高速多色结构光照明显微镜在全内反射荧光成像中的应用指南

本方案的总体目标是构建并调试一台结构光照明显微镜，该显微镜适用于高速活细胞超分辨率成像，能够在全内反射（TIRF）和光学切片模式下进行多色成像。该方法有助于解决目前使用标准衍射受限TIRF显微镜无法回答的细胞生物学领域中的关键科学问题。该技术的主要优势在于其时间分辨率优于其他超分辨率显微技术，因此特别适用于对活细胞中动态过程的成像研究。

尽管本方案描述了构建TIRF-SIM显微镜的步骤，但该系统具有灵活性，可轻松改装以实现其他成像模式，如3D-SIM、多焦平面SIM和非线性SIM。为布置和校准结构照明显微镜的激发光路，首先根据图示在光学平台上标记各组件的位置。在将第一片二向色镜DM4插入显微镜框架的滤光镜转轮后，将第二片二向色镜DM3插入一个1英寸方形运动学镜架中，并将其置于距聚光镜L5一个焦距的位置。接下来，为精确定义系统的光学通路，需从转轮上取下物镜OB，改用一个对准工具旋入相应位置。

然后，使用二向色镜 DM3 和一块临时对准镜（放置在空间光调制器 SLM 的近似最终位置），将来自激光器一的准直参考光束引导通过两个对准盘上小孔的中心。如图所示，利用三面镜子和二向色镜 DM2，将来自激光器一的光束导向该临时镜面。一旦确定了粗略的光轴，即移除对准工具。

然后在光束进入显微镜主体之前，将一个虹膜光阑插入光路中，并将其居中对准光束。在虹膜光阑上附上一张带有小孔的白色卡片，使小孔与虹膜中心对齐，然后重新装入物镜。接下来，逐步调整反射镜 DM3 以及空间光调制器（SLM）位置处的反射镜角度，使返回的反射光在卡片上与入射光束重合居中。

然后暂时取下物镜，并在天花板上标记激光光斑位置，以创建参考位置。将管镜 L5 插入光路，大致放置在距物镜一个焦距的位置，并将其安装在沿参考光束方向移动的线性平移台上。调整管镜的位置和角度，使从物镜出射的光束为平行光，并照射到天花板上的参考光斑位置。

通过再次使用光圈和白卡检查后向反射，确认透镜与光束垂直。然后取下物镜，插入成像中继望远镜的第二个透镜 L4。使用线性平移台调节该透镜的位置和角度，以保持光束准直，并确保参考光束仍照射在天花板上标记的位置。重新装上物镜，并插入望远镜的第一个透镜 L3。调节该透镜的位置和角度，以确保实现如前所述的准直且无偏转。

按照文本方案安装SLM芯片并调整好透镜后，将SLM置于镜面位置。调节SLM的位置，使参考光束位于SLM芯片的中心，并调整角度，使光束穿过两个中继透镜。然后检查参考光束是否仍位于标记点的中心。

将液晶可变延迟器（LCVR）安装，使其快轴与入射偏振光方向成45度角。然后根据文本方案，使用目镜透射光完成偏振旋转器的准直，聚焦于分划板，并将物镜固定在此位置。接着，通过在1.5号盖玻片上滴加一滴100纳米多色荧光微球，制备单层荧光微球样品。

将珠子放置干燥，使其吸附于玻璃表面，然后再重新浸入水中。使用浸油将珠样置于物镜上。微调相机位置，使荧光微珠层处于焦平面。

根据文本协议生成SIM二进制光栅图案的位图文件并上传至空间光调制器（SLM）后，加载SLM控制软件并点击“连接”。在“程序库”选项卡中，点击“加载”以打开程序库文件，并检查文件中包含的运行序列数量。点击“发送到设备”以将程序库文件上传至SLM。

接下来，选择“状态”选项卡，输入运行顺序的编号。单击“选择”以将运行顺序更改为对准光栅。将安装在XY平移台上的空间掩模（SM）插入到L3透镜焦平面位置的光路中，并相对于光轴移动其位置，使仅有期望的一级衍射光通过。

经过空间滤波器后，仅可见两个圆形光束。在相机上检查荧光微珠层的图像。如果这两个圆形光束未如图所示重叠，则需重新调整样品平面，通过迭代调节物镜和相机的位置来实现对准。

根据文本方案精细调节焦距并设定样品平面后，可通过成像例如10 µM罗丹明6G染料溶液来确认TIRF照明效果，具体操作为将染料调至焦平面。若两束激光以正确的TIRF角度入射，则应能观察到单分子信号且背景信号较低，同时圆形光阑的边缘也应处于焦点清晰状态。可通过调节二向色镜DM3的位置对光束位置进行微调。

为同步和校准系统，将微珠单层样品置于物镜上并调至焦点。使用空间光调制器（SLM）控制软件，依次为第一种图案取向编程，使SLM显示三种相位偏移图像中的每一种。然后切换到示例图谱的运行顺序四。

在采集软件中，通过选择“Advanced Camera Properties”并将“Output Trigger Kind 1”设置为正向、“Output Trigger Kind 2”设置为负向，来为相机配置全局曝光时间。在序列窗格的“Scan Type”下，选择“Hard Disk Record”，并将帧数设置为三帧。然后单击“Start”以采集三帧图像。

每次曝光时，SLM 图案都会发生变化。根据文本协议校准系统后，在 SLM 控制软件中，将 SLM 的运行顺序切换为 TIRF-SIM 所需的全部九幅二进制光栅图像序列。在示例图谱中，此为运行顺序零。

获取小球样品的九幅图像后，在相机软件的序列窗格中，选择“Hard Disk Record”作为扫描类型，并将帧数更改为九。然后单击“Start”以采集图像。最后，在“Save Buffered Images”下选择 TIFF 作为图像类型，然后单击“OK”。根据文本方案重建超分辨率图像。

如图所示，使用多色100纳米直径的荧光微球进行成像，以比较标准TIRF与TIRF-SIM的成像效果。TIRF-SIM的横向分辨率明显显著高于TIRF。显微镜的估计分辨率为：488纳米TIRF-SIM下90纳米，640纳米TIRF-SIM下120纳米。

与理论上的衍射极限情况相比，两种波长的横向分辨率均提高了两倍。如图所示，荧光标记的淀粉样纤维在体外形成，并被用作测试样品以展示分辨率的倍增效果。具有高对比度的亚细胞结构，例如emGFP标记的微管或LifeAct-GFP，非常适合用于TIRF-SIM成像，能够获得高对比度的超分辨率图像。

使用上述装置进行TIRF-SIM成像可实现对位于细胞基底皮层附近的微管亚群的观察，并能随时间分辨微管的聚合与解聚过程。对于缺乏明确结构的低对比度样本，除质膜边缘外，难以获得高分辨率信息，因此不适合用于TIRF-SIM成像。最后，高调制对比度是成功实现SIM成像的关键条件。

如本实验所示，对重建图像进行傅里叶变换可实现SIM光学传递函数的可视化。一旦掌握该技术，且所有必要组件均已备齐，整个过程可在大约一周内完成。在实施TIRF-SIM时，必须充分注意影响其成功实施的最关键问题。

首先，光束的精确对准至关重要。这一步骤可能具有挑战性，因为光束必须位于物镜光阑的边缘。其次，光的偏振态必须与图案同步旋转，这一点极为关键。

如果没有这一点，样品的图案对比度会很低，后续的图像重建将无法实现。观看本视频后，您应该能够充分理解基于空间光调制器（SLM）的全内反射荧光结构光照明显微镜（TIRF-SIM）在构建和校准过程中最关键的步骤。请务必注意，使用3B类激光器可能存在极高的危险性。

在使用TIRF物镜进行对准时，激光功率必须保持在对眼睛安全的水平。