基于高效液相色谱测量的近红外光谱蓝莓成分含量无损预测模型构建

本实验的总体目标是建立并验证利用近红外光谱法对单个蓝莓中总糖、总有机酸和总花青素含量进行无损预测的模型。该方法将解决农产品（如水果和蔬菜）品质评价领域中的关键问题。对我而言，该技术的一个优势在于，可以通过光谱学方法对大量产品进行无损检测。

以及通过此处所示步骤构建的模型。近红外光谱法是一种用于农产品无损检测的强大工具。通过分析光谱与通过化学分析测定的各目标成分含量之间的相关性，来构建预测模型。

本实验操作将由我实验室的毕业研究生 Yusuke Kimura 和本方案作者之一、来自大学的 Jingai Che 演示。从目标品种中采集足够数量和多种类型的蓝莓样品。为构建校准模型，建议采集 100 颗蓝莓。

至少需要10个样本用于所构建模型的验证。为构建稳健的模型，应采集多种类型的样本，例如不同颜色、大小以及不同成熟度的蓝莓。称量每颗蓝莓。

所测得的重量将用于后续计算每颗蓝莓中各成分的含量百分比。接下来，将一颗蓝莓样品置于近红外分光光度计的漫反射测量窗口中心位置。使用样品单通道命令，测定每颗蓝莓的光谱。

最好在果实的多个部位进行取样。如果蓝莓在光谱测量后不立即进行分析，应将其保存在冷冻箱中，温度低于零下30摄氏度。开始预处理时，将一颗蓝莓切成若干小块，以便于充分匀浆。

将冷冻的蓝莓在不解冻的情况下切碎，将切好的样品放入50毫升烧杯中。向烧杯中加入约10毫升超纯水。

将切碎的蓝莓放入超纯水中，用微波炉加热20秒，以灭活在分析过程中可能分解糖类的酶。向烧杯中加入约10毫升超纯水。使用配备标准轴和发生器的均质器，在12,000 RPM条件下均质混合物5分钟。

将匀浆混合物在3,000 RPM条件下离心10分钟。然后使用五号B滤纸通过真空过滤收集离心后样品的滤液。重复匀浆步骤两次后，测定滤液的pH值，并用稀盐酸和稀氢氧化钠水溶液将其调节至7。

用超纯水将滤液稀释至50毫升。将样品分为两份：一份用于糖类分析，另一份用于有机酸分析。

将第一个样品溶液通过串联的层析柱，以去除色素、阳离子和阴离子。弃去从层析柱流出的前1毫升样品溶液。然后使用层析柱中流出的样品溶液，通过高效液相色谱（HPLC）分析糖类。

在HPLC分析前，将溶液置于配备0.445微米滤膜的微量离心管中，用微型离心机以6,600 RPM转速离心10分钟。将凝胶渗透色谱柱置于柱温箱中，温度设为40摄氏度，配置HPLC系统。以脱气的超纯水作为流动相，流速为0.1毫升每分钟。

同时使用折射率检测器。通过每次进样20微升等分试样，测定标准溶液的高效液相色谱图。此处使用填充溶液软件进行测量。

通过鼠标右键单击“重新分析”，获取各标准溶液色谱图上糖条带的面积强度。然后将面积强度与其对应的浓度进行线性回归，绘制每种糖的工作曲线。根据该曲线，可得到每种糖的面积强度与浓度之间关系的方程。

获得标准曲线后，通过每次进样20微升等分试样，测定各样品溶液的HPLC色谱图。按照之前的方法，获取各样品溶液色谱图中糖类峰的面积强度。有关有机酸HPLC测定的操作步骤，请参阅文字版实验方案。

如果蓝莓在完成光谱测量后不立即进行花青素分析，则应将其保存在低于零下80摄氏度的冰箱中。为进行花青素的高效液相色谱（HPLC）检测前处理，需将每份冷冻果实用真空冷冻干燥机干燥12小时。随后，将干燥后的蓝莓置于含1%三氟乙酸的甲醇溶液中，在4摄氏度的冰箱中静置12小时，以提取花青素。

在4°C下，使用超速离心机以15,000 RPM的转速在2毫升微量离心管中离心提取物15分钟。然后将提取物通过0.45微米滤膜过滤，以获得用于HPLC测定的样品。使用C18反相色谱柱，并将色谱柱置于40°C的柱温箱中，配置HPLC系统。

采用梯度洗脱方法，以0.1%的三氟乙酸水溶液作为LUNA，以含0.5%三氟乙酸的乙腈溶液作为LUNB。流速为0.1毫升/分钟，在进样后的0至50分钟内，LUNB的比例从8%升至15%。

注射后50至60分钟内，比例从15%升至75%。使用光电二极管阵列检测器，在520纳米波长下进行监测。每次测定时，通过自动进样器注入10微升标准溶液 aliquot，测定其高效液相色谱（HPLC）光谱图。

使用LC溶液软件进行测定。最后，通过自动进样器每次注入10微升等分试样，测定各样品溶液的HPLC色谱图。此时，按照文本方案中所述，构建用于预测成分含量的校准模型，并对所构建的模型进行验证。

利用通过本方法测定的光谱数据和成分含量构建预测模型。此处展示了用于预测总糖含量的模型交叉验证结果示例。近红外光谱法预测值与高效液相色谱法（HPLC）测定值之间的相关性良好。

对于总花青素含量模型的交叉验证，也观察到了类似的结果。预测值与实测值之间的相关性同样令人满意。观看本视频后，您应能充分了解如何使用高效液相色谱法（HPLC）测定蓝莓中先前的成分含量。

只有基于通过破坏性化学分析测定的预设内容，正确构建模型，才可能实现不同的评估。这意味着，对目标物进行前期化学分析是构建高性能预测模型的关键。有关本视频中未展示的预测模型构建步骤，请参阅文字版实验方案。

一旦构建得当，这些预测模型即可用于预测蓝莓中的糖分、有机酸及任何成分含量。正如本研究所示，近红外光谱技术有望适用于多种农产品的相关性分析。需要谨记的是，在将近红外光谱技术应用于任何农产品评价时，必须通过化学分析获得成分含量的预设阈值，以构建良好的预测模型。