预测与基因调控元件的验证激活过程中维甲酸诱导胚胎干细胞分化
June 21st, 2016
在这项工作中，我们提供了一个实验工作流程，说明如何识别和实验验证活性增强子。
本视频的总体目标是提供一套集成的方法来识别和实验验证基因组调控元件，即增强子。这种方法可以帮助回答生物事件转录和调控中的关键问题，包括增强子的选择和使用、使用细胞分化或响应外部刺激。所提出的工作流程的主要优点是协议可以很容易地适应和用于任何细胞模型系统。
我将演示该过程的步骤。首先，根据预先存在的 ChIP 序列分析选择候选增强子。使用基因组浏览器查看所需 ChIP Seq 实验的结果，并识别目标基因附近的结合位点。
选择 Define a Region of Interest 以获得所选基因组区域的 200-400 个碱基对序列，并将这些序列用于后续引物设计。使用标准分子生物学技术，将选定的基因组区域扩增并克隆到报告质粒构建体中。为了测试增强子活性，首先每孔向 48 孔板中加入 200 微升 0.1% 明胶溶液，将报告基因构建体转染到大量胚胎干细胞中。
铺板前孵育板 30 分钟。转染前一天，将无饲养层胚胎干细胞或 ES 细胞以 3 倍 10 的密度在 250 μL ES 培养基中铺板至每孔第 4 个细胞。在转染当天，准备质粒混合物，从每种混合物中制备足够 8 个孔。
向每个质粒混合物中加入转染质量降低的血清培养基，使体积达到 106 μL。然后，加入 4.5 μL ES 品质转染试剂，上下吹打 15 次，小心混匀。在室温下孵育转染混合物 15 分钟。
孵育后，向细胞中加入每孔 13 μL 的转染混合物，并通过移液充分混合。然后，在地衣处理前将细胞放回培养箱中过夜。转染效率是一个关键步骤。
如果使用其他单元格类型，则此步骤需要优化。使用最相关的细胞类型来测试增强子活性，以最大限度地减少上下文依赖性影响。第二天，通过抽吸小心地去除培养基，并在每孔中加入 250 微升新鲜培养基，其中含有 1 微摩尔全反式维甲酸或 DMSO 作为载体。
将细胞孵育 24-48 小时。根据文本方案制备裂解缓冲液后，小心地从细胞中吸出培养基。使用 1X PBS 使细胞升起一次，然后每孔添加 200 μL 1X 裂解缓冲液。
在室温下摇动细胞 2 小时。然后，为了完全裂解细胞，将板中的细胞裂解物在 80 摄氏度下冷冻。完全解冻裂解物后，使用电子多通道移液管将 80 μL 细胞裂解物转移到 96 孔透明板中，用于 β 半乳糖苷酶，将 40 μL 裂解物转移到白色板中，用于荧光素酶测量。
为了进行 β 半乳糖苷酶，将 1 毫升 β 半乳糖苷底物缓冲液与 4 毫克 OMPG 混合。然后，向混合物中加入 3.5 μL β 巯基乙醇，并立即向 80 μL 细胞裂解物中加入 100 μL 缓冲液。在 37 摄氏度下孵育反应，直到出现淡黄色。
在读板器上读取 420 纳米处的吸光度，并导出数据。为了进行荧光素酶测定，在根据文本方案制备底物试剂后，在开始前将荧光素酶底物试剂加热至室温。然后，将 100 μL 吸取到含有 40 μL 细胞裂解物的白色板的每个孔中。
立即使用发光计数器机测量信号。从至少 3 个独立的转染和实验中获得活性。根据文本协议对两种分析进行计算。
为了设计用于通过 RTCPR 检测 eRNA 的引物，请选择距离任何注释基因转录本至少 1.5 至 2 千克碱基的基因组区域。确定基因的相对方向，并确定正义和反义转录本的位置。要设计用于增强子 RNA 定量的引物，请从转录因子结合位点中心选择 200-1， 000 个碱基对的区域。
如果基因位于负链上，则复制正链的 200-300 个碱基对并转换序列以获得反向补体序列。然后，将此序列用于后续的引物设计。将 Product Size Range （商品尺寸范围） 设置为 80-150 个碱基对。
为了测量 eRNA 转录，根据文本方案从处理的细胞中分离总 RNA 后，使用标准程序通过 RTCPR 检测逆转录的 eRNA。测量非处理依赖性 mRNA 以进行标准化。如图所示，对从用视黄酸处理的 ES 细胞获得的 RXR 芯片 seq 数据的生物信息学分析揭示了 RXR 占据位点下核受体半位点的富集。
使用生物信息学算法，将半位点的基序搜索结果映射回 RXR 芯片 seq 数据。该分析确定了与经典核受体结合位点重叠的 ChIP 峰。IGV 中位点的可视化表明转录因子在 Hoxa1 附近富集。
先前表征的 RAR RXR 靶标。还确定了新型 RA 靶链 PRMT8 的惩罚性增强子。将鉴定的增强子区域克隆到 TK 荧光素酶报告基因载体中，并用这些构建体转染 ES 细胞。
在不存在和存在 RA 的情况下测量荧光素酶活性。含有 RA 反应元件或 RARE 的构建体在 RA 处理后显示荧光素酶信号强度增加，而没有 RARE 的构建体未被诱导。为了确定 Hoxa1 RAR RXR 结合增强子的正义和反义 eRNA 表达是否与基因的 mRNA 表达相关，还测量了 Hoxa1 eRNA 的水平。结果证实，短期 RA 治疗诱导增强子活性。
一旦掌握，通过进行所描述的增强子陷阱实验和增强子定量，可以在几天内完成这项工作，可以为增强子活性提供强有力的功能证据。观看此视频后，您应该对如何识别和表征惩罚性增强剂有很好的了解。一旦鉴定并验证了增强子，就可以执行其他方法，例如染色体确认捕获或 CCC，以回答其他重要问题，例如经过验证的增强子调节哪个基因？
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概览
本视频介绍了一套综合方法，用于识别和验证被称为增强子的基因组调控元件。它强调了工作流程对各种细胞模型系统的适应性。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因组调控元件
- 增强子识别
- 细胞模型系统
背景
- 增强子在基因调控中扮演着关键角色。
- 理解增强子选择对于研究转录至关重要。
- 细胞分化和对刺激的反应可以受到增强子的影响。
- ChIP-seq分析有助于识别候选增强子。
研究目的
- 提供增强子识别和验证的工作流程。
- 促进转录和基因调控研究。
- 展示该协议在不同细胞模型中的适应性。
使用的方法
- 基于ChIP-seq数据选择候选增强子。
- 利用基因组浏览器分析结合位点。
- 通过实验验证增强子活性。
- 适应不同细胞系统的方法。
主要结果
- 在不同背景下识别活性增强子。
- 通过实验方法验证增强子功能。
- 展示工作流程的多功能性。
- 对细胞分化过程中增强子使用的洞察。
结论
- 所呈现的工作流程对增强子研究有效。
- 它可以适应各种实验设置。
- 增强子识别对于理解基因调控至关重要。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate prediction and validation of gene regulatory elements, such as enhancers, are critical for de-risking early discovery and clarifying gene function during cell fate transitions. This workflow integrates ChIP-seq data analysis with functional reporter assays and eRNA quantification, enabling robust target validation and mechanistic insight in disease-relevant stem cell models. The protocol's adaptability supports portfolio-wide application across diverse cellular systems, enhancing translational continuity and predictive confidence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic identification of functional enhancers regulating gene expression during differentiation.
- Supports mechanistic de-risking by linking regulatory elements to transcriptional outcomes.
- Facilitates functional target validation through quantitative reporter and eRNA assays.
- Improves predictive confidence for gene regulatory hypotheses in stem cell models.
Screening & Assay Development
- Establishes validated reporter assays for enhancer activity measurement in relevant cell types.
- Standardizes quantitative outputs for cross-condition and cross-experiment comparison.
- Enables reproducible screening of regulatory element function under defined stimuli.
- Supports scalable assay development for high-throughput enhancer validation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns enhancer validation with disease-relevant differentiation models for translational insight.
- Provides continuity from discovery-stage regulatory mapping to preclinical functional studies.
- Enables risk-adjusted advancement of gene targets based on validated regulatory control.
- Supports biomarker development through eRNA quantification linked to gene activation.
Pipeline & Workflow Integration
This integrated workflow bridges early discovery, target validation, and preclinical research by combining genomic, molecular, and functional assays in stem cell differentiation systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of enhancer function and pathway regulation during cell fate transitions.
- Screening: Provides standardized, quantitative reporter assays for enhancer activity across conditions.
- Analytics: Delivers quantitative luciferase and eRNA readouts for robust statistical comparison.
- Translational Research: Connects regulatory element validation to disease-relevant gene expression changes.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to any cellular model, supporting broad R&D deployment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene regulation studies.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible, and scalable enhancer validation workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk through validated regulatory insights.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of gene targets based on functional regulatory evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, reporter assays, and quantitative PCR.
- Needs access to ChIP-seq data, genome browsers, and plate-based detection instruments.
- Demands cross-team standardization for assay setup and data analysis.
- Adaptable to various cell types but may require optimization for transfection efficiency.
- Dependent on quality of genomic annotations and bioinformatics support for region selection.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:45
Enhancer Selection Based on ChIP-seq Analysis
1:27
Transfection of Embryonic Stem Cells
3:21
β-Galactosidase and Luciferase Assays
5:19
Characterization of Enhancer RNA and Measurement of eRNA Transcription
6:34
Results: Retinoic Acid Induced Enhancer Activation in Embryonic Stem Cells
8:13
Conclusion
