视黄酸诱导胚胎干细胞分化过程中激活的基因调控元件的预测与验证

本视频的总体目标是提供一套整合的方法，用于识别和实验验证基因组调控元件，即所谓的增强子。该方法有助于回答生物学事件转录与调控中的关键问题，包括在细胞分化过程中或对外部刺激响应时的增强子选择与利用。本工作流程的主要优势在于，该方案可轻松地被修改并应用于任何细胞模型系统。

我将演示该实验步骤。首先，根据已有的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析结果选择一个候选增强子。使用基因组浏览器查看目标 ChIP-seq 实验的结果，并在目的基因附近识别出结合位点。

选择定义感兴趣区域，以获得所选基因组区域的200-400个碱基对序列，并将这些序列用于后续引物设计。利用标准的分子生物学技术，扩增所选基因组区域并将其克隆至报告质粒载体中。为检测增强子活性，首先在48孔板中每孔加入200 µL 0.1%明胶溶液，然后将报告载体转染至大量胚胎干细胞中。

在接种前将培养板孵育30分钟。转染前一天，将无饲养层的胚胎干细胞（ES细胞）以每孔250 µL ES培养基、密度为3 × 10⁴ 个细胞/孔的条件接种。转染当天，配制质粒混合物，每种混合物需准备足够用于8个孔的量。

向每种质粒混合物中加入转染级低血清培养基，使总体积达到106微升。然后加入4.5微升ES级转染试剂，通过上下吹打15次轻轻混匀。将转染混合物在室温下孵育15分钟。

孵育后，向每孔细胞中加入13 µL转染混合物，并通过移液充分混匀。随后，将细胞放回培养箱中过夜，然后再进行地衣处理。转染效率是关键步骤。

若使用其他细胞类型，则此步骤需要优化。应使用最相关的细胞类型来检测增强子活性，以尽量减少依赖于细胞环境的效应。次日，小心吸除培养基，每孔加入 250 µL 含 1 µM 全反式维甲酸或等量 DMSO（对照溶剂）的新鲜培养基。

将细胞孵育24-48小时。根据文本方案配制裂解缓冲液后，小心吸去细胞中的培养基。用1× PBS清洗细胞一次，然后每孔加入200 µL 1×裂解缓冲液。

在室温下振荡细胞两小时。随后，为实现完全的细胞裂解，将细胞裂解液在80摄氏度条件下冷冻。待裂解液完全解冻后，使用电子多通道移液器将80 µL细胞裂解液转移至96孔透明板中用于β-半乳糖苷酶检测，将40 µL裂解液转移至白色板中用于荧光素酶检测。

进行β-半乳糖苷酶反应时，将1毫升β-半乳糖苷酶底物缓冲液与4毫克OMPG混合。然后向混合物中加入3.5微升β-巯基乙醇，并立即向80微升细胞裂解液中加入100微升该缓冲液。将反应体系在37°C孵育，直至出现微弱的黄色。

使用酶标仪在 420 纳米处读取吸光度，并导出数据。进行荧光素酶检测时，首先根据文本方案配制底物试剂，然后在开始前将荧光素酶底物试剂恢复至室温。接着，将 100 微升试剂加入含有 40 微升细胞裂解液的白色板的每个孔中。

立即使用发光检测仪测量信号。从至少三次独立的转染和实验中获取活性数据。根据文本方案对两种检测进行计算。

为了通过RT-PCR检测eRNA而设计引物，应选择距离任何已注释基因转录本至少1.5至2千碱基的基因组区域。确定基因的相对方向，并明确正义链与反义链转录本的位置。为增强子RNA定量设计引物时，应选择距离转录因子结合位点中心200至1,000个碱基对的区域。

如果该基因位于负链上，则复制正链的200-300个碱基对，并将序列转换为反向互补序列，然后使用该序列进行后续的引物设计。将产物大小范围设置为80-150个碱基对。

为了检测eRNA转录，在根据文本方案从经处理的细胞中分离总RNA后，采用标准程序通过RT-qPCR检测逆转录的eRNA。选择一种不受处理影响的mRNA作为归一化对照。如下所示，对经视黄酸处理的胚胎干细胞获得的RXR染色质免疫沉淀测序数据进行生物信息学分析，结果显示在RXR占据的位点下方富集了核受体半位点序列。

利用生物信息学算法，将半位点的基序搜索结果回贴至RXR芯片测序数据。该分析鉴定出与经典核受体结合位点重叠的芯片峰。在IGV中对这些位点进行可视化，显示转录因子在Hoxa1附近富集。

一个先前已表征的RAR-RXR靶标。此外，还鉴定出一种针对新型RA靶基因PRMT8的增强子。所鉴定的增强子区域被克隆至TK荧光素酶报告载体中，并将这些构建体转染至ES细胞。

在有无视黄酸（RA）的条件下检测了荧光素酶活性。含有视黄酸反应元件（RARE）的构建体在RA处理后荧光素酶信号强度增加，而缺乏RARE的构建体则未被诱导。为了确定Hoxa1基因的RAR-RXR结合增强子的正义和反义增强子RNA（eRNA）表达是否与该基因的mRNA表达相关，也检测了Hoxa1 eRNA的水平。结果证实，增强子活性可被短期RA处理所诱导。

一旦掌握，通过开展所述的增强子捕获实验及增强子定量分析，可在数天内完成该工作量，并为增强子活性提供强有力的功能性证据。观看本视频后，您应能充分理解如何鉴定和表征功能性增强子。在鉴定并验证一个增强子后，还可进一步采用其他方法，如染色体构象捕获技术（CCC），以回答更多重要问题，例如：该已验证的增强子调控了哪个基因？