同时评估心肌细胞DNA合成与倍性：一种辅助量化心肌细胞再生与更新的方法

本方案的总体目标是通过长期核苷标记和流式细胞术来量化新生心肌细胞核，同时校正细胞核的多倍体现象，从而定量评估心肌细胞的更新率。该方法可用于解决心肌细胞再生领域中的关键科学问题，并可作为筛选工具，用于量化心肌细胞生成动态的变化。本方案的主要优势在于，无论新生心肌细胞的来源如何，均可实现对新生心肌细胞生成的高灵敏度和准确量化，同时校正多倍体化的影响。

第六次EdU注射后24小时，将处理过的动物置于仰卧位，使用手术剪从腹部中线至横膈膜处做皮肤切口。接着，双手分别固定胸骨两侧，远离体腔，剪开横膈膜以暴露心脏。然后轻轻抬起心脏，剪断流出道的主要血管，将心脏从胸腔中分离取出。

收获后立即把心脏放入含有10 mL、4摄氏度预冷的PBS的15 mL离心管中。然后将样品转移至各自的10 cm培养皿中，用手术刀沿矢状方向将每颗心脏切成两片。接着用一对镊子轻轻挤压心脏组织块。

取出两片心脏组织，放入含有 20 mL 新鲜 PBS 的培养皿中。更换新的培养皿和 20 mL 新鲜 PBS，重复此步骤一次。将心脏的两部分均放入同一个 1.5 mL 微量离心管中，并使用 25 号针头在每根离心管的管盖上打一个小孔，以防止心脏组织处理过程中管盖意外打开。

然后标记每根试管，并将心脏组织放入液氮容器中冷冻。对于每份待分析的心脏样本，在超速离心管中加入36 mL的1% BSA和PBS溶液，孵育30分钟后弃去溶液。

当离心管空气干燥后，向每根管中加入 10 mL 蔗糖梯度溶液。用手术刀将液氮冷冻的心脏样品分别切碎后，将每份心脏组织碎片转移至含有 15 mL 细胞裂解缓冲液的单独 50 mL 锥形管中。在室温下，使用探头式匀浆器以 25,000 rpm 的速度对样品匀浆 15 秒。

然后向每支试管中再加入 15 mL 裂解缓冲液，并依次将样品转移至 40 mL 玻璃匀浆器中，使用大间隙研杵进行研磨。用研杵研磨 10 次，将细胞悬液先经 100 微米细胞滤网过滤，再通过 40 微米细胞滤网，分别收集到 50 mL 离心管中。随后通过离心收集细胞核心脏沉淀物，并将细胞分别重悬于 25 mL 蔗糖梯度溶液中。

将细胞铺在已制备的超速离心管中无细胞核的蔗糖梯度液上方，使用摆动转子转头进行离心。离心结束后，将细胞核沉淀用 1,300 微升细胞核储存缓冲液重悬，并转移至标记为 PCM1 的 1.5 mL 微量离心管中。从 PCM1 管中各取 300 微升悬液转移至新的微量离心管中，加入 700 微升新鲜的细胞核储存缓冲液，并标记为 ISO 对照。

接下来，在4°C条件下，将PCM1细胞核与抗PCM1抗体孵育，将ISO对照细胞核与快速IgG同型对照抗体在4°C过夜孵育。次日，将样品离心沉淀，将沉淀物重悬于1 mL新鲜的细胞核储存缓冲液中，并在相同条件下进行第二次离心。第二次离心后，将沉淀物重悬于1 mL新鲜的细胞核储存缓冲液中，并在避光条件下，于4°C与1 µL来自山羊抗兔IgG抗体的FITC标记F(ab')₂片段共同孵育1小时。

为评估EdU掺入程度，将PCM1和ISO对照标记的细胞核悬液进行离心，沉淀用1 mL 1% BSA PBS重悬，连续洗涤两次。第二次洗涤后，弃去上清液，加入100微升EdU固定液，在室温避光条件下孵育15分钟。固定结束后，再用1 mL PBS BSA将细胞核洗涤两次，随后在室温下用100微升基于皂苷的通透化溶液孵育样品。

孵育15分钟后，向每管中加入500 µL新配制的EdU标记混合液，在室温下继续孵育30分钟。孵育结束后，将样品离心沉淀三次，在第二和第三次离心过程中每次均用1 mL PBS BSA缓冲液洗涤细胞核。最后，向样品中加入400 µL DNA染色溶液进行染色。

对脉冲处理的心脏进行免疫组织学分析，结果显示存在表达PCM1且掺入了EdU的心肌细胞。然而，使用免疫组织学方法获得的数据可能被误读，因为其他掺入EdU的细胞类型可能被错误地鉴定为心肌细胞。在对mdx小鼠和对照小鼠的研究中，本方案中详述的流式细胞术分析能够快速定量新生心肌细胞核的生成，同时排除因去多倍体化而掺入EdU的细胞。

与之前发表的数据相似，在本项代表性实验中，观察到与同龄对照组相比，mdx 小鼠心脏中新心肌细胞核生成率有所增加。一旦掌握该技术，可在两天内用四小时完成。进行此操作时，重要的是要同时设置 EdU 和 PCM1 阴性对照，以便在分析过程中准确设定门控。

该技术还可与多种下游免疫组织化学技术兼容，从而可在多种不同类型的心脏细胞中定量分析核细胞的融合情况。该技术已在心血管研究领域中用于研究非缺血性心肌病 mdx 模型中心肌细胞再生的变化。观看本视频后，您应能充分理解如何快速定量新生心肌细胞核，并通过多倍体分析来检测心肌细胞再生与更新的变化。