛选
<ol>
	<li>从 http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/ 下载 RXR ChIP-seq 原始数据 fastq 文件（mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz）</li>
	<li>下载并解压用于比对的 BWA 索引文件（本例中为：Mus_musculus_UCSC_mm10）。（ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz 
	注：有关生物信息学分析步骤的更多信息以及下载下文所用脚本，请访问 https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts。</li>
	<li>将示例 fastq 文件比对至 mm10 基因组（使用脚本：perform_alignment.sh）。该操作将生成一个包含 .bam 文件及比对统计信息的文件夹。比对后的 RXR ChIP-seq 数据（mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam）及其对应的索引文件（.bai）可在此处获取： 
	http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/ 
	注：BWA 是一种将相对较短序列（例如，ChIP-seq 结果）比对到参考基因组数据库（如小鼠参考基因组 例如，mm10）的软件包13。</li>
	<li>运行脚本（callpeaks.sh）进行峰识别（peak calling）和 从头 模体分析（de novo motif analysis），输入文件为 .bam 文件。该脚本基于 Homer findPeaks 工具14。 
	注：输出文件提供有关峰总数、模体富集程度、背景占比、含有模体的目标序列等信息（图1）。通常，模体会按其显著性排序列出。</li>
	<li>对排名首位的模体（#1 模体，NR 半模体 `AGGTCA`）进行重新定位（使用脚本：remap_motif.sh） 
	注：该脚本运行后将生成一个 .bed 文件，用于显示哪些 ChIP-峰覆盖了包含目标转录因子典型结合位点的基因组区域。</li>
	<li>使用 Integrative Genomics Viewer（IGV）15 下载并可视化比对后的 RXR ChIP-seq 读段数据（mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam，同时下载 .bai 文件）以及 AGGTCA 模体出现位置（mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed），以识别潜在的 RAR/RXR 结合位点（图2 和 图3）。 
	注：整合多种 ChIP-seq 数据有助于更精确地预测候选增强子16,17。近期研究表明，活性增强子通常富集 P300，并与 H3K4me1 和 H3K27ac 相关，且位于开放染色质区域，因此建议同时检测 DNase-I 超敏感性18-21。</li>
	<li>在 IGV 15 中使用&#34;定义感兴趣区域&#34;功能，获取选定基因组区域的 200 - 400 bp 序列，并将这些序列用于后续引物设计。</li>
</ol>
2. 报告基因检测
注意：荧光素酶/荧光素系统被用作转录调控的一种极为敏感的报告基因检测方法。根据增强子的活性，会产生荧光素酶，该酶可催化荧光素氧化为氧荧光素，从而产生可被检测的生物发光。第一步，应将已鉴定出的潜在增强子序列亚克隆至报告基因载体中（例如，TK-Luciferase 22、pGL3 或 NanoLuc）。
<ol>
	<li>引物设计
	<ol>
		<li>使用Primer3（可在此处获取：http://bioinfo.ut.ee/primer3/）设计PCR引物，用于扩增200–400 bp的假定增强子区域23</li>
		<li>将包含假定结合位点的基因组序列从 IGV 复制粘贴到 Primer3（参见步骤 1.7）。在 Primer3 中将产物大小范围设置为 250 - 300 bp。</li>
		<li>使用 UCSC 基因组浏览器验证 PCR 引物 计算机模拟 PCR 工具（https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr）24 
		注意：本实验方案在后续步骤中使用 HindIII 和 BamHI 限制性内切酶进行克隆。请通过 UCSC 预测 PCR 扩增序列，确认其是否含有这些酶切位点 计算机模拟 PCR 工具将包含 AAGCTT 或 GGATCC 限制性酶切位点例如， &#160;http://nc2.neb.com/NEBcutter2/)</li>
		<li>从商业供应商处获取所需的引物。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从基因组DNA中扩增增强子序列的PCR扩增
	<ol>
		<li>从原代细胞中纯化模板基因组DNA（例如， 原代胚胎成纤维细胞。使用商业试剂盒提取基因组DNA，并按照制造商说明书操作。 
		注意：高质量的基因组DNA（gDNA）对于成功的PCR扩增至关重要。若从gDNA进行PCR扩增困难，可使用合适的BAC克隆。</li>
		<li>准备50 µl PCR反应体系，包含100 ng基因组DNA、5 µl 10x缓冲液、3 µl MgSO₄4 （25 mM），5 µl dNTP（各2 mM），1.5 µl 正向引物（10 µM），1.5 µl 反向引物（10 µM），1 µl DNA聚合酶 
		注意：PCR 反应应使用具有低错误率的高保真 DNA 聚合酶。</li>
		<li>设置PCR循环程序（95 °C 2分钟，(95 °C 20秒，58–65 °C 10秒，70 °C 18秒) 重复25次，70 °C 2分钟，4 °C永久保存）。根据引物的预测Tm值设定退火温度。</li>
		<li>使用商业化的PCR纯化试剂盒纯化PCR产物，并遵循制造商的说明。</li>
		<li>通过使用上述引物并对其5'端添加悬垂序列，重复PCR以引入克隆所需的限制性酶切位点（例如， Fwd：5'-ATATAAGCTTxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-3'（HindIII），反向引物：5'-TATAGGATCCxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-3'（BamHI）。</li>
		<li>取5 µl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，以检测是否存在非特异性PCR产物。 
		注意：如果检测到更多条带，应将整个PCR产物进行电泳，并使用商品化的凝胶回收试剂盒纯化目标条带。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>限制 
	注意：需将插入片段克隆至TK启动子上游22 纯化的PCR产物和载体（例如， TK-Luc) 应用 HindIII 和 BamHI 进行消化。
	<ol>
		<li>配制50 µl反应体系，包含1 µg纯化的PCR产物、1 µl HindIII（20 U/µl）、1 µl BamHI（20 U/µl）和5 µl 10x缓冲液。</li>
		<li>配制250 µl反应体系，包含5 µg载体（TK Luc或替代报告载体）、5 µl HindIII（20 U/µl）、5 µl BamHI（20 U/µl）、5 µl热敏感碱性磷酸酶（1 U/µl）和25 µl 10×缓冲液。 
		注意：用碱性磷酸酶（AP）处理载体可显著降低单酶切载体的自连，从而减少背景。</li>
		<li>37 °C 下孵育反应混合物 4 小时，然后使用商品化的 PCR 纯化试剂盒纯化经消化的 PCR 产物和载体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>连接
	<ol>
		<li>在PCR管中设置连接反应，包含2 µl 10x T4 DNA连接酶缓冲液、10 ng TK-Luc载体、50 ng插入片段（经酶切的PCR产物）、1 µl T4 DNA连接酶（400 U/µl），并用无核酸酶水补足至20 µl。 
		注意：准备一个不含插入片段的阴性对照反应。</li>
		<li>用移液器轻轻吹打混合反应液，使用小型离心机短暂离心收集PCR管内液体，随后在室温下孵育10分钟。</li>
		<li>65 °C 加热灭活 10 分钟，然后冰上冷却，取 5 µl 产物用于转化 50 µl 感受态细胞（例如， DH5α</li>
		<li>使用标准热激法转化细菌，挑取菌落，并用商业试剂盒提取质粒DNA。在进行后续步骤前，通过测序验证所有构建的正确性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ES细胞转染
	<ol>
		<li>使用48孔板。在细胞接种前30分钟，每孔加入200 µl 0.1%明胶溶液。</li>
		<li>转染前一天接种胚胎干细胞（ES细胞）。使用无饲养层的ES细胞，接种密度为3 × 104 每孔250 µl ES培养基中加入细胞。</li>
		<li>制备质粒混合物（每种混合物按8个孔计算，包括4个未处理孔和4个视黄酸处理孔）。 混合液1： 1,250 ng TK-Luc 空载体（阴性对照），950 ng β-半乳糖苷酶编码载体（βGal） 混合 2：1,250 ng TK-Luc Hoxa1 增强子（阳性对照），950&#160;ng βGal, 混合 3：1,250 ng TK-Luc PRMT8 增强子（目标区域），950 ng βGal。 
		注意：ES 细胞表达所需的转录因子（RAR/RXR）。在后续进行荧光素酶和 β-半乳糖苷酶检测时，留出未转染的孔以确定基础值。</li>
		<li>向每种质粒混合物中加入转染级低血清培养基，至终体积为106 µl（足够用于8个孔）。</li>
		<li>加入4.5 µl ES级别转染试剂，然后用移液器轻轻吹打15次混匀。室温孵育转染混合物10分钟。</li>
		<li>每孔加入13 µl转染混合物，用移液器充分混匀。将细胞放回培养箱（37 °C）过夜，随后进行配体处理。</li>
		<li>小心吸去细胞中的培养基，每孔加入250 µl新鲜培养基，其中含0.01 - 1 µM全反式维甲酸（RA）作为终浓度，或以DMSO作为溶剂对照。将细胞在37℃孵育24 - 48小时。 
		注意：视黄酸对光敏感。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞裂解物的制备
	<ol>
		<li>将5倍裂解缓冲液稀释（1.25 ml 0.5 M Tris pH = 7.8，1 ml 1 M 二硫苏糖醇（DTT）（溶于H₂O））2O）、10 ml 0.1 M EDTA（pH = 8.0）、50 ml 甘油、5 ml Triton X-100，加无菌水至100 ml）用无菌水稀释至1×，每10 ml加入20 µl 1 M DTT，使用前平衡至室温。在检测当天为48孔板准备10 ml。</li>
		<li>小心吸去细胞中的培养基，用1×PBS冲洗细胞一次。每孔直接加入200 µl 1×裂解缓冲液。</li>
		<li>室温下振荡2小时（化学裂解）。将细胞裂解液在-80 °C冷冻（机械裂解）。裂解液可在-80 °C保存数天。</li>
		<li>解冻裂解液。完全解冻后，使用电子多通道移液器将细胞裂解液转移至96孔板中。取80 µl细胞裂解液加入96孔透明板中用于β-半乳糖苷酶检测，另取40 µl细胞裂解液加入白色板中用于荧光素酶检测。操作过程中避免产生气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>β-半乳糖苷酶检测 
	注意：应使用β-半乳糖苷酶或其他替代的第二报告基因作为内参对照，以校正非特异性的实验变异。
	<ol>
		<li>制备β-半乳糖苷酶底物缓冲液：80.0 g Na2HPO4•7H2O, 3.8 g NaH2PO4•H2O，30.0 g KCl，1.0 g MgSO4•7H2O，用无菌水定容至1,000 ml。调节pH至7.4。经0.2微米滤膜过滤除菌，4 °C保存。</li>
		<li>将1 ml β-半乳糖苷酶底物缓冲液与4 mg ONPG（邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷）混合。使用前每1 ml缓冲液中加入3.5 µl 2-巯基乙醇（βME）。向80 µl细胞裂解液中加入100 µl β-半乳糖苷酶底物缓冲液。</li>
		<li>在37 °C下孵育反应体系，直至出现微弱的黄色。使用酶标仪在420 nm波长处读取吸光度，并导出数据。 
		注意：时间因转染效率而异，通常不超过30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光素酶检测
	<ol>
		<li>配制50 ml荧光素底物试剂：15.1 mg D-荧光素盐、82.7 mg ATP盐、185 mg MgSO₄4•7H2将O加入50 ml聚丙烯管中，然后加入1.5 ml 1 M HEPES缓冲液和48.5 ml无ATP水，涡旋混匀，确保所有组分完全溶解。分装成5–10 ml等份，于-80 °C保存。</li>
		<li>将5 ml荧光素底物试剂 warming 至室温后再开始实验。用移液器向含有40 µl细胞裂解液的白色培养板各孔中加入100 µl底物试剂，立即使用发光检测仪测量信号。</li>
		<li>从至少三次独立实验的三复孔转染中获取数据。</li>
		<li>首先通过从每个测量值中减去未转染细胞的平均值，计算每孔的基准归一化荧光素酶活性和基准归一化β-半乳糖苷酶值；然后计算荧光素酶与β-半乳糖苷酶活性的比值。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 增强子RNA的表征
注意：最近的全基因组研究发现了一种更直接的增强子活性指标，该研究鉴定出许多长度在50至2,000 nt之间的短非编码RNA，这些RNA由增强子转录而来，被称为增强子RNA（eRNAs）。16,25,26 (图4。eRNA的诱导与邻近编码外显子的基因诱导高度相关。因此，可依赖信号对增强子活性进行定量检测 体内 通过RT-qPCR比较不同条件下eRNA的产生情况。
<ol>
	<li>eRNA 引物设计指南&#160;通过RT-qPCR检测
	<ol>
		<li>选择用于eRNA检测的基因组区域，这些区域应距离已注释的转录起始位点至少1.5 - 2 kb。 
		注意：重要的是，基因内增强子区域的 mRNA 转录水平较高，会阻碍对正义链 eRNA 的准确定量；而在基因内增强子处，反义链 eRNA 可被检测到，其表达水平与基因外增强子处的 eRNA 相似。</li>
		<li>一般而言，引物设计应选择转录因子结合位点中心区域上下游 200 - 1,000 bp 的区段，可位于正义链或反义链图4 和 图6). 
		注意：如果目标细胞类型和条件下可获得GRO-seq、DNase-seq、H3K4me1、H3K4me3或H3K27ac ChIP-seq数据，则可用于更精确的引物设计。eRNA从以高水平H3K4me1和me3为特征的假定增强子区域转录而来。eRNA的表达与活化增强子组蛋白标记H3K27ac的富集呈正相关。</li>
		<li>使用 Primer3（http://bioinfo.ut.ee/primer3/）设计用于基于荧光染料的 RT-qPCR 检测 eRNA 的 PCR 引物23生成引物设计用的反义链序列（正义链的反向互补序列），方法参见：http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html。插入 200 - 300 bp 的正义链或反义链序列用于引物设计。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>eRNA转录的检测
	<ol>
		<li>使用商品化的基于酸性酚/氯仿的提取试剂，按照制造商的建议从处理后的细胞中分离总RNA。</li>
		<li>使用DNase I处理分离得到的RNA，再用于逆转录反应。在进行逆转录之前，按照制造商的建议灭活DNase。</li>
		<li>DNase I 处理后测定 RNA 浓度，每次逆转录反应使用 1,000 ng RNA。使用高质量的逆转录酶。 
		注意：由于大量增强子RNA（eRNAs）可能未被多聚腺苷酸化，反转录时需使用随机引物。</li>
		<li>采用标准程序通过RT-qPCR检测反向转录的eRNA。选用一种不受处理因素影响的mRNA作为标准化对照例如， 36B4、Ppia、Gapdh、Actb</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Rhead, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+UCSC+Genome+Browser+database%3A+update+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The UCSC Genome Browser database: update 2010.</a> Nucleic Acids Res. 38, D613-D619 (2010).</li>
<li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+transcription+at+neuronal+activity-regulated+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers.</a> Nature. 465, 182-187 (2010).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+transcription+by+distinct+classes+of+enhancers+functionally+defined+by+eRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming transcription by distinct classes of enhancers functionally defined by eRNA.</a> Nature. 474, 390-394 (2011).</li>
<li>Simandi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT1+and+PRMT8+regulate+retinoic+acid-dependent+neuronal+differentiation+with+implications+to+neuropathology%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">PRMT1 and PRMT8 regulate retinoic acid-dependent neuronal differentiation with implications to neuropathology.</a> Stem Cells. 33, 726-741 (2014).</li>
<li>Zhou, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sox2+distal+enhancer+cluster+regulates+embryonic+stem+cell+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential.</a> Genes Dev. 28, 2699-2711 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

近年来，测序技术的进步使得在多种细胞类型和组织中大规模预测增强子成为可能7-9。上述描述的工作流程可用于基于ChIP-seq数据筛选出的候选增强子进行初步表征。详细的步骤和注意事项将有助于研究人员在实验室中建立常规的增强子验证流程。
荧光素酶报告基因实验中最关键的步骤是转染效率。建议在每次实验中包含一个GFP构建体，以评估转染效率。使用新鲜且高质量的质粒可能至关重要，并可显著提高转染效果。本方案可适用于任何细胞模型系统。强烈建议使用适当的细胞类型来表征组织特异性增强子。因此，荧光素酶报告基因实验要求所选细胞必须能够高效转染。或者，可使用易于转染的细胞，并在其中（过）表达目标转录因子。这在某些组织特异性增强子的研究中可能尤为重要。
相比之下，增强子RNA可在任何细胞中使用，不受此类限制，从而可在不同条件下体内研究增强子活性。in vivo 高效检测eRNA的关键参数如上所列。分离高质量、未降解的RNA至关重要。必须进行DNase处理，以避免检测到基因组DNA污染而非eRNA。由于RNA将用...

多细胞生物的发育需要在发育中的组织中精确调控成千上万个基因的表达。基因表达的调控在很大程度上由增强子实现。增强子是一类短的非编码DNA元件，能够与转录因子（TFs）结合，并通过远距离作用激活靶基因的转录1。增强子通常以cis方式发挥作用，最常位于转录起始位点（TSS）的上游区域，但最近的研究也发现了一些增强子位于基因更远的上游、基因的3'端，甚至位于内含子和外显子内部的例子2。
在脊椎动物基因组中存在数十万个潜在的增强子1。近年来基于染色质免疫沉淀（ChIP）的技术提供了全基因组范围的高通量数据，可用于增强子分析3-9。尽管ChIP-seq实验获得的数据显著提高了识别细胞和组织特异性增强子的可能性，但必须注意的是，所检测到的结合位点并不一定代表直接的DNA结合和/或具有功能的增强子。因此，对新鉴定出的增强子进行进一步的功能分析至关重要。本文中，我们介绍了一种假定活性增强子识别与验证的基本三步流程，包括：1）通过ChIP-seq数据的生物信息学分析筛选假定的转录因子结合位点；2）将这些调控序列克隆至报告基因载体中并进行验证；3）检测增强子RNA（eRNA）的表达水平。
将胚胎干细胞（ES 细胞）暴露于视黄酸（RA）是常用于促进多能细胞向神经分化的手段10。RA 通过与视黄酸受体（RARα、β、γ）和视黄醇 X 受体（RXRα、β、γ）结合而发挥作用。RAR 与 RXR 以异源二聚体形式结合到 DNA 上称为视黄酸反应元件（RA-response elements）的序列模体，这些元件通常由 AGGTCA 序列的直接重复（称为半位点）组成，从而调控转录。配体处理实验已帮助鉴定出多个在 ES 细胞中受视黄酸调控的基因11,12。然而，其中许多基因的增强子元件尚未被描述。为了展示本文所述工作流程如何用于增强子的鉴定与验证，我们逐步展示了在胚胎干细胞中两个依赖视黄酸的增强子的筛选与表征过程。

<table><tbody><tr><td>KOD DNA聚合酶</td><td>Merck Millipore</td><td>71085-3</td><td>用于从基因组DNA中扩增增强子的PCR反应</td></tr><tr><td>DNeasy Blood &amp; Tissue试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>用于基因组DNA提取</td></tr><tr><td>QIAquick PCR纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>用于PCR产物纯化</td></tr><tr><td>凝胶回收试剂盒&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>当PCR产物较多时用于凝胶回收</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R3104L</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136L</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>FastAP</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td>去除DNA的5'-和3'-磷酸基团</td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td>用于连接反应</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>用于质粒提取</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>胚胎干细胞培养基</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td>胚胎干细胞培养基</td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>胚胎干细胞培养基</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>胚胎干细胞培养基</td></tr><tr><td>β-巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>胚胎干细胞培养基</td></tr><tr><td>FuGENE HD&amp;nbsp;</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>Opti-MEM&amp;reg; I减血清培养基</td><td>Life Technologies</td><td>31985-062</td><td>用于转染</td></tr><tr><td>全反式维甲酸</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>配体，用于激活RAR/RXR</td></tr><tr><td>96孔透明板</td><td>Greiner</td><td>655101</td><td>用于β-半乳糖苷酶检测</td></tr><tr><td>96孔白色板</td><td>Greiner</td><td>655075</td><td>用于荧光素酶检测</td></tr><tr><td>D-荧光素钾盐</td><td>Goldbio.com</td><td>115144-35-9</td><td>用于荧光素酶检测</td></tr><tr><td>ATP盐</td><td>Sigma</td><td>A7699-1G</td><td>用于荧光素酶检测</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>230391-25G</td><td>用于荧光素酶检测</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-25G</td><td>用于荧光素酶检测</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4 &lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>431478-50G</td><td>用于β-半乳糖苷酶检测</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4 &lt;/sub&gt;&amp;#8226;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>S9638-25G</td><td>用于β-半乳糖苷酶检测</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>230391-25G</td><td>用于β-半乳糖苷酶检测</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td>用于β-半乳糖苷酶检测</td></tr><tr><td>ONPG (邻硝基苯基-&amp;beta;-D-半乳糖苷)</td><td>Sigma</td><td>N1127-1G</td><td>用于β-半乳糖苷酶检测</td></tr><tr><td>TRIzol&amp;reg;</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>用于RNA提取</td></tr><tr><td>High-Capacity cDNA反转录试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>4368814</td><td>用于eRNA的反转录</td></tr><tr><td>无RNase的DNase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>DNase处理</td></tr><tr><td>SsoFast Eva Green</td><td>BioRad</td><td>750000105</td><td>实时定量PCR预混液</td></tr><tr><td>CFX384 Touch&amp;trade; 实时荧光定量PCR系统</td><td>BioRad</td><td></td><td>qPCR仪</td></tr><tr><td>BioTek Synergy 4多功能微孔板检测仪</td><td>BioTek</td><td></td><td>发光检测仪</td></tr></tbody></table>

视黄酸诱导胚胎干细胞分化过程中激活的基因调控元件的预测与验证

Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation

胚胎发育是一个涉及多个步骤的复杂过程，其中包括众多基因的激活与抑制。基因组中的增强子元件已被证实可在细胞分化过程中参与组织和细胞类型特异性的基因表达调控。因此，识别并进一步研究这些增强子元件对于理解细胞命运的决定机制具有重要意义。整合基因表达数据（例如，微阵列或RNA-seq）以及基于染色质免疫沉淀（ChIP）的全基因组研究（ChIP-seq）结果，可实现对这些调控区域的大规模鉴定。然而，对细胞类型特异性增强子的功能验证仍需进一步的体外和体内实验操作。本文将介绍如何对活性增强子进行实验性鉴定与验证。本实验方案提供了一个逐步操作的工作流程，包括：1）通过ChIP-seq数据分析鉴定调控区域；2）克隆所鉴定的基因组序列，并在报告基因检测中实验验证其潜在的调控功能；3）通过检测增强子RNA转录水平，在体内确定增强子活性。本方案描述详尽，可帮助研究人员在实验室中建立该工作流程。尤为重要的是，该方案可轻松适配并应用于任何细胞模型系统。

我们使用了一种广谱性RXR抗体，以确定在全基因组范围内，哪些受视黄酸（RA）调控的基因在其邻近区域存在受体富集。对经视黄酸处理的胚胎干细胞（ES细胞）获得的RXR ChIP-seq数据进行生物信息学分析，结果显示，在RXR占据的位点下方富集了核受体半位点（AGGTCA）（图1）。我们利用一种生物信息学算法，将半位点的基序搜索结果回溯映射到RXR ChIP-seq数据中（图2）。该分析帮助我们准确识别出与经典核受体结合位点重叠的ChIP峰。在IGV中对这些位点进行可视化显示，表明这些转录因子在Hoxa1（一个先前已被表征的RAR/RXR靶基因）附近区域富集（图2和图3）。我们还鉴定出一个新型RA靶基因，即PRMT827。该区域包含两个半位点之间无间隔核苷酸的直接重复序列（AGGTCAAGGTCA）（图3）。为了在功能上验证所鉴定出的Hoxa1调控元件确实能够结合RAR/RXR并受RA调...

在本研究中，我们提供了一种实验流程，用于鉴定并实验验证活性增强子。

胚胎发育是一个涉及众多基因激活与抑制的多步骤过程。已知基因组中的增强子元件有助于……

本视频的总体目标是提供一套整合的方法，用于识别和实验验证基因组调控元件，即所谓的增强子。该方法有助于回答生物学事件转录与调控中的关键问题，包括在细胞分化过程中或对外部刺激响应时增强子的选择与使用。本工作流程的主要优势在于，该方案可轻松地进行调整，并适用于任何细胞模型系统。我将演示该实验步骤。首先，根据已有的ChIP-seq分析结果选择一个候选增强子。使用基因组浏览器查看目标ChIP-seq实验的结果，并鉴定目的基因附近区域的结合位点。选择定义感兴趣区域，以获得所选基因组区域的200-400个碱基对序列，并将这些序列用于后续引物设计。利用标准的分子生物学技术，扩增所选基因组区域并将其克隆到报告质粒载体中。为检测增强子活性，首先在48孔板中每孔加入200 µL 0.1%明胶溶液，然后将报告载体转染至大量胚胎干细胞中。在接种前将培养板孵育30分钟。转染前一天，将无饲养层的胚胎干细胞（ES细胞）以每孔250 µL ES培养基、密度为3×10⁴个细胞/孔的条件接种。转染当天，配制质粒混合物，每种混合物需准备足够用于8个孔的量。向每种质粒混合物中加入转染级低血清培养基，使总体积达到106微升。然后加入4.5微升ES级转染试剂，通过上下吹打15次轻轻混匀。将转染混合物在室温下孵育15分钟。孵育后，每孔加入13 µL转染混合物至细胞中，并用移液器充分混匀。随后，将细胞放回培养箱中过夜，然后再进行地衣处理。转染效率是关键步骤。若使用其他细胞类型，则此步骤需要优化。应使用最相关的细胞类型来检测增强子活性，以尽量减少依赖于细胞环境的效应。次日，小心吸除培养基，每孔加入 250 µL 含 1 µM 全反式维甲酸或以 DMSO 作为溶剂对照的新鲜培养基。将细胞孵育24-48小时。根据文本方案配制裂解缓冲液后，小心吸去细胞培养基。用1× PBS清洗细胞一次，然后每孔加入200 µL 1×裂解缓冲液。在室温下振荡细胞两小时。然后，为实现完全细胞裂解，将细胞裂解液在80摄氏度下冷冻。待裂解液完全解冻后，使用电子多通道移液器将80 µL细胞裂解液转移至96孔透明板中用于β-半乳糖苷酶检测，将40 µL裂解液转移至白色板中用于荧光素酶检测。进行β-半乳糖苷酶反应时，将1毫升β-半乳糖苷酶底物缓冲液与4毫克OMPG混合。然后向混合物中加入3.5 µL β-巯基乙醇，并立即向80 µL细胞裂解液中加入100 µL该缓冲液。将反应体系在37°C孵育，直至出现微弱的黄色。使用酶标仪在 420 纳米处读取吸光度，并导出数据。进行荧光素酶检测时，首先根据文本方案配制底物试剂，并在开始前将其升温至室温。然后，将 100 微升荧光素酶底物试剂加入含有 40 微升细胞裂解液的白色板的每个孔中。立即使用发光检测仪测量信号。从至少三次独立的转染实验中获取数据。根据文本方案对两种检测进行计算。为了通过RT-PCR设计

prediction-validation-gene-regulatory-elements-activated-during

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

预测与基因调控元件的验证激活过程中维甲酸诱导胚胎干细胞分化

我们已建立一种在特定条件下利用小分子直接从多能性人胚胎干细胞诱导生成神经母细胞的方案，该方法能够大量获得发育中中枢神经系统所需的神经前体细胞和神经元细胞类型，用于神经修复。...

利用小分子诱导高效地从多能性人胚胎干细胞分化获得人神经前体细胞与神经元

我们描述了一种荧光报告基因检测方法，可用于快速鉴定和表征调控小鼠胚胎干细胞维持与自我更新的基因。...

Oct4GiP 报告基因检测法用于研究调控小鼠胚胎干细胞维持与自我更新的基因

该视频展示了利用视黄酸和悬滴培养法诱导干细胞分化为神经前体细胞的方法。...

利用视黄酸将类胚体细胞诱导分化为神经前体细胞

本视频展示了一种评估小鼠胚胎中视黄酸活性的技术。从小鼠胚胎中分离细胞后，将这些细胞与视黄酸（RA）报告细胞共培养。胚胎细胞产生的视黄酸可诱导报告细胞中β-半乳糖苷酶的表达，从而指示胚胎细胞中存在视黄酸活性。...

利用报告细胞共培养研究小鼠胚胎细胞的视黄酸生成

报告基因细胞系提供了一种在异质性细胞群体中可视化、追踪和分离目标细胞的方法。 然而，利用传统同源重组技术在人胚胎干细胞中进行基因靶向的效率极低。本文中，我们描述了利用锌指核酸酶增强的同源重组技术，将EGFP靶向整合至中枢神经系统中脑特异性转录因子PITX3位点的方法。...

锌指核酸酶增强的人类胚胎干细胞基因靶向

在分化中的胚胎干细胞（ESCs）中调控基因的时间特异性表达，可利用诱导型基因系统实现。然而，构建此类细胞系成本较高且耗时较长。本实验方案可实现外源基因在分化中的ES来源细胞中的快速表达，并进一步分析其下游的造血分化过程。...

逆转录病毒感染小鼠胚胎干细胞衍生的拟胚体细胞以分析造血分化

本文介绍一种用于纯化已定向分化为定型内胚层的人胚胎干细胞的方法，旨在提升后续应用及进一步分化的效率。...

一种快速高效地纯化由人胚胎干细胞分化而来的内胚层细胞的方法

目前尚无能够准确测量少量组织中视黄酸（RA）水平的方法。本实验方案介绍了一种利用RA报告细胞系，对E8.5胚胎和神经球中相对RA水平进行简便、定量检测的方法。...

利用F9 RARE-LacZ细胞报告系统对E8.5胚胎和神经球培养物中相对视黄酸水平进行定量检测

我们介绍了一种利用小鼠胚胎干细胞生成二维或三维类胚体的技术。随后，我们阐述了如何通过视黄酸诱导类胚体细胞的神经分化，以及如何利用前体细胞标志物的免疫荧光染色和免疫印迹法分析其分化状态。...

二维和三维拟胚体中视黄酸诱导小鼠胚胎干细胞神经分化的分析

本文建立了一种低成本且易于操作的方法，可实现胚胎干细胞向神经元的快速高效分化。该方法适用于在各实验室中推广应用，可为神经科学研究提供有力工具。...

小鼠胚胎干细胞体外神经元分化

浸泡珠实验涉及在发育的任意时间点将测试试剂靶向递送，以研究细胞分化和形态发生的调控。本文提供了一种详细的实验方案，适用于任何实验动物模型，介绍如何制备三种不同类型的浸泡珠，并将其植入鸡胚的趾间区域。...

利用浸润珠实验分析鸡胚胎发生过程中的细胞分化、形态发生与图式形成

学习利用ChIP-seq和荧光素酶报告基因检测技术识别并验证增强子功能的方法，适用于胚胎干细胞分化研究。该流程可适配多种细胞模型系统，为基因调控研究提供可靠实验方案。

视黄酸诱导胚胎干细胞分化过程中激活的基因调控元件的预测与验证

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