Name: 在新鲜分离的人代绒毛滋养细胞转染和EMSA分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 学习使用微孔转染技术在人绒毛膜滋养层细胞中进行siRNA转染，并结合EMSA分析研究DNA-蛋白质相互作用。该方法为胎盘发育和基因调控研究提供了高效可靠的实验方案。

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本研究工作获得了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）基金（#298527）（BB）的资助。CT 获得了机构 FARE 奖学金的支持。AV 获得了 NSERC Graham Bell 博士奖学金的支持。BB 担任加拿大人类逆转录病毒学研究主席（第二级）。感谢 Beatrix Beisner 在文本修改过程中提供的帮助。

这些方案已获得魁北里大学（UQAM）伦理委员会批准，符合蒙特利尔大学医院中心圣吕克医院（蒙特利尔，加拿大）伦理委员会的指导方针。参与者均已签署知情同意书。
1. 培养基制备与初级绒毛细胞滋养层细胞的分离
<ol>
	<li>通过在杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中添加 25 mM HEPES、10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素，制备人原代绒毛细胞滋养层细胞的培养基。将配制好的培养基经无菌 0.22 µm 滤器过滤后，分装为每份 50 ml，保存于 -20 °C 冰箱中。</li>
	<li>按照标准方案3从新鲜胎盘组织中分离原代绒毛细胞滋养层细胞。
	<ol>
		<li>使用镊子轻轻刮除组织表面的胎儿膜，注意避免去除绒毛组织。用手术刀和剪刀将剩余的胎盘绒毛切成约 3 x 3 cm 的小块。用含 0.9% NaCl 的水彻底冲洗，以去除母体血液。
		<ol>
			<li>用镊子夹住每一块组织，用剪刀小心地从残留的血管和纤维组织中分离出绒毛组织。</li>
			<li>取 15 至 30 mg 绒毛组织，在含有胰蛋白酶（9.6 x 105 至 1.8 x 106 U；终浓度 1.2 mg/ml）和脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）（终浓度 200 µg/ml）的汉克斯平衡盐溶液（HBSS）中，于 37 °C 水浴中持续振荡消化 30 分钟，共进行四次消化。 
			注：第一次消化使用总体积 150 ml，第二次使用 100 ml，后两次各使用 75 ml。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>收集含有分散细胞的上清液，在 1,250 x g 条件下离心 15 分钟（不启用刹车）。弃去上清液，将细胞重悬于 1 ml 预热的含 1% 青霉素/链霉素的 DMEM 中。</li>
		<li>将分散的细胞铺在不连续的 5%–70% 聚乙烯吡咯烷酮包被的二氧化硅梯度液上（梯度液配制见表 1），在 507 x g 条件下离心 23 分钟（不启用刹车）。用移液器吸取密度介于 1.017 至 1.033 之间的层，并收集梯度中 40% 至 50% 区间的细胞层。用含 1% 青霉素/链霉素的 10 ml 预热 DMEM 对细胞进行充分洗涤。 
		注：所收集的组分对应密度为 1.048 至 1.062，其中富含滋养层细胞。</li>
		<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数。简要步骤如下：混匀细胞悬液，取 10 µl 加入新的微量离心管中，加入 10 µl 台盼蓝，再次轻柔混匀。吸取细胞悬液填充血细胞计数板的计数室，在 10X 物镜下进行细胞计数。</li>
		<li>将 1 x 106 和 4.5 x 106 个细胞分别放入不同的离心管中，用于后续第 1.3 节和第 2 节实验。将剩余细胞以每孔 1.5 x 106 个细胞的密度接种于补充培养基中，在 37 °C、5% CO2 条件下培养，最长不超过 4 天，用于其他实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>评估分离的原代绒毛细胞滋养层细胞纯度
	<ol>
		<li>将 1 x 106 个 freshly isolated 的细胞在微量离心管中以 300 x g 离心。弃去上清液，加入 1 ml 预热的磷酸盐缓冲液（PBS）。再次以 300 x g 离心，用移液器吸除 PBS。</li>
		<li>向细胞中加入 1 ml 冷甲醇，在 -20 °C 孵育 20 分钟。以 300 x g 离心 5 分钟，吸除甲醇。 
		注意：操作甲醇时应佩戴防毒面具、护目镜和橡胶手套。</li>
		<li>加入 1 ml 室温 PBS 重悬细胞以进行再水化，以 300 x g 离心后吸除 PBS。</li>
		<li>将细胞在含 FBS（1:50 [v/v] 稀释）和 FcR 封闭试剂（1:10）的 PBS 中室温孵育 45 分钟，以消除非特异性结合。</li>
		<li>用 500 µl 室温 PBS 洗涤两次，每次以 300 x g 离心 5 分钟，吸除 PBS。将细胞重悬于 100 µl 室温 PBS 中。</li>
		<li>在含 0.2% BSA 的 PBS 中，加入鼠抗人细胞角蛋白-7（cytokeratin-7）荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记的单克隆抗体 LP5K 克隆（1:200）或同型对照非特异性抗体，室温避光孵育 45 分钟。孵育后用 PBS 洗涤细胞。</li>
		<li>通过流式细胞术3分析细胞。选择流式细胞术检测显示 CK-7 阳性细胞比例不低于 96% 的细胞样本用于后续实验。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 人原代绒毛细胞滋养层细胞的siRNA转染
<ol>
	<li>使用微电穿孔装置转染人原代绒毛细胞滋养层细胞
	<ol>
		<li>准备6孔板，每孔加入2 ml含补充物的DMEM培养基，用于培养显微穿孔处理的细胞。</li>
		<li>原代滋养层细胞分离后（见第1.2节），取部分细胞悬液，使用血细胞计数板测定细胞数量。</li>
		<li>转移 1.5 × 106 将细胞转移至微量离心管中，在室温下以300 × g离心5分钟，使细胞沉淀。用1 ml杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）（含Mg）洗涤细胞2+，Ca2+离心前去除上清，然后在室温下以300 × g离心5分钟，收集细胞沉淀。</li>
		<li>吸除上清液，并将细胞在100 µl重悬缓冲液中轻轻重悬。 
		注意：为最大限度地保持细胞活力和转染效率，避免将细胞悬液在室温下放置超过15-30分钟。</li>
		<li>向1.5 ml离心管中加入300 ng Syncytin-2 siRNA（或对照用乱序siRNA），用100 µl转染枪头吸取细胞-siRNA混合液。将枪头插入电穿孔仪（见材料列表）中，对细胞施加一次1,300 V、30 msec的单脉冲。</li>
		<li>立即将细胞转移至已制备的6孔板（步骤2.1.1）中，孔内含37 °C预热的完全培养基，以避免细胞损伤。</li>
		<li>对剩余样品重复步骤 2.1.5 和 2.1.6。</li>
		<li>轻轻摇动培养板30秒，以确保细胞均匀分布。将培养板置于37 °C、湿润的CO₂培养箱中孵育。2 置于培养箱中培养24至48小时。转染后24小时更换培养基。</li>
		<li>通过蛋白质印迹分析评估转染效率（见步骤3至6）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人原代细胞滋养层细胞中siRNA的脂质体转染
	<ol>
		<li>绒毛细胞滋养层细胞分离后，以1.5 x 10⁶细胞/毫升的密度接种细胞6 每孔加入2 ml培养基，接种细胞至6孔板，每孔细胞数为指定数量，培养18小时。</li>
		<li>将300 ng的Syncytin-2特异性siRNA（或对照性随机siRNA）和5 µl脂质转染试剂分别加入两个1.5 ml离心管中，每管用无抗生素和无血清的培养基补足至总体积10 µl。孵育5分钟。</li>
		<li>将稀释后的试剂混合，在室温下继续孵育20分钟，以形成转染复合物。向混合物中加入90 µl不含抗生素和血清的培养基，最终体积为100 µl。</li>
		<li>从6孔板中移除培养基（步骤2.2.1）。向每孔加入2 ml新鲜培养基和100 µl转染混合物。将细胞在37 °C、CO₂2 在培养箱中孵育24至48小时。转染后24小时更换培养基。</li>
		<li>通过蛋白质印迹分析评估转染效率（见步骤3至6）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 全细胞培养物裂解液的制备
<ol>
	<li>移除培养基，使用预热的不含 Mg2+ 和 Ca2+ 的 DPBS 洗涤每个孔（来自步骤 2.1.8 和 2.2.4）。吸除 DPBS，每孔加入 500 µl 0.25% 胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）。在 37 °C 的 CO2 培养箱中孵育 1–3 分钟。加入 500 µl 含血清的生长培养基以终止胰蛋白酶消化。
	 
	注意：根据培养瓶/培养皿类型使用适当的培养基体积：每 107 个细胞/100 mm 培养皿/150 cm2 培养瓶使用 1 ml；每 5 × 106 个细胞/60 mm 培养皿/75 cm2 培养瓶使用 0.5 ml。</li>
	<li>将细胞转移至 1.5 ml 微量离心管中，在室温下以 300 × g 离心 2 分钟以收集细胞沉淀。用不含 Mg2+ 和 Ca2+ 的 DPBS 洗涤细胞，并在室温下以 300 × g 离心 2 分钟以再次收集细胞沉淀。</li>
	<li>小心吸除上清液，避免扰动沉淀。将离心管置于冰上。用 50–200 µl 冰冷的放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解缓冲液重悬沉淀（缓冲液成分见表 2），其中加入新鲜配制的蛋白酶和磷酸酶抑制剂至终浓度为 1×。短暂涡旋混匀后，冰上静置 30 分钟。</li>
	<li>在 4 °C 下以 16,000 × g 离心 20 分钟。小心将离心管放回冰上。使用移液器将上清液转移至另一置于冰上的预冷干净微量离心管中。弃去沉淀。</li>
</ol>
4. 培养细胞核提取物的制备
<ol>
	<li>对于每个孔（步骤 1.2.5），用 1 ml 预热的不含 Mg2+、Ca2+ 的 DPBS 洗涤培养的细胞滋养层细胞两次。吸除 DPBS，加入 500 µl 0.25% 胰蛋白酶/EDTA。在 37 °C 的 CO2 培养箱中孵育 1–3 分钟，并通过加入 500 µl 含血清的生长培养基终止胰蛋白酶消化。</li>
	<li>将细胞转移至 1.5 ml 微量离心管中，在室温下以 300 × g 离心 2 分钟收集细胞沉淀。用不含 Mg2+、Ca2+ 的 DPBS 洗涤细胞，并在室温下以 300 × g 离心 2 分钟再次收集细胞沉淀。小心吸除所有上清液，避免扰动沉淀，将离心管置于冰上。</li>
	<li>根据制造商说明书提取核蛋白。使用蛋白定量检测法（Bradford 法或二喹啉酸法（BCA））测定各样品的蛋白浓度。</li>
</ol>
5. 样品制备与电泳
<ol>
	<li>使用蛋白质定量检测法（例如 Bradford8 或 BCA9）测定每种细胞裂解液的蛋白质浓度。</li>
	<li>根据制造商说明书（如果抗体可在还原和变性条件下使用），向 20–30 µg 总蛋白中加入等体积的 2x Laemmli 上样缓冲液（表 2）。</li>
	<li>将细胞裂解液在 100 °C 下煮沸 5 分钟。将裂解液分装为 50–100 µl 每管，以避免反复冻融，并将剩余样品管储存于 -20 °C 以备后续使用。</li>
	<li>在样品加热的同时，配制 1 L 的 1x 电泳缓冲液（凝胶组成见 表 2）。</li>
	<li>将样品在 16,000 x g 下离心数秒，然后置于冰上冷却。</li>
	<li>将等量蛋白样品与分子量标准蛋白标记物一同加入 12% SDS-PAGE 凝胶的各孔中（凝胶组成见 表 2），在 100 V 电压下电泳 1 至 2 小时。</li>
</ol>
6. 将蛋白质从凝胶转移至膜上
<ol>
	<li>用甲醇活化聚偏二氟乙烯（PVDF）膜1分钟，并用1×转移缓冲液/10%甲醇溶液冲洗。根据蛋白大小，按照制造商说明书，转移30分钟至1小时。 
	注意：可在封闭步骤前使用丽春红S染色评估转移效率。</li>
</ol>
7. 抗体染色
<ol>
	<li>使用 5% 封闭液在室温下封闭膜 1 小时，或在 4 °C 下封闭过夜。</li>
	<li>将膜与抗 Syncytin-2 抗体（4 µg/ml；1:5,000）6 或抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH；0.4 µg/ml；1:500）在 5% 封闭液中于 4 °C 下孵育过夜（抗 Syncytin-2）或在室温下孵育 45 分钟。用 Tris 缓冲盐水 Tween（TBST；缓冲液成分见表 2）洗涤膜三次，每次 5 分钟。</li>
	<li>将膜在 TBST 中的 5% 封闭缓冲液内，与适当的辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗兔或抗小鼠二抗（1:10,000）在室温下孵育 1 小时。用 TBST 洗涤膜三次，每次 5 分钟，然后用 TBS 冲洗。使用基于化学发光的印迹底物检测信号。</li>
</ol>
8. 单链寡核苷酸的放射性标记
<ol>
	<li>磷酸化反应
	<ol>
		<li>在微量离心管中，加入50 ng的正向寡核苷酸，以及1× T4多聚核苷酸激酶缓冲液、1 U T4多聚核苷酸激酶和20 µCi (γ-32P) ATP，用无核酸酶水将反应体系补至20 µl。</li>
		<li>在37 °C孵育30分钟。加入5 µl 0.5 M EDTA终止反应，再用无核酸酶水将体积调至50 µl。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从寡核苷酸中去除未掺入的核苷酸
	<ol>
		<li>按照生产商说明书，使用TE缓冲液（表2）平衡G-25柱。将柱子置于新的无DNase的1.5 ml微量离心管中。</li>
		<li>将50 µl探针（来自步骤8.1.2）缓慢加至树脂上，注意不要搅动树脂层。在350 × g离心2分钟，使纯化后的样品收集到1.5 ml微量离心管中。用36 µl无核酸酶水洗涤G-25柱，并在350 × g离心2分钟，将洗涤液收集至同一微量离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>与互补链寡核苷酸杂交
	<ol>
		<li>将放射性标记的探针（86 µl）转移至1.5 ml微量离心管中，加入200 ng反向寡核苷酸和1×退火缓冲液（表2）。在95 °C加热5分钟，然后在室温下静置过夜冷却。</li>
		<li>在1.5 ml微量离心管中加入50 ng未标记的正向和反向寡核苷酸以及1×退火缓冲液，制备非放射性双链寡核苷酸。用无核酸酶水将体积调至100 µl。按照步骤8.3.1所述进行加热并置于室温保持。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. EMSA用非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备
<ol>
	<li>制备一块4%的天然凝胶（10 × 12 cm），使用1.5 mm间隔的梳子（凝胶组分见表2）。用蒸馏水清洗所有玻璃板。 
	注意：必须确保玻璃板完全不含离子型去污剂（如SDS）。</li>
	<li>立即在两块玻璃板之间倒入丙烯酰胺溶液，并使其充分聚合（约30分钟）。</li>
	<li>组装电泳装置，向电泳槽中加入0.5× TBE缓冲液。在上样前，以150 V预电泳30分钟至1小时。</li>
</ol>
10. DNA 结合反应
<ol>
	<li>在1.5 ml 微量离心管中，加入10 µg 核提取物（步骤4.3），用1×凝胶迁移结合缓冲液（表2）溶解，并用无核酸酶水将终体积调至10 µl。作为对照，准备一个不含核提取物的管。对于竞争反应，加入1 µl 冷的非特异性或特异性双链寡核苷酸（步骤8.3.2）。</li>
	<li>向每个反应体系中加入1 µl 来自步骤8.3.1的放射性探针。在室温下孵育20分钟。每管加入1 µl 10×凝胶上样缓冲液，然后将各样品上样至第9节中制备的凝胶中。</li>
	<li>在150 V电压下电泳1.5至2小时。电泳结束后，将凝胶和玻璃板用塑料膜包裹，置于磷屏成像曝光盒中，紧贴磷屏下方。将曝光盒于4 °C放置24小时。</li>
	<li>从曝光盒中取出磷屏，插入磷屏成像仪中进行扫描。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

通过优化分离各种胎盘细胞群体的方案，人类胎盘功能与发育的研究已得到显著改进。其中研究最为深入的胎盘细胞群体之一是绒毛细胞滋养层细胞，其研究得益于能够高效且可靠地分离该细胞的优化方案。这进一步使得多种实验成为可能，例如转染和启动子研究。采用先前描述的方案3，可以获得纯度较高的原代绒毛细胞滋养层细胞群体。CK-7 是一种中间丝蛋白，在细胞滋养层细胞中表达。抗该蛋白的单克隆抗体可用于检测从胎盘分离后的滋养层细胞群体的纯度10。当96%的细胞呈CK-7阳性时，即定义为纯度达标。细胞随后可直接用于转染。基于脂质的转染方法被广泛用于将核酸导入原代细胞11,12。然而，某些细胞中脂质制剂的毒性成为其应用的不利因素。微孔电穿孔是一种利用移液器吸头作为电穿孔空间的电穿孔技术，其产生的热量极少，并可最大限度减少金属离子溶出、pH变化及氧化物形成；这些因素均可能对细胞造成损害。根据本文所提供的数据，通过Western blot分析判断，微孔电穿孔在siRNA递送方面比基于脂质的转染方法更为高效。采用EMSA方法，检测了一个针对合胞素-2（Syncytin-2）启动子特定区域设计的探针，该区域已...

人类胎盘功能障碍与多种妊娠相关疾病（如子痫前期和宫内生长受限）的发生有关1。胎盘的重要细胞组分是滋养层细胞，可进一步分为绒毛外滋养层细胞和绒毛细胞滋养层细胞。绒毛细胞滋养层细胞融合后进一步分化为合体滋养层，形成一种多核细胞结构，在母胎物质交换和激素生成中发挥重要作用2。人类原代绒毛细胞滋养层细胞及其分化后的细胞是重要的生物学样本，可使研究人员在体外培养条件下研究多种与胎盘相关的生物学过程，例如细胞融合。此外，目前仍在持续开展研究，以鉴定有助于合理管理并改善妊娠相关疾病预防性治疗的生物标志物。实验室通常采用基于胰蛋白酶消化胎盘绒毛的标准分离方法，从新鲜胎盘中分离原代人类绒毛细胞滋养层细胞3。由于培养的细胞滋养层细胞会迅速失去增殖能力，并在培养过程中快速分化为类似合体滋养层的结构4，因此需要高效的转染方法和优化的分析手段。先前的研究已确定了这些原代细胞滋养层细胞转染的最佳条件5。本文介绍了一种不同的siRNA转染方法，该方法此前已在该类细胞中进行过测试6。与基于脂质体转染（lipofection）的方法相比，这种微孔电穿孔（microporation）方法可显著提高转染效率，其评估依据为特定基因沉默程度的增强。
启动子和基因表达研究也有助于更深入理解胎盘功能。尽管由于初级绒毛细胞滋养层细胞的培养时间较短而较难使用，但采用标准实验方案进行启动子分析仍是可行的，如先前已发表的研究所示。 7电泳迁移率变动分析（EMSA）是这些常用方法之一 体外 方法，可快速简便地监测DNA-蛋白相互作用。利用这些原代滋养层细胞的核提取物，检测合胞素-2（Syncytin-2）启动子区域的特异性相互作用。结果显示，在培养的不同时间点均可特异性且可重复地检测到结合因子。
本方案中提供的数据证实，我们的转染方法和电泳迁移率变动分析（EMSA）方案可用于分离的原代绒毛细胞滋养层细胞，将对研究绒毛细胞滋养层细胞在正常或病理条件下的多种功能具有重要意义。

<table><tbody><tr><td>不含 HBSS&amp;nbsp; Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;，Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#H2387</td><td></td></tr><tr><td>HBSS（10倍浓度）</td><td>Sigma</td><td>#14060-057</td><td></td></tr><tr><td>DMEM高糖培养基（不含Hepes）</td><td>Gibco</td><td>#12100-061</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (1 M)</td><td>Gibco</td><td>#15630-080</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-新霉素（100倍浓缩液）</td><td>Gibco</td><td>#15640-055</td><td></td></tr><tr><td>两性霉素 B&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#A2411</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>#C4901</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;sup&gt;.&lt;/sup&gt;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#M</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>#16170-078&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#P-1644</td><td>用于密度梯度</td></tr><tr><td>合胞素-2 siRNA</td><td>Ambion Life Technologies</td><td>#AM16708</td><td></td></tr><tr><td>随机对照siRNA</td><td>Qiagen</td><td># SI03650318</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#D5025</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶 I 型&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>#T8003</td><td></td></tr><tr><td>DharmaFECT 脂质转染&amp;nbsp; 试剂&amp;nbsp;</td><td>GEhealthcare</td><td># T-2001-01</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA</td><td>Life technologies</td><td>#25300-062</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>罗氏诊断</td><td>#11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白质定量检测试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>#23225</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>#A7906</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma</td><td>#P9416&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>抗兔 IgG，HRP 标记抗体&amp;nbsp;</td><td>细胞信号传导</td><td>#7074</td><td></td></tr><tr><td>BM 化学发光 Western 印迹底物（POD）</td><td>罗氏诊断</td><td>#11500708001</td><td></td></tr><tr><td>DPBS&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>#14287-080</td><td></td></tr><tr><td>T4 多核苷酸激酶</td><td>NEB</td><td>#M0201S</td><td></td></tr><tr><td>ATP，[&amp;gamma;-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]</td><td>Perkin Elmer</td><td>#BLU002A100UC</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#A9099</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Life technologies</td><td>#17919</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>#A3678</td><td></td></tr><tr><td>抗人细胞角蛋白-7 抗体克隆 LP5K，FITC 标记</td><td>Millipore</td><td>CBL194F</td><td>稀释比例 1:200</td></tr><tr><td>FcR封闭试剂&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130- 059-901</td><td>稀释比例 1:10</td></tr><tr><td>BD Acuri 流式细胞仪系统</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microporator MP-100 仪器&amp;nbsp;</td><td>Digital Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resuspension Buffer R（Neon 转染系统 100）&amp;nbsp;&amp;micro;l Kit)</td><td>Life technologies</td><td>MPK10096</td><td></td></tr><tr><td>PVDF膜&amp;nbsp;</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010&amp;nbsp;</td><td>用甲醇活化</td></tr><tr><td>抗人GAPDH抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-137179</td><td>1:500</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔抗体或抗小鼠抗体</td><td>细胞信号传导</td><td>#7074</td><td>1:10,000</td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗小鼠抗体</td><td>细胞信号传导</td><td>#7076&amp;nbsp;</td><td>1:10,000</td></tr><tr><td>NE-PER 核与胞质提取试剂</td><td>Thermo Scientific</td><td>#78833</td><td></td></tr><tr><td>G-25柱&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>#27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>化学发光和荧光成像设备</td><td>莫恩特&amp;eacute;al Biotech</td><td>Fusion FX5</td><td></td></tr><tr><td>4% 天然凝胶</td><td>自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>自制</td><td></td><td>1x</td></tr><tr><td>个人分子成像仪（PMI）系统</td><td>伯乐（BioRad）</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

新鲜分离的人绒毛细胞滋养层细胞的sirna转染及emsa分析

siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts

人原代绒毛细胞滋养层细胞是研究胎盘功能和调控机制以及理解妊娠相关疾病非常有用的原代细胞来源。在本方案中，通过标准的DNase/胰蛋白酶法从胎盘新鲜分离的人原代绒毛细胞滋养层细胞，采用小干扰RNA（siRNA）进行微孔电穿孔转染。与基于脂质体转染（lipofection）的方法相比，该方法显著提高了siRNA的转染效率。转染后的细胞可在转染后3至4天内通过标准的蛋白质印迹法（Western blot）进行分析。此外，利用培养的人原代绒毛细胞滋养层细胞，对电泳迁移率变动分析（EMSA）进行了优化，并在培养第1至第4天的细胞提取物中实施了该分析。使用这些原代培养细胞及所述实验方案，可评估特定基因和转录因子在绒毛细胞滋养层分化为类似合体滋养层细胞层过程中的作用。然而，由于原代细胞在体外培养中的有效时间较短，无法采用需要更长时间的方法，例如建立稳定细胞群体。因此，对该细胞群体的功能验证依赖于高度优化的基因转导方案。

足月妊娠后获取的新鲜胎盘用于分离人原代绒毛滋养层细胞，并开展方案部分所述的一系列实验。细胞分离后，我们首先利用细胞角蛋白-7标记物分析滋养层细胞的纯度（图1因此，使用单克隆抗细胞角蛋白-7抗体对细胞样本进行染色。 图1 代表通过密度梯度步骤分离纯化原代绒毛细胞滋养层细胞后，采用标准流式细胞术分析的典型实验结果。 &gt;在标准实验中，97%的细胞（本例中为99%）对细胞角蛋白-7呈阳性染色，表明该细胞类型的纯化效率非常高。
分离后，人原代细胞滋养层细胞可直接用于转染。评估了两种不同的实验方案， 即， 显微穿孔和脂质体转染。两种方案均使用特异性靶向合体素-2 mRNA的siRNA进行测试，并以乱序siRNA作为阴性对照。随后通过蛋白质印迹分析评估转染效率。结果证实，在采用显微穿孔法处理的细胞滋养层来源提取物中，合体素-2的表达显著被抑制图2</stron...

本方案描述了一种利用微电穿孔法高效转染新鲜分离的人绒毛细胞滋养层细胞中siRNA，并鉴定这些细胞中DNA-蛋白质复合物的方法。在4天的培养期间，可通过Western印迹和EMSA分析对转染细胞进行监测。

新鲜分离的人绒毛细胞滋养层细胞的siRNA转染及EMSA分析

人源性初级绒毛细胞滋养层细胞是研究胎盘功能和调控机制以及理解……的非常有用的原代细胞来源。

本实验方案的总体目标是展示转染新分离的原代绒毛细胞滋养层细胞的最佳条件，并提供一种用于鉴定启动子区域DNA与蛋白质相互作用的方法。该方法有助于回答胎盘研究领域中的一些关键问题，例如与细胞滋养层分化相关的基因及其表达调控机制的研究。该技术的主要优势在于操作简便且效率高。此外，开展该实验所需时间较短，且可同时处理大量不同的样本。本次实验操作将由我实验室前博士研究生Chirine Toufaily以及研究助理Yong Xiao进行示范。此处，根据标准操作流程，从新鲜胎盘中分离原代绒毛细胞滋养层细胞。本方案的第一步是通过流式细胞术分析来检测制备样品的纯度。首先，将 freshly isolated cytotrophoblasts（新鲜分离的细胞滋养层细胞）一乘以十的六次方个置于微量离心管中，在300 × g条件下离心5分钟。离心结束后，弃去上清液。加入1 mL预热的PBS，重复离心操作。通过抽吸去除PBS后，向细胞中加入1 mL冷甲醇，在-20摄氏度下孵育20分钟。随后，通过离心收集细胞，再用抽吸法去除甲醇。然后向沉淀中加入1毫升室温的PBS，以重悬细胞。离心并去除PBS后，加入含有FBS和Fc受体阻断试剂的PBS，室温孵育45分钟，以消除非特异性结合。孵育结束后，用500微升室温PBS洗涤细胞两次，每次离心条件为300 × g，离心5分钟。除去最后一次 PBS 洗涤后，将细胞重悬于 100 µL 室温 PBS 中。然后在避光条件下，室温孵育细胞 4 分钟，加入小鼠单克隆 FITC 标记的抗人细胞角蛋白 7 抗体（克隆号 LP5K），或相应的同型对照非特异性抗体。用 PBS 洗涤细胞后，通过流式细胞术分析荧光信号。使用流式细胞术检测显示至少96%的CK7阳性细胞的细胞样品进行后续实验。为了使用微电穿孔装置转染人原代绒毛细胞滋养层细胞，首先准备六孔板，每孔加入2毫升添加补充物的DMEM培养基，并将其置于37摄氏度的组织培养孵育箱中。接着，将1.5 × 10⁶个分离的原代细胞滋养层细胞分装至微量离心管中。离心后收集细胞沉淀，用一毫升杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）洗涤。去除 PBS 后，将洗涤后的细胞轻轻重悬于 100 微升重悬缓冲液中，加入 300 纳克 Syncytin-2 siRNA 或对照用乱序 siRNA。然后使用 100 微升转染移液器吸取细胞与 siRNA 的混合物。现在将移液器插入转染仪中，对细胞施加一个持续时间为30毫秒、电压为1300伏的单次电脉冲。然后立即将细胞转移至预先准备好的六孔板中，并轻轻摇动培养板30秒，以确保细胞均匀分布。在重悬细胞时，非常关键的是避免产生气泡，并立即将细胞转移至培养基中。否则会影响细胞的存活率和转染效率。将培养板置于37摄氏度、加湿的二氧化碳培养箱中孵育24至48小时。首先，用1毫升预热的DPBS洗涤培

sirna-transfection-emsa-analyses-on-freshly-isolated-human-villous

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

在新鲜分离的人代绒毛滋养细胞转染和EMSA分析

在本实验方案中，我们描述了在小鼠妊娠第10.5天时分离胎盘组织，并通过Percoll梯度分离滋养层细胞的方法。随后，我们展示了将分离得到的细胞用于Matrigel侵袭实验的操作过程。...

小鼠滋养层细胞的分离及滋养层细胞侵袭实验

人原代滋养层细胞培养模型研究褪黑素对缺氧/复氧诱导损伤的保护作用

滋养层巨细胞（TGCs）在胎盘中发挥关键作用，以确保妊娠健康。本文介绍一种通过在植入后胚胎的冷冻切片或胚胎第7天外胚层锥体的短期培养物上进行新生荧光原位杂交，来评估TGCs中基因转录状态的实验方案。...

通过新生RNA荧光原位杂交进行转录分析 体内 滋养层巨细胞或 体外 外植体短时培养的胚外胎盘锥

本文介绍一种从人脐带（UC）和胎儿胎盘样本中分离出脐带内层（CL）、华通胶（WJ）、脐带-胎盘连接处（CPJ）以及胎儿胎盘（FP）的实验方案，用于通过组织块培养法分离和鉴定间充质基质细胞（MSCs）。...

人脐带和胎儿胎盘间充质基质细胞的分离与鉴定

本文介绍一种利用骨形态发生蛋白4（bone morphogenic protein...

体外 人多能干细胞向滋养层细胞的分化

本文介绍了一种人胎盘绒毛组织取样后分离细胞滋养层细胞用于原代细胞培养的实验方案。用TNFα处理滋养层细胞可模拟肥胖子宫内环境中的炎症状态，有助于发现母体肥胖胎盘中受炎症调控的分子靶点。...

一种原代人类滋养层细胞模型，用于研究母体肥胖相关炎症对胎盘自噬调控的影响

本研究介绍了一种可逆组织透明化、免疫染色、三维成像及分析人胎盘绒毛样本中血管网络的实验方案，样本体积约为 1 - 2...

三维重建与分析免疫标记并透明化处理的人类胎盘小叶血管网络

本方案展示了一种从足月胎盘的胎膜中分离原代人蜕膜细胞的方法，该方法可用于多种应用（例如免疫细胞化学、流式细胞术、等），旨在研究不同细胞群体在妊娠并发症中的作用。...

从足月胎盘的胎膜中分离原代人蜕膜细胞

本文介绍了一种简便易行的实验方案，利用三种体外实验方法评估人类滋养层细胞的细胞运动能力：划痕实验、Transwell侵袭实验和细胞增殖实验。...

评估永生化人孕早期滋养层细胞系迁移、侵袭和增殖能力的体外实验方法

本方案可实现对经典方法中形成的管状结构的回收 体外...

从血管生成-管腔形成实验中回收滋养层细胞用于分化标志物表达分析

本方案可实现从人类足月胎盘的底蜕膜和绒毛膜中分离、鉴定和培养原代HLA-G+绒毛外滋养层细胞（EVT）。原代EVT培养物可维持96小时的活力，可用于与配对的母体免疫细胞共培养，并进一步对其相互作用进行流式细胞术和分子分析。...

从人类足月胎盘组织中分离纯化 HLA-G+ 细胞外滋养层细胞用于表型鉴定与功能分析

学习使用微孔转染技术在人绒毛膜滋养层细胞中进行siRNA转染，并结合EMSA分析研究DNA-蛋白质相互作用。该方法为胎盘发育和基因调控研究提供了高效可靠的实验方案。

新鲜分离的人绒毛细胞滋养层细胞的siRNA转染及EMSA分析

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