Name: 心肌细胞DNA的合成和倍性的同时评价:一个方法来帮助心肌细胞再生和营业额的量化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: 学习利用EdU核苷标记和流式细胞术同时评估心肌细胞DNA合成与倍性变化的方法。该技术可精确量化新生心肌细胞核生成，适用于心肌再生与细胞周转研究。

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本工作由英国心脏基金会资助，项目编号 PG/13/69/30454。

动物实验已获得纽卡斯尔大学伦理审查委员会的授权和批准。所有动物实验操作均遵循欧洲议会关于用于科学目的动物保护的第2010/63/EU号指令的指南。
1. EdU 给药
<ol>
	<li>将EdU溶解于无菌生理盐水（0.9% w/v）中，终浓度为12.5 mg/ml。
	<ol>
		<li>将溶液加热至40 °C，并涡旋以完全溶解。将足够量的EdU/生理盐水溶液储存于4 °C，用于对研究中所有小鼠进行连续6天的每日注射。 
		注意：每个实验组通常需要超过6只小鼠。然而，独立研究应进行功效计算。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>称量每只小鼠的体重。计算每只小鼠所需注射的EdU/生理盐水溶液体积，剂量为100 µg/g（每克体重注射8 µl的EdU储备液）。</li>
	<li>用25 G针头的胰岛素注射器吸取相应体积的EdU/生理盐水溶液。</li>
	<li>按照英国政府内政部批准的操作技术抓取小鼠，进行腹腔内（i.p.）注射。
	<ol>
		<li>将小鼠置于笼盖上。轻轻向后拉尾根部，并牢固抓住小鼠颈部皮肤。</li>
		<li>用食指和拇指握住小鼠头部基部附近，将动物头部向后下方倾斜，以暴露腹部注射区域。</li>
		<li>用70%酒精溶液擦拭腹部。确定动物腹中线及右下腹区域，并将EdU/生理盐水溶液注射至右下腹区域。</li>
		<li>对小鼠注射EdU/生理盐水溶液，并记录注射时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>连续6天，在每天相同时间重复步骤1.2至1.4。 
		注意：由于流式细胞分析设门需要EdU阴性对照，需额外注射一只年龄、性别及实验条件相匹配的小鼠，注射等体积不含EdU的生理盐水。此即为所需的阴性对照（无EdU对照）。每次实验均应包含该对照，以校正试剂批次和流式细胞仪设置可能带来的变异。</li>
</ol>
2. 心脏收获
<ol>
	<li>6 小时后 24 小时th EdU 注射后，采用颈椎脱位法（或其它英国 Home Office 认可的 1 类安乐死方法）处死小鼠。</li>
	<li>将处死的动物置于仰卧位，用手术剪从腹部中线至横膈膜处做皮肤切口。</li>
	<li>剪开膈肌，将胸骨远离体腔并固定，沿两侧剪开以暴露心脏。</li>
	<li>轻轻抬起心脏，剪断流出道的主要血管，将心脏从胸腔中分离取出。</li>
	<li>立即将每颗心脏放入含有10 ml预冷PBS的15 ml离心管中 4 °C.</li>
	<li>将心脏转移至不同的10 cm培养皿中，用解剖刀沿矢状方向将每颗心脏切成两半，并用镊子轻轻挤压以清洗心脏。随后更换PBS以尽可能去除血液。重复此步骤两次。</li>
	<li>将每颗心脏的两部分均放入同一个 1.5 ml 微离心管中。</li>
	<li>继续执行步骤3，或 alternatively 储存样本 -80 °C 如步骤 2.9 和 2.10 所述。</li>
	<li>使用25 G针头在微量离心管盖上扎一个小孔，以防止心脏组织处理过程中因气体膨胀导致管盖打开。</li>
	<li>将每个微量离心管标记后放入液氮容器中冷冻。</li>
</ol>
3. 细胞核解离与心肌细胞核标记
注意：该细胞核解离与心肌细胞核标记方法改编自 Bergmann et al.11。应对所有注射过 EdU 及生理盐水（无 EdU 对照）的样本执行此操作。所需溶液的配制方法见表 1。
<ol>
	<li>针对每颗待分析的心脏组织，将 36 ml 的 1% BSA/PBS 溶液加入超速离心管中，孵育 30 分钟，弃去溶液后置于空气中干燥。 
	注意：该管将在步骤 3.6 中使用。</li>
	<li>将单个冷冻的心脏组织置于冰上的 10 mm 培养皿中，使用解剖刀进行切碎处理，并在切碎过程中使其逐渐解冻。</li>
	<li>将切碎的心脏组织转移至含有 15 ml 细胞裂解缓冲液的 50 ml 离心管中，在室温下使用探头式匀浆器以 25,000 rpm 匀浆 15 秒。</li>
	<li>向离心管中再加入 15 ml 细胞裂解缓冲液，转移至 40 ml 玻璃匀浆器中，使用大间隙研杵进行 10 次研磨，随后依次通过 100 µm 和 40 µm 细胞筛过滤，收集滤液至 50 ml 离心管中。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 700 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将核沉淀物重悬于 25 ml 蔗糖梯度溶液中，并将含有细胞核的溶液小心铺加在已准备好的超速离心管（步骤 3.1 制备）中 10 ml 新鲜蔗糖梯度溶液的上层。</li>
	<li>使用摆动转子转头，在 4 °C 条件下以 13,000 × g 离心 1 小时。</li>
	<li>离心结束后，弃去上清液，将核沉淀物重悬于 1.5 ml 微量离心管中的 1,300 µl 核储存缓冲液中，并标记为 PCM1。</li>
	<li>取 300 µl 上述悬液转移至新的微量离心管中，加入 700 µl 新鲜核储存缓冲液，将此管标记为 ISO 对照管。</li>
	<li>向标记为 PCM1 的微量离心管中加入抗-PCM1 抗体，终浓度为 8 µg/ml；向标记为 ISO control 的微量离心管中加入兔 IgG 同型对照抗体，浓度为 8 µg/ml。</li>
	<li>在 4 °C 条件下孵育过夜。孵育结束后，以 700 × g 离心 10 分钟，弃去上清液，加入 1 ml 新鲜核储存缓冲液重悬，再次以 700 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，再加入 1 ml 新鲜核储存缓冲液。</li>
	<li>加入 1 µl 羊抗兔 IgG (H+L) 抗体 F(ab')2 片段（FITC 或等效绿色荧光染料），使终浓度达到 2 µg/ml。 
	注意：使用 F(ab')2 片段抗体可降低对免疫细胞（包括巨噬细胞和 B 细胞）的非特异性标记风险。</li>
	<li>用铝箔包裹离心管以避光，于 4 °C 孵育 1 小时。</li>
</ol>
4. EdU 掺入的检测
<ol>
	<li>用去离子水将10倍浓缩的EdU反应缓冲液按1:10稀释。</li>
	<li>将标记有PCM-1和ISO对照的细胞核悬浮液在700 × g下离心10分钟，弃去上清液，并将细胞核沉淀重悬于1 ml的1% BSA/PBS溶液中。洗涤细胞核沉淀两次。</li>
	<li>最后一次洗涤后，弃去上清液，加入100 µl EdU固定剂。</li>
	<li>用铝箔包裹管子以避光，室温孵育15分钟。</li>
	<li>用1 ml的1% BSA/PBS溶液洗涤样品两次，每次在700 × g下离心，然后在室温下用1×皂苷类通透溶液孵育15分钟。</li>
	<li>配制1× EdU标记混合液（见材料表）。至少需要进行两次反应，以包括无EdU的对照组。</li>
	<li>将500 µl的1× EdU标记混合液直接加入已含有细胞核的样品中（样品中含100 µl的1×皂苷类通透溶液），避光室温孵育30分钟。</li>
	<li>在700 × g下离心，用1 ml的1% BSA/PBS重悬，重复此步骤两次。</li>
	<li>在700 × g下离心，弃去上清液，加入400 µl DNA染色溶液（见材料表）。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>试剂名称</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1. 细胞裂解缓冲液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.32 M 蔗糖</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH = 8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mM CaCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mM 醋酸镁</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mM EGTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. 蔗糖梯度溶液</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.1 M 蔗糖</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH = 8)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mM 醋酸镁</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mM DTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. 细胞核储存缓冲液 (NSB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.44 M 蔗糖</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris-HCl (pH = 7.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mM KCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM MgCl2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mM 精胺</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：细胞核分离缓冲液成分。 本方案第3节（细胞核解离与心肌细胞核标记）中所用所有缓冲液的配方。
5. 流式细胞术分析
注意：按照先前所述方法对分离的细胞核进行流式细胞术分析7,11,15。
<ol>
	<li>首先，创建一个描述前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）的图，以区分细胞核与碎片（图 2A）。</li>
	<li>通过绘制 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）面积（3-405/450/50-A）与高度（33-405/450/50-H）的关系图，以区分单个细胞核与聚集体（图 2B）。确保 3-405/450/50-A 信号采集于线性尺度，以便准确测定DNA含量。</li>
	<li>创建一个描述 488/535/30-A（PCM-1）与 SSC 的图，并仅显示来自步骤 5.2 中建立的单细胞门控的事件，以评估单细胞群体中 PCM-1 的表达情况。</li>
	<li>运行同型对照样本，以建立 PCM-1 阳性门控（图 2C）。运行少量 PCM1 标记样本，以验证 PCM1 表达细胞群及其门控位置。</li>
	<li>创建一个描述 SSC-A 与 405/450/50-A（用于检测 DAPI）的图。在此图中，仅显示来自步骤 5.3 所建立门控的单细胞 PCM1 表达细胞核。利用此图建立一个额外的层级门控，仅包含 2N 细胞核（图 2D）。</li>
	<li>创建一个描述 488/535/30-A 与 1-633/660/20-A 的图，以识别 PCM1 表达心肌细胞群体中的 EdU 标记情况。仅显示通过上述门控确定的单细胞、PCM1+ 且为 2N 的细胞核。</li>
	<li>运行未添加 EdU 的心脏对照样本，以设定 EdU 阳性门控（图 2E）。为 EdU+ 细胞创建适当的门控。</li>
	<li>记录并定量单细胞、PCM-1 表达、2N 且已掺入 EdU 的细胞核。</li>
	<li>将该细胞群数量计算为总单细胞 PCM1+ 细胞核的百分比。该数值表示在为期 7 天的 EdU 脉冲期间，新生心肌细胞核生成速率占总心肌细胞核的百分比。 
	注意：由于 DAPI 与 DNA 的结合是化学计量的，其荧光强度与 DNA 含量成正比。可根据 405/450/50-A 信号的强度确定倍性，方法如前所述7。</li>
	<li>为评估总心肌细胞群体内的倍性，使用步骤 5.5 中建立的图及基于 DNA 浓度的门控策略7。</li>
</ol>
<img alt="流式细胞术散点图和直方图显示细胞周期分析和PCM1标记结果。" src="/files/ftp_upload/53979/53979fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2：心肌细胞EdU掺入和倍性的定量门控策略。 (A) 根据前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）将细胞核与碎片区分开来。B) 基于DAPI标记以及405/450/50高度与面积信号，创建线性门以鉴定单细胞核群体。C荧光门控技术可实现从心脏组织中分离心肌细胞核（PCM-1阳性）与非心肌细胞核（PCM-1阴性）。DDAPI信号强度用于确定DNA浓度，从而判断PCM1+心肌细胞群体的细胞核倍性。在小鼠中 &gt;80%的心肌细胞核为二倍体（2n）。E荧光门控可将已掺入EdU的2N心肌细胞核（PCM+/EdU+ = 0.9%）与未掺入EdU的2N心肌细胞（PCM+/EdU-）区分开来。所有步骤均在方案5.0中详细说明。示例来自mdx模型。-/y C57/BL10 背景小鼠 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/53979fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

为了准确量化心肌细胞的更新与再生，相关实验必须能够区分真正的心肌细胞生成与非生产性DNA复制事件。目前许多研究仍简单地忽略这些非生产性事件，仅通过细胞周期蛋白、胞质分裂及细胞周期标志物的表达来量化心肌细胞增殖。迄今为止，仍缺乏一种能够在排除非生产性事件干扰的前提下，准确量化心肌细胞更新的单一方法。特别是心肌细胞多倍体现象仍难以被充分考量，其可占心肌细胞DNA复制事件的约65%13。因此，为协助准确量化心肌细胞生成，我们开发了一种实验方案，可在排除导致倍性增加的DNA复制事件的基础上，稳健地量化新生心肌细胞核的生成速率。尽管该方案无法区分新生心肌细胞的生成与心肌细胞双核化现象，但其可快速且准确地计算出心肌细胞生成的上限值（已计入倍性因素）。因此，该方案可作为一种筛选工具，用于评估疾病模型中心肌细胞生成与多倍化速率的潜在变化，或用于评价治疗手段的潜在效率。一旦通过本方案识别出新生心肌细胞核生成速率的变化，后续研究可进一步确定该变化是源于心肌细胞生成数量的改变，还是心肌细胞核化数量的变化，如先前研究所述2,13,17,18。这些后续分析包括在脉冲标记期间通过组织学方法量化心肌细胞核化动态，或分析EdU脉冲标记动物组织切片，以比较单核与多核心肌细胞群体中EdU的掺入情况。
由于心肌细胞更新率较低，本方案采用在7天内进行多次EdU注射。这也使得 &#34;追逐&#34; 所有潜在心肌细胞来源的心肌细胞生成情况，并允许对这一时间段内累积的心肌细胞核生成量进行定量分析。根据具体研究需求，该时间范围可进行调整，以适应预期的心肌细胞生成水平。为了准确量化EdU在心肌细胞核中的掺入情况，必须确保用于检测PCM-1反应性的二抗不会对细胞核产生非特异性标记。因此，建议开展额外的二抗滴定实验，以优化本方案中的这一环节，特别是在使用本方案未推荐的二抗时更应如此。本方案采用PCM-1表达来鉴定心肌细胞核。尽管PCM-1是已被公认的心肌细胞标志物，但仍可使用其他标志物对数据进行验证，例如特异性针对心肌肌钙蛋白T（cardiac Troponin T）的抗体，该蛋白已被证实部分定位于心肌细胞核1同样，可使用其他定位于细胞核的蛋白来鉴定和定量非心肌细胞群体中的EdU掺入。分析时必须排除所有正处于有丝分裂阶段的心肌细胞核，因为这些细胞中DNA合成的最终命运尚不明确，可能导致细胞分裂或倍性增加。PCM1在细胞周期的M期会发生解聚，因此正在进行有丝分裂的心肌细胞不会被PCM1表达所识别。此外，细胞周期S期的所有细胞核也应从后续分析中排除。这可通过设门排除DAPI荧光强度高于2N峰的细胞核实现，包括DAPI强度介于2N与4N峰之间的细胞核。
尽管目前越来越被接受的观点是心脏在正常衰老过程中以及急性损伤后具有替换心肌细胞的能力，但这种再生能力的来源及其程度仍存在争议。此外，已有研究报道了不同的心肌细胞更新速率1,7,20-22。这在一定程度上可能是由于准确识别和定量新生心肌细胞生成存在困难所致19。迄今为止，大多数研究仅依赖组织学分析，并通过检测包括肌节蛋白在内的胞质蛋白表达来鉴定心肌细胞，从而量化心肌细胞的更新与再生2,4,23,24。使用这些方法检测增殖标志物的表达，或如本研究中所示，检测胸苷类似物的掺入，都可能容易将其他心脏细胞类型误判为心肌细胞。虽然三维共聚焦成像技术有助于缓解这些问题，但这些方法成本高昂且耗时。有趣的是，本文所述方案显示，新生心肌细胞核的生成速率为每周0.17%。这一结果与其他基于流式细胞术的研究一致，后者显示每周更新率可达0.13%5。尽管根据这些数据推算年度更新率具有吸引力，并且在以往研究中已有尝试2,5,25,26，但这种外推并不恰当，因为心肌细胞的更新速率在整个动物生命周期中是动态变化的13。
该方法具有多种潜在应用，包括评估促进心肌细胞再生的潜在治疗手段，或研究心脏疾病对心肌细胞更新及心肌细胞多倍体化速率的影响。

近年来，越来越多的证据表明心脏并非终末分化的有丝后器官，这一传统观点正受到挑战1,2。然而，心肌细胞更新与再生的定量分析仍然具有挑战性。
使用标准免疫组织化学技术精确鉴定罕见的心肌细胞生成现象存在诸多困难，已有大量文献报道3。此外，心肌细胞生成的细胞来源仍不明确，现有证据表明心肌细胞增殖和干细胞分化均可能参与其中4-6。因此，依赖于已知心肌细胞前体表型的谱系示踪模型无法应用，而对包括心肌细胞在内的单一细胞群体的增殖进行量化也是不恰当的。此外，心肌细胞可能发生核内复制而不伴随核分裂（导致多倍体心肌细胞），或发生核分裂但不伴随胞质分裂（导致双核心肌细胞）7,8。准确量化心肌细胞更新依赖于区分这些事件与真正的心肌细胞新生。这带来了独特的挑战，因为心肌细胞中DNA复制以及周期蛋白依赖性激酶的表达并不能特异性地反映真正的细胞分裂9,10。
为了辅助新生心肌细胞生成的定量分析，我们将一种已建立的细胞核分离技术与针对中心粒周围物质1（PCM1）的免疫标记方法相结合，用于心肌细胞核的鉴定，该方法由Bergmann 等7,11先前描述，并进一步整合了长期DNA标记和倍性分析的新技术。PCM-1是一种中心体蛋白，可在已分化的非增殖性心肌细胞的核膜表面富集。既往研究表明，抗PCM-1抗体可特异性地标记心肌细胞核7,11，因此PCM1已被多个独立研究团队用于心肌细胞的鉴定1,12,13。此外，我们已证实PCM1的表达在TnT-cre转基因小鼠模型中与基因标记的心肌细胞核完全对应14（补充图1）。
本方案可准确且灵敏地鉴定小鼠心脏中新生成的心肌细胞核，无论其细胞来源如何（图1A 和 B），同时在分析中排除因多倍化引起的核苷标记干扰（图1C 和 D）。尽管该方法无法控制心肌细胞双核化的影响，但它能够快速且可靠地定量新生成的心肌细胞核，这对于准确量化心肌细胞更新至关重要。此外，该方法还提供了一种快速筛选工具，用于评估心肌细胞生成动力学中潜在的变化。
虽然DNA标记通常使用5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）作为胸苷类似物，但本文所述方案采用基于5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）的检测方法，因其所需处理步骤更少，通量更高，且无需对DNA进行变性即可进行免疫检测，因此可与其他免疫染色方案兼容，从而拓展了该方法的潜在下游应用。
<img alt="心肌细胞增殖、前体细胞分化、内复制示意图；流式细胞术方法。" src="/files/ftp_upload/53979/53979fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：持续EdU脉冲标记可标记新生心肌细胞，无论其来源前体细胞如何。（A）EdU在细胞分裂过程中被整合到心肌细胞的DNA中。心肌细胞群体的增殖将导致心肌细胞数量的增加或替换，因此属于有效的DNA合成（有助于组织维持与修复）。（B）EdU在心脏前体细胞分裂过程中被整合至其DNA中，并在这些细胞向心肌细胞谱系分化时保留在细胞内。此类干细胞分化同样会增加心肌细胞数量，因而有助于组织维持与修复。（C）心肌细胞可能发生“非有效”DNA复制，导致心肌细胞倍性升高，这一过程与心肌细胞肥大及心肌重塑相关，但并不能替代丢失的心肌细胞。多倍体化过程不同于双核化，其结果是形成一个具有单个细胞核的心肌细胞，该细胞核含有四套或更多套同源染色体（>2N）。（D）在持续核脉冲标记后，本方案描述了心肌细胞核的分离，并通过PCM1表达来鉴定心肌细胞核，从而实现对心肌细胞倍性和EdU掺入情况的定量分析。PCM1表达与EdU掺入通过流式细胞术进行检测。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/53979fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>0.32 M 蔗糖</td><td>Sigma</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl (pH = 8)</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>5 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>c5086</td><td></td></tr><tr><td>5 mM 醋酸镁</td><td>sigma</td><td>M-5661</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mM EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mM EGTA</td><td>Sigma</td><td>63779</td><td></td></tr><tr><td>1 mM DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>70 mM KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>10 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mM 精胺</td><td>Sigma</td><td>85590</td><td></td></tr><tr><td>同型兔 IgG- ChIP 级</td><td>abcam</td><td>abc7415</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 PCM-1 抗体</td><td>Sigma</td><td>HPA023374</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 F(ab')2 片段山羊抗兔 IgG (H+L) 抗体&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>A-11070</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛网&amp;nbsp; 70 &amp;mu;m 和 100 &amp;mu;m&amp;nbsp;</td><td>Fisher scientific</td><td>11597522, 11517532</td><td></td></tr><tr><td>玻璃Dounce匀浆器（40 ml）及大间隙研杵</td><td>Sigma</td><td>D9188-1SET</td><td></td></tr><tr><td>EdU (5-乙炔基-2&amp;rsquo;-脱氧尿苷)</td><td>Life technologies</td><td>A10044</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 流式细胞术检测试剂盒</td><td>Life technologies</td><td>C10634</td><td>该试剂盒包含&amp;nbsp;实验所需的试剂、EdU反应缓冲液&amp;nbsp;、EdU固定剂、基于皂苷的通透化溶液以及EdU标记混合物所需的试剂。</td></tr><tr><td>CyStain DNA 两步法试剂盒</td><td>Sysmex Partec</td><td>05 5005</td><td>该试剂盒包含&amp;nbsp;DAPI标记（DNA染色溶液）所需的试剂</td></tr><tr><td>探头式匀浆器，&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，TissueRuptor</td><td>Qiagen</td><td>9001273</td><td></td></tr><tr><td>TissueRuptor 一次性探头</td><td>Qiagen</td><td>990890</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Sorvall&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Facscanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>超速离心管，薄壁，聚丙烯，38.5 ml，25 x 89 mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr></tbody></table>

同时评估心肌细胞dna合成与倍性：一种辅助量化心肌细胞再生与更新的方法

Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover

尽管目前公认心脏在损伤后具有有限的心肌细胞再生能力，并且在正常衰老过程中存在低水平的心肌细胞更新，但对这些事件的定量仍然具有挑战性。部分原因在于该过程极为罕见，且多种细胞来源共同参与心肌的维持。此外，心肌细胞内的DNA复制常常导致细胞变为多倍体，而极少通过细胞分裂产生新的心肌细胞。因此，为了准确量化心肌细胞的更新，必须能够区分这些不同的过程。本文所述的方案采用长期核苷标记法，以标记所有因DNA复制而产生的细胞核，并结合细胞核分离及随后的PCM1免疫标记来鉴定心肌细胞核。该组合方法可实现对心肌细胞核群中核苷标记的准确且灵敏的识别。此外，通过4′,6-二脒基-2-苯基吲哚标记及细胞核倍性分析，可将新生成的心肌细胞核与在多倍化过程中掺入核苷的细胞核区分开来。尽管该方法无法控制心肌细胞双核化的影响，但其能够在考虑多倍化的基础上，快速且可靠地量化新生心肌细胞核。该方法具有多种下游应用，包括评估促进心肌细胞再生的潜在治疗手段，或研究心脏疾病对心肌细胞更新及倍性的影响。该技术还可与其它下游免疫组织化学技术兼容，从而实现对所有心脏细胞类型中核苷掺入的定量分析。

该方法可在控制多倍体化增加的前提下，定量评估因心肌细胞核分裂导致的EdU掺入增加。我们此前利用基于BrdU的检测方法证明，在杜氏肌营养不良症的mdx小鼠模型中，哺乳动物心脏会对慢性心肌细胞丢失产生响应，并再生新的心肌细胞。我们已使用本文所述方法进一步验证了此前发表的研究结果，并展示了该实验方案的实用性。根据所描述的方案，成年（12周龄）mdx小鼠和对照bl10小鼠连续7天每日注射一次EdU，此前研究报道该方案可实现实验组之间的静态分析5,13。对EdU脉冲标记心脏进行免疫组织化学分析，结果显示存在表达PCM1且掺入EdU的心肌细胞（图3A）。然而，免疫组织化学方法获得的数据可能被误读，因为其他掺入EdU的细胞类型可能被错误鉴定为心肌细胞，这一点在补充图1A和B中有所展示。此外，免疫组织化学方法无法区分多倍体化与核分裂。本方案中详述的流式细胞术分析能够快速定量mdx小鼠与对照小鼠中心肌细胞核分裂情况，同时排除因多倍体化而掺入EdU的细胞。与先前发表的数据相似13，分析结果显示，与年龄匹配的对照组相比，mdx小鼠心脏中新心肌细胞核生成率显著升高（1.2% 对比 0.17%；图3B和C）。
<img alt="通过荧光显微镜与流式细胞术图分析野生型与mdx型心脏中PCM1及EdU掺入情况。" src="/files/ftp_upload/53979/53979fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3： 野生型与mdx 心脏中EdU标记的心肌细胞定量分析。（A）来自40 µm厚mdx心脏切片的Z轴层扫描投影图像。表达PCM-1的心肌细胞核（绿色）已掺入EdU（红色）。黄色箭头指示EdU标记的心肌细胞。i 和 ii 表示Z平面中显示的单个EdU标记心肌细胞。细胞核用DAPI染色（蓝色）。（B 和 C）分离细胞核的流式细胞术分析，显示来自12-13周龄野生型（C57/BL10）和mdx小鼠（mdx-/y ，背景为C57/BL10）的代表性图谱。（B）显示DAPI荧光强度及2N与&gt;2N细胞核区分的直方图。（C）根据本实验方案所述方法分析的2N心肌细胞核群体中EdU掺入情况的图示。所有小鼠自12周龄起连续一周给予EdU。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/53979fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
补充图1：PCM-1 是心肌细胞核的特异性标记物。根据所述方案，从通过将 TNT-cre 小鼠14与 ROSAnT/nG cre 敏感报告基因小鼠品系16杂交获得的双转基因小鼠中分离出细胞核。在此类小鼠中，由肌钙蛋白T（TNT）启动子驱动的cre激活可导致GFP在细胞核中不可逆地表达。使用同型对照（Iso）标记的细胞核可用于识别表达GFP的心肌细胞核群体（488/530/30-A）。使用抗PCM1抗体标记细胞核（通过633-660/20-A检测二抗），显示PCM1的表达与表达GFP的心肌细胞核群体高度一致。在此示例中，通过TNT启动子活性鉴定出的98.8%的心肌细胞核可被PCM1抗体标记。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure1.tif" target="_blank">请点击此处下载补充图1。</a>
补充图2：利用免疫组织化学技术定量心肌细胞更新的挑战。（A）二维图像显示两个表达PCM-1的心肌细胞核（绿色），似乎也标记了EdU（红色）。黄色箭头指示看似已掺入EdU的心肌细胞。这是因为在二维成像中观察时，PCM1表达与EdU标记出现明显的共定位所致。（B）该图像的三维投影表明，EdU标记的细胞并非心肌细胞，而是覆盖在表达PCM1的心肌细胞核上方的非心肌细胞。实验使用12周龄的C57/BL10小鼠。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2A.tif" target="_blank">请点击此处下载补充图2A。</a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53979/Supplementary_Figure2B.avi" target="_blank">请点击此处下载补充图2B。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">反应组分</td>
			<td colspan="2">反应次数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>875 µl</td>
			<td>2.19 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>铜保护剂</td>
			<td>20 µl</td>
			<td>50 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>荧光染料叠氮基吡咯</td>
			<td>5 µl</td>
			<td>12.5 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>在步骤 4.1 中配制的稀释反应缓冲液</td>
			<td>100 µl</td>
			<td>250 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总反应体积</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>2.5 ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2： EdU标记试剂混合液成分。本配方用于第4部分实验步骤（EdU掺入检测）。

心肌细胞更新率的定量具有挑战性。本文所述方案通过实现对新生心肌细胞核生成及细胞核倍性的准确且灵敏的定量，为解决这一难题做出了重要贡献。

同时评估心肌细胞DNA合成与倍性：一种辅助量化心肌细胞再生与更新的方法

尽管公认心脏在损伤后再生心肌细胞的能力有限，且心肌细胞的更新水平较低……

本方案的总体目标是通过长期核苷标记和流式细胞术来量化新生心肌细胞核的数量，同时校正细胞核多倍体现象，从而定量评估心肌细胞的更新情况。该方法可用于解决心肌细胞再生领域中的关键科学问题，并可作为筛选工具，用于量化心肌细胞生成动态的变化。本方案的主要优势在于，无论新生心肌细胞的来源如何，均可实现对新生心肌细胞生成的高灵敏度和准确量化，同时校正多倍体化的影响。在第六次EdU注射后24小时，将处理过的动物置于仰卧位，使用手术剪从腹部中线至横膈膜处做皮肤切口。接着，双手分别固定胸骨两侧，远离体腔，剪开横膈膜以暴露心脏。然后轻轻提起心脏，剪断流出道的主要血管，将心脏从胸腔中分离取出。收获后立即放入含有10 mL、4摄氏度预冷PBS的15 mL离心管中。随后将样品转移至各自的10 cm培养皿中，用手术刀沿矢状方向将每颗心脏切成两半。接着用镊子轻轻挤压心脏组织块。取出两片心脏组织，放入含有 20 mL 新鲜 PBS 的培养皿中。更换新的培养皿和 20 mL 新鲜 PBS，重复此步骤一次。将心脏的两部分均放入同一个 1.5 mL 微离心管中，并使用 25 号针头在每根离心管的管盖上打一个小孔，以防止心脏组织处理过程中管盖意外打开。然后标记每支试管，并将心脏组织置于液氮容器中冷冻。对于每份待分析的心脏样本，在超速离心管中加入36 mL 1% BSA与PBS溶液，孵育30分钟后弃去溶液。当离心管晾干后，向每根管中加入 10 mL 蔗糖梯度溶液。用手术刀将液氮冷冻的心脏组织样本分别切碎后，将每份心脏组织碎片转移至含有 15 mL 细胞裂解缓冲液的 50 mL 锥形管中。在室温下，使用探头式匀浆器以 25,000 rpm 的速度对样本匀浆 15 秒。然后向每根试管中再加入 15 mL 裂解缓冲液，并依次将样品转移至 40 mL 玻璃匀浆器中，使用大间隙研杵进行研磨。研杵上下研磨 10 次，将细胞悬液先通过 100 微米细胞滤网，再通过 40 微米细胞滤网，分别收集到各自的 50 mL 离心管中。随后通过离心收集细胞核心脏沉淀物，并将细胞分别重悬于 25 mL 蔗糖梯度溶液中。将细胞铺在已制备的超速离心管中无细胞核的蔗糖梯度上方，使用摆动转子转头进行离心。离心结束后，将细胞核沉淀用 1,300 微升细胞核储存缓冲液重悬，并转移至标记为 PCM1 的 1.5 mL 微量离心管中。从 PCM1 管中各取 300 微升悬液转移至新的微量离心管中，加入 700 微升新鲜的细胞核储存缓冲液，并标记为 ISO 对照。接下来，在4°C条件下，将PCM1细胞核与抗PCM1抗体孵育，将ISO对照细胞核与快速IGG同型对照抗体在4°C过夜孵育。次日，将样品离心，沉淀用1 mL新鲜细胞核储存缓冲液重悬，并在相同条件下进行第二次离心。第二次离心后，将沉淀用1 mL新鲜细胞核储存缓冲液重悬，并在避光条件下，于4°C与1 µL来自山羊抗兔IGG抗体的FITC标记F(ab')₂片段共同孵育1小时。为评估EdU掺入程度，将PCM1和ISO对照标记的细胞核悬液进行离心，沉淀用1 mL 1% BSA PBS重悬，连续洗涤两次。第二次洗涤后，弃上清，加入100 µL EdU固定液，在室温避光条件下孵育15分钟。固定结束后，再用1 mL PBS BSA洗涤细胞核两次，然后加入100 µL基于皂苷的通透化溶液，在室温下孵育样品。孵育15分钟后，向每根试管中加入500 µL新配制的EdU标记混合液，在室温下继续孵育30分钟。孵育结束后，将样品离心三次，在第二和第三次离心过程中每次用1 mL PBS BSA洗涤细胞核。最后，向样品中加入400 µL DNA染色溶液进行标记。对脉冲处理的心脏进行免疫组织学分析，结果显示存在表达PCM1且掺入了EdU的心肌细胞。然而，使用免疫组织学方法获得的数据可能被误读，因为其他掺入EdU的细胞类型可能被错误地鉴定为心肌细胞。在对mdx小鼠和对照小鼠的研究中，本方案中详述的流式细胞术分析能够快速定量新生心肌细胞核的生成，同时排除因去多倍体化而掺入EdU的细胞。与之前发表的数据相似，在本项代表性实验中，观察到与同龄对照组相比，mdx 小鼠心脏中新心肌细胞核生成率有所增加。一旦掌握该技术，可在两天内用四小时完成。进行此操作时，重要的是要同时设置 EdU 和 PCM1 阴性对照，以便在分析过程中准确设定门控。该技术还可与多种下游免疫组织化学技术兼容，从而能够在多种不同类型的心脏细胞中定量分析核细胞的整合情况。该技术已在心血管研究领域中用于研究非缺血性心肌病 mdx 模型中心肌细胞再生的变化。观看本视频后，您应能够充分掌握如何快速定量新生心肌细胞核，以及如何通过检测多倍体化来筛选心肌细胞再生与更新的变化。

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