Name: 乙醇引起的肝纤维化模型的斑马鱼发展研究祖细胞介导的肝细胞的再生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: 了解利用斑马鱼建立乙醇诱导肝纤维化模型的方法，研究肝细胞再生的分子机制。该技术具有成本效益，可用于化学筛选和单细胞可视化分析，为开发肝病治疗策略提供重要工具。

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本工作部分由GTEC（2731336和1411318）、NIH（K01DK081351）以及NSF（1354837）向C. H. S. 提供的资助支持。我们感谢Alem Giorgis对稿件的审阅。

斑马鱼的饲养和繁殖采用标准方案进行，该方案符合美国国立卫生研究院的标准，并已获得佐治亚理工学院机构动物护理和使用委员会的批准。&#160;
1. 溶液的配制
<ol>
	<li>准备 20 L 的卵水（可与“胚胎培养基”互换使用），用于维持斑马鱼胚胎/幼鱼。将 1.5 g CaSO4 和 6 g 即用型海盐溶解于 250 ml 蒸馏水中，倒入盛有 20 L 蒸馏水的试剂瓶中并充分混匀。</li>
	<li>制备 1 L 1-苯基-2-硫脲（PTU）储备液（20 倍浓度）。将 0.6 g PTU 粉末溶于 1 L 蒸馏水中。使用时每 20 ml 胚胎培养基中加入 1 ml 储备液，终浓度为 0.003%，作为工作液。 
	注意：PTU 在吸入或皮肤接触后可能引起全身毒性。请依照适当的操作规范进行配制和使用。</li>
	<li>制备 1 L 乙基-3-氨基苯甲酸甲磺酸盐（Tricaine）储备液（20 倍浓度）。将 4 g Tricaine 粉末溶于蒸馏水中，加入 1 M Tris 缓冲液（pH 9）调节 pH 至 7，再用蒸馏水定容至 1 L。分装为 50 ml 份量，于 -20 °C 保存。使用前解冻。 
	注意：Tricaine 可导致感觉丧失。请依照适当的操作规范进行配制和使用。</li>
	<li>制备 100 ml 幼鱼用甲硝唑（MTZ）工作液。将 0.25 g MTZ 粉末溶于含 0.1% 二甲基亚砜（DMSO）的 100 ml 胚胎培养基中，配制成新鲜的 15 mM MTZ 溶液。通过剧烈振荡使 MTZ 粉末完全溶解。现配现用，并用铝箔包裹以防止 MTZ 发生光催化降解。 
	注意：MTZ 可能引起刺激。请依照适当的操作规范进行配制和使用。</li>
	<li>制备 100 ml 幼鱼用乙醇/甲硝唑（EtOH/MTZ）工作液。现配 MTZ 溶液，并用铝箔包裹以防止光催化降解。使用前加入 1.5 ml 100% 乙醇至 100 ml MTZ 溶液中，终浓度为 1.5%。</li>
	<li>制备 500 ml 成鱼用 MTZ 工作液。将 0.83 g MTZ 粉末溶于含 0.1% DMSO 的 500 ml 系统水，配制成新鲜的 10 mM MTZ 溶液。通过剧烈振荡使 MTZ 粉末完全溶解。现配现用，并用铝箔包裹以防止 MTZ 发生光催化降解。</li>
	<li>制备 1 L PEM 缓冲液。将 30.2 g PIPES、0.74 g EGTA 和 0.12 g MgSO4 溶于蒸馏水中，用 NaOH 调节 pH 至 7，再用蒸馏水定容至 1 L。</li>
</ol>
2. 幼体斑马鱼的制备
<ol>
	<li>将 [Tg(fabp10a:CFP-NTR)gt1; Tg(Tp1:mCherry)jh11]15,17 成年斑马鱼与 Tg(hand2:EGFP)pd24 13 成年斑马鱼在交配缸中进行配对。使用隔板进行定时交配。</li>
	<li>次日早晨移除隔板，让斑马鱼不受干扰地交配。2小时后通过过滤系统水收集胚胎，并将胚胎转移至含胚胎培养基的100 mm培养皿中。</li>
	<li>每培养皿中培养的胚胎不超过100个。在体视显微镜下，用玻璃移液管去除未受精的卵。将胚胎在28 °C条件下培养，并在受精后10小时（hpf）加入苯硫脲（PTU），使其终浓度为0.003%，以抑制色素发育。</li>
</ol>
3. 幼年斑马鱼中乙醇、甲硝唑处理与肝脏再生
<ol>
	<li>通过将乙醇加入胚胎培养基中，配制终浓度为1.5%的新鲜乙醇溶液。不要添加PTU。</li>
	<li>从56至80 hpf期间，每培养皿使用20 ml乙醇溶液处理胚胎。用塑料封口膜覆盖培养皿，以防止乙醇挥发。</li>
	<li>在80 hpf时，根据CFP表达情况筛选肝脏大小相近的[Tg(fabp10a:CFP-NTR)gt1; Tg(Tp1:mCherry)jh11; Tg(hand2:EGFP)pd24]幼鱼。分选经乙醇处理的幼鱼时不要使用Tricaine，否则会导致后续乙醇/MTZ处理时死亡率显著升高。将筛选后的幼鱼以每培养皿30尾的密度进行培养。</li>
	<li>在胚胎培养基中用0.1% DMSO配制15 mM MTZ的新鲜溶液，并向MTZ溶液中加入适量乙醇，使终浓度达到1.5%。每培养皿加入20 ml乙醇/MTZ溶液，于28 °C孵育幼鱼24小时。用塑料封口膜覆盖培养皿以维持乙醇浓度，并用铝箔包裹以避光。</li>
	<li>处理结束后，通过将幼鱼转移至含有新鲜胚胎培养基的新培养皿中，去除乙醇/MTZ溶液。用胚胎培养基清洗幼鱼3次，并将其置于不含PTU的20 ml胚胎培养基中继续培养。</li>
	<li>为筛选肝细胞几乎完全消融的幼鱼，需在落射荧光显微镜下使用CFP滤光片、80倍放大倍数观察荧光信号。成功的消融表现为肝脏区域CFP荧光极弱，且肝脏体积显著缩小。</li>
	<li>为避免乙醇/MTZ处理后的幼鱼死亡，分选时不得使用Tricaine。可将幼鱼固定后进行免疫染色（参见第5节），或将筛选后的幼鱼在28 °C下继续培养以用于后续分析。</li>
</ol>
4. 经乙醇/MTZ处理的幼年斑马鱼的化学筛选
<ol>
	<li>从 -80 °C 冰箱中取出含有 DMSO 溶解的 10 mM 化合物储备液的 96 孔板（有关商用化合物文库的详细信息，请参见材料列表）。用铝箔覆盖以防止化合物发生光催化降解。在室温下轻轻振荡使其解冻。</li>
	<li>将 &#160;10 mM 储备液用胚胎培养基稀释，配制化合物溶液，终浓度为 50 µM&#160;&#160;（96 孔板用于初筛，1.5 ml 离心管用于复筛）。对照组幼鱼使用等浓度的 DMSO 溶于胚胎培养基中处理。&#160;</li>
	<li>将经 1.5% EtOH/15 mM MTZ 处理并按前述方法分选、肝细胞几乎完全消融的幼鱼转移至预先加入胚胎培养基的 96 孔板（初筛）或 24 孔板（复筛），每孔接种 5 条幼鱼。每种化合物设两个重复孔。</li>
	<li>吸除胚胎培养基，向每孔加入 250 µl（96 孔板）或 500 µl（24 孔板）化合物溶液。用铝箔覆盖孔板，在 28 °C 条件下处理幼鱼 50 小时。每日观察化合物处理的幼鱼状态，并及时移除死亡个体。</li>
	<li>化学处理结束后，在 80 倍放大倍数下，使用 CFP 滤光片在落射荧光显微镜下观察表达 CFP 的肝细胞数量和/或荧光强度。使用数码相机拍摄显示 CFP 阳性肝细胞数量和/或荧光强度增强或减弱的活体幼鱼图像以作记录。</li>
	<li>按照第 5 节所述方法，通过甲醛固定保存幼鱼，用于共聚焦显微成像。</li>
	<li>对初筛中促进肝细胞再生的化合物进行复筛时，应采用 4.1–4.5 节所述步骤，在更高和更低的浓度下检测其活性，以确定最有效的浓度（“复筛”）。</li>
</ol>
5. 幼年斑马鱼固定、免疫染色和共聚焦成像
<ol>
	<li>通过加入Tricaine使其终浓度为0.02%来麻醉幼鱼。将10-15条幼鱼转移至1.5 ml离心管中，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次。吸除PBS，加入1 ml新鲜配制的含2%甲醛的PEM缓冲液，在4 °C条件下过夜固定。 
	注意：甲醛具有刺激性，且已被证实为人类致癌物。操作时应在化学通风橱中进行。</li>
	<li>妥善弃去固定液，随后在室温下用PBS洗涤3次。固定后的幼鱼可在4 °C的PBS中保存数天。建议尽快进行下一步操作，以获得更佳的免疫染色结果。</li>
	<li>在体视显微镜下使用#55镊子小心去除覆盖肝脏区域的卵黄和皮肤。</li>
	<li>在封闭缓冲液（含4%牛血清白蛋白和0.3% Triton X-100的PBS）中于4 °C过夜孵育，以实现幼鱼的通透和封闭。</li>
	<li>将幼鱼与兔抗I型胶原抗体（按1:100比例稀释于封闭缓冲液中）在4 °C下过夜孵育。随后用洗涤缓冲液（含0.3% Triton X-100的PBS）洗涤5次，每次15分钟。</li>
	<li>将幼鱼与AlexaFluor 647标记的驴抗兔抗体（按1:200比例稀释于封闭缓冲液中）在4 °C下过夜孵育。用洗涤缓冲液洗涤5次，每次15分钟，最后再用PBS洗涤一次。</li>
	<li>使用玻璃移液管将幼鱼轻柔转移至载玻片上，并调整固定后的幼鱼使其左侧面向上。用擦镜纸吸除多余的PBS。加入一滴封片剂，用指甲油密封盖玻片。强烈建议立即进行共聚焦成像。</li>
	<li>使用配备40X/1.3油镜的共聚焦系统采集图像。激光强度设置为20-50%。以1 µm为间隔采集Z轴层扫图像。</li>
</ol>
6. 成年斑马鱼的制备
<ol>
	<li>在交配缸中设置 [Tg(fabp10a:CFP-NTR)gt1; Tg(Tp1:mCherry)jh11]15,17 成年斑马鱼的交配。次日早晨通过过滤系统水收集胚胎，并将胚胎转移至含胚胎培养基的100 mm培养皿中。</li>
	<li>每培养皿中培养的胚胎不超过100个。在体视显微镜下，使用玻璃移液管去除未受精的卵。于28 °C培养胚胎，并在受精后10小时（hpf）加入PTU至终浓度0.003%，以抑制色素发育。</li>
	<li>在4 dpf时，使用Tricaine麻醉幼鱼，并筛选出 [Tg(fabp10a:CFP-NTR)gt1; Tg(Tp1:mCherry)jh11] 阳性幼鱼。通过多次更换新鲜胚胎培养基洗去Tricaine。将幼鱼置于28 °C恢复，直至心率达到正常范围（每分钟120–180次）18。</li>
	<li>根据标准操作流程19，将筛选后的幼鱼饲养至6–12个月龄。</li>
</ol>
7. 成年斑马鱼中乙醇、甲硝唑处理与肝脏再生
<ol>
	<li>使用网具将6至12月龄的[Tg(fabp10a:CFP-NTR)gt1; Tg(Tp1:mCherry)jh11]成年斑马鱼转移至交配用鱼缸中。每缸鱼的密度不得超过10尾。</li>
	<li>将乙醇加入系统用水中，配制终浓度为1%的新鲜乙醇溶液。每缸加入500 ml乙醇溶液处理成年斑马鱼，并将其置于28 °C培养箱中维持。</li>
	<li>每日将成年斑马鱼转移至新鲜乙醇溶液中，及时妥善处理死亡个体，按生物危害物处置。在开始甲硝唑（MTZ）处理前，持续乙醇处理72小时。</li>
	<li>在系统用水中加入0.1% DMSO，配制10 mM MTZ的新鲜溶液，并于28 °C培养箱中预热。在1 L的交配用鱼缸中加入500 ml MTZ溶液，在28 °C条件下避光（使用铝箔包裹）处理8小时。</li>
	<li>处理期间每小时观察一次，及时移除死亡个体，并按生物危害物妥善处理。MTZ处理结束后，将鱼转移至新鲜系统用水中清洗两次，以去除残留MTZ。</li>
	<li>将斑马鱼继续在28 °C培养箱中恢复培养。每日喂食并更换新鲜系统用水，直至达到预定分析时间点。</li>
</ol>
8. 成年斑马鱼肝脏固定、免疫染色和共聚焦成像&#160;
<ol>
	<li>用0.02%三卡因麻醉成年鱼，并在冰水中实施安乐死15分钟。用纸巾将鱼体擦干，置于解剖垫上。</li>
	<li>按先前所述方法去除皮肤和肌肉以暴露消化道器官20。使用剪刀沿腹部从肛鳍至鳃盖处剪开皮肤及下方肌肉，然后沿鱼体侧面向后剪至肛鳍。</li>
	<li>将鱼放入15 ml锥形管中，用PBS洗涤一次。弃去PBS，加入4 ml新配制的含2%甲醛的PEM缓冲液，在4 °C下固定过夜（O/N）。</li>
	<li>妥善弃去固定液，于室温下用PBS洗涤3次。固定后的样品可在4 °C的PBS中保存数天。立即进行下一步操作可获得更佳的免疫染色结果。</li>
	<li>通过剪断食管，从鱼体腔中分离出带有肝脏的完整肠道。将消化道器官包埋于含有4%低熔点琼脂糖的切片模具中。</li>
	<li>使用振动切片机在冰冻PBS中以50 µm间隔从前端开始进行横切。用#1号画笔将切片转移至6孔板中的PBS内。</li>
	<li>在阻断缓冲液中于4 °C下透化并封闭切片过夜（O/N）。</li>
	<li>在阻断缓冲液中以1:100稀释兔抗胶原蛋白I抗体，4 °C孵育过夜（O/N）。用洗涤缓冲液洗涤5次，每次15分钟。</li>
	<li>在阻断缓冲液中以1:200稀释AlexaFluor 647标记的驴抗兔抗体，4 °C孵育过夜（O/N）。用洗涤缓冲液洗涤5次，每次15分钟，最后用PBS洗涤一次。</li>
	<li>用#1号画笔将切片轻柔转移至载玻片上。用Kimwipe吸去多余PBS，滴加一滴封片剂，用指甲油封固盖玻片。建议立即进行共聚焦成像。</li>
	<li>使用配备40X/1.3油镜的共聚焦系统采集图像。激光强度设置为20–50%。以1 µm间隔采集Z轴层扫图像。</li>
</ol>

<ol><li>Michalopoulos, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration.</a> J Cell Physiol. 213 (2), 286-300 (2007).</li>
<li>Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+and+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Stem cells and liver regeneration.</a> Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).</li>
<li>Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+epidemiology+of+hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Global epidemiology of hepatitis C virus infection.</a> Lancet Infect Dis. 5 (9), 558-567 (2005).</li>
<li>Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of liver fibrosis.</a> Annu Rev Pathol. 6, 425-456 (2011).</li>
<li>Bataller, R., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Liver fibrosis.</a> J Clin Invest. 115 (2), 209-218 (2005).</li>
<li>Kisseleva, T., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-fibrogenic+strategies+and+the+regression+of+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Pract+Res+Clin+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Anti-fibrogenic strategies and the regression of fibrosis.</a> Best Pract Res Clin Gastroenterol. 25 (2), 305-317 (2011).</li>
<li>Constandinou, C., Henderson, N., Iredale, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+liver+fibrosis+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Modeling liver fibrosis in rodents.</a> Methods Mol Med. 117, 237-250 (2005).</li>
<li>Gabele, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+model+of+interactive+effects+of+alcohol+and+high-fat+diet+on+hepatic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin+Exp+Res%22%5BJournal%5D)">A new model of interactive effects of alcohol and high-fat diet on hepatic fibrosis.</a> Alcohol Clin Exp Res. 35 (7), 1361-1367 (2011).</li>
<li>Lieber, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcoholic+fatty+liver%3A+its+pathogenesis+and+mechanism+of+progression+to+inflammation+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Alcoholic fatty liver: its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis.</a> Alcohol. 34 (1), 9-19 (2004).</li>
<li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).</li>
<li>Jang, Z. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+profiling+of+an+alcoholic+fatty+liver+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Metabolic profiling of an alcoholic fatty liver in zebrafish (Danio rerio).</a> Mol Biosyst. 8 (7), 2001-2009 (2012).</li>
<li>Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+steatosis+in+response+to+acute+alcohol+exposure+in+zebrafish+requires+sterol+regulatory+element+binding+protein+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation.</a> Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).</li>
<li>Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+helix-loop-helix+transcription+factor%2C+heart+and+neural+crest+derivatives+expressed+transcript+2%2C+marks+hepatic+stellate+cells+in+zebrafish%3A+analysis+of+stellate+cell+entry+into+the+developing+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver.</a> Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).</li>
<li>Lin, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+animal+model+for+alcoholic+liver+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Development of an animal model for alcoholic liver disease in zebrafish.</a> Zebrafish. 12 (4), 271-280 (2015).</li>
<li>Huang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+interaction+between+Wnt+and+Notch+activity+modulates+the+regenerative+capacity+of+a+zebrafish+fibrotic+liver+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model.</a> Hepatology. 60 (5), 1753-1766 (2014).</li>
<li>Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroreductase-mediated+cell%2Ftissue+ablation+in+zebrafish%3A+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).</li>
<li>Parsons, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch-responsive+cells+initiate+the+secondary+transition+in+larval+zebrafish+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Notch-responsive cells initiate the secondary transition in larval zebrafish pancreas.</a> Mech Dev. 126 (10), 898-912 (2009).</li>
<li>Baker, K., Warren, K. S., Yellen, G., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+%27pacemaker%27+current+%28Ih%29+in+a+zebrafish+mutant+with+a+slow+heart+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Defective 'pacemaker' current (Ih) in a zebrafish mutant with a slow heart rate.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4554-4559 (1997).</li>
<li>Avdesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regular+care+and+maintenance+of+a+zebrafish+%28Danio+rerio%29+laboratory%3A+an+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction.</a> J Vis Exp. (69), e4196(2012).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (37), (2010).</li>
<li>Paku, S., Schnur, J., Nagy, P., Thorgeirsson, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+structural+evolution+of+the+early+proliferating+oval+cells+in+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Origin and structural evolution of the early proliferating oval cells in rat liver.</a> Am J Pathol. 158 (4), 1313-1323 (2001).</li>
<li>Turner, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatic+stem+cell+and+maturational+liver+lineage+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology.</a> Hepatology. 53 (3), 1035-1045 (2011).</li>
<li>Kodama, Y., Hijikata, M., Kageyama, R., Shimotohno, K., Chiba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+notch+signaling+in+the+development+of+intrahepatic+bile+ducts%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The role of notch signaling in the development of intrahepatic bile ducts.</a> Gastroenterology. 127 (6), 1775-1786 (2004).</li>
<li>Ryback, R., Percarpio, B., Vitale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibration+and+metabolism+of+ethanol+in+the+goldfish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Equilibration and metabolism of ethanol in the goldfish.</a> Nature. 222 (5198), 1068-1070 (1969).</li>
<li>Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+zebrafish+chemical+screening+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Advances in zebrafish chemical screening technologies.</a> Future Med Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).</li>
<li>Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((zebraflash+transgenic+lines+for+in+vivo+bioluminescence+imaging+of+stem+cells+and+regeneration+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish.</a> Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).</li>
<li>Westhoff, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+automated+imaging+pipeline+for+the+analysis+of+the+zebrafish+larval+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of an automated imaging pipeline for the analysis of the zebrafish larval kidney.</a> PLoS One. 8 (12), e82137(2013).</li>
<li>Perlman, Z. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidimensional+drug+profiling+by+automated+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multidimensional drug profiling by automated microscopy.</a> Science. 306 (5699), 1194-1198 (2004).</li>
<li>Chu, J., Sadler, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+school+in+liver+development%3A+lessons+from+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">New school in liver development: lessons from zebrafish.</a> Hepatology. 50 (5), 1656-1663 (2009).</li>
<li>Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+conversion+of+hepatic+biliary+epithelial+cells+to+hepatocytes+after+near+total+loss+of+hepatocytes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish.</a> Gastroenterology. 146 (3), 776-788 (2014).</li>
<li>He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+liver+after+extreme+hepatocyte+loss+occurs+mainly+via+biliary+transdifferentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish.</a> Gastroenterology. 146 (3), 789-800 (2014).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+structure%2C+enzyme+histochemistry%2C+and+immunohistochemistry+of+liver+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Fine structure, enzyme histochemistry, and immunohistochemistry of liver in zebrafish.</a> Anat Rec (Hoboken). 295 (4), 567-576 (2012).</li>
<li>Yovchev, M. I., Xue, Y., Shafritz, D. A., Locker, J., Oertel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repopulation+of+the+fibrotic%2Fcirrhotic+rat+liver+by+transplanted+hepatic+stem%2Fprogenitor+cells+and+mature+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Repopulation of the fibrotic/cirrhotic rat liver by transplanted hepatic stem/progenitor cells and mature hepatocytes.</a> Hepatology. 59 (1), 284-295 (2014).</li>
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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

我们在乙醇/甲硝唑（EtOH/MTZ）处理后的恢复期肝脏中观察到肝前体细胞（HPC）介导的肝细胞再生，表明即使存在大量包括纤维性I型胶原在内的细胞外基质（ECM）蛋白，HPC仍保持向肝细胞再生的能力。仅使用甲硝唑（MTZ）处理并未显著增加ECM蛋白的沉积，而仅使用乙醇（EtOH）处理则未诱导HPC活化。15通过联合使用乙醇（EtOH）和甲硝唑（MTZ）处理，我们能够研究纤维化肝脏中肝前体细胞（HPC）驱动的再生过程。由于接近完全的肝细胞清除会引发HPC介导的肝细胞再生，因此根据肝细胞特异性荧光缺失以及由聚集的NRCs导致的肝脏体积显著缩小这两项标准，对MTZ处理后的幼鱼进行筛选至关重要。在鱼类中，鳃和皮肤的血管可吸收酒精24，因此无需让动物饮水 随意摄取 或需要像哺乳动物模型那样进行胃内灌注。我们将经乙醇（EtOH）处理后继而接受甲硝唑（MTZ）处理的成年斑马鱼分别饲养在无循环水的独立鱼缸中。每天必须将鱼转移至新鲜的乙醇溶液中，并盖上盖子以尽量减少乙醇的挥发。尽管在我们的实验方案中，48–72小时的乙醇/甲硝唑处理能有效诱导细胞外基质蛋白的合成，但这些鱼类并未发展出晚期纤维化...

尽管肝细胞（肝脏主要的实质细胞类型）具有显著的再生能力1，但在慢性肝衰竭情况下，这种能力会受到损害，从而导致依赖肝前体细胞（HPC）的再生过程2。
慢性肝损伤主要源于酒精滥用、慢性丙型肝炎病毒（HCV）感染3以及非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）4。这些因素导致持续性的肝纤维化，其特征是细胞外基质（ECM）蛋白的积聚。持续的ECM积聚通过形成纤维瘢痕组织破坏正常的肝组织结构5，进而导致肝硬化，具有较高的发病率和死亡率。目前已有多种尝试主要通过抑制促纤维化细胞因子和活化的肌成纤维细胞来减轻纤维化反应6。其中，活化的肌成纤维细胞主要来源于肝星状细胞（HSCs），后者是肝脏中主要的非实质细胞，负责肝瘢痕的形成4。然而，在持续存在促纤维化损伤的情况下，利用包括肝前体细胞（HPCs）在内的内源性细胞来源促进肝细胞再生的再生疗法仍有待进一步研究。
已有多种哺乳动物肝纤维化实验模型被报道。反复注射四氯化碳（CCl4）已广泛用于诱导小鼠和大鼠模型的肝纤维化7。当高脂（HF）饮食与酒精联合使用时，可显著上调促纤维生成基因的表达并导致肝纤维化8。尽管脂肪变性（脂质积聚）是由急性酒精暴露引起的，但它会使肝脏更容易受到更严重的肝损伤9。
斑马鱼（Danio rerio）已成为研究再生过程的一种极为重要的脊椎动物模型系统。尽管其他低等脊椎动物如蝾螈和墨西哥钝口螈也具有显著的再生能力，但在基因操作和可视化策略方面，斑马鱼在调控潜在再生因子的研究中相较于其他模型系统具有优势10。此外，通过向水中添加乙醇（EtOH），斑马鱼还成为研究酒精性肝病（ALD）的理想脊椎动物模型。对幼体和成年斑马鱼进行急性EtOH暴露可导致肝脂肪变性11-13。当成年斑马鱼接受长期EtOH暴露时，可观察到胶原沉积，并伴随纤维化相关基因的上调14。然而，目前仍需建立相应的模型，以研究在EtOH作为致纤维化刺激因素条件下肝脏的再生过程。
近期，我们建立了一种乙醇（EtOH）诱导的斑马鱼纤维化肝模型15。我们将肝细胞特异性的遗传消融系统与幼体及成体斑马鱼的乙醇处理相结合。我们构建了两个转基因品系：Tg(fabp10a:CFP-NTR)gt1 和 Tg(fabp10a:mCherry-NTR)gt2，其中大肠杆菌（E.coli）硝基还原酶（NTR）分别与青色荧光蛋白和mCherry荧光蛋白融合，并在肝细胞特异性启动子脂肪酸结合蛋白10a，肝基础（fabp10a）的调控下表达。在此系统中，NTR可将无毒前药甲硝唑（MTZ）转化为DNA链间交联剂16，从而特异性诱导肝细胞死亡。利用该模型，我们证明了一群对Notch信号有响应的肝细胞在几乎无正常肝细胞且细胞外基质（ECM）大量沉积的环境下可转化为肝细胞。我们将这些细胞命名为肝前体细胞（HPCs）。此外，通过化学筛选，我们鉴定出能够激活Wnt信号通路并抑制Notch信号通路的小分子化合物，这些化合物可促进纤维化肝脏中的肝细胞再生。因此，我们的斑马鱼纤维化肝模型相较于基于细胞培养或哺乳动物的筛选系统，是一种极为优越的化学筛选平台。该模型是一种体内（in vivo）系统，具有显著的成本和时间优势。本文详细描述了建立乙醇诱导的斑马鱼纤维化肝模型以及利用该模型进行化学筛选的具体操作步骤。此外，我们还进行了时间序列分析，以探究在纤维化肝脏中肝细胞再生的发生过程。本实验方案将为研究促进纤维化肝脏中肝细胞再生的机制与策略提供一种极为宝贵的工具。

<table><tbody><tr><td>半水合硫酸钙（CaSO₄·0.5H₂O）&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>顶体</td><td>AC385355000</td><td></td></tr><tr><td>硫酸镁（MgSO₄）&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>EMD</td><td>MX0075</td><td></td></tr><tr><td>1,4-哌嗪二乙磺酸（PIPES）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>乙二醇-双(2-氨基乙基醚)-&lt;br /&gt;&lt;em&gt;N,N,N&amp;prime;，N&amp;prime;&lt;/em&gt;四乙酸（EGTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof</td></tr><tr><td>甲醛</td><td>Fisher Scientific</td><td>F79-500</td><td></td></tr><tr><td>甲硝唑（MTZ）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3761</td><td></td></tr><tr><td>1-苯基-2-硫脲（PTU）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>3-氨基苯甲酸乙酯（Tricaine）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）片剂</td><td>Amresco</td><td>E404</td><td>将一片药片溶于100 ml蒸馏水中</td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖&amp;nbsp;</td><td>Amresco</td><td>BP165</td><td></td></tr><tr><td>干细胞信号化合物库</td><td>Selleck Chemicals</td><td>L2100</td><td>10&amp;nbsp;DMSO 中的 mM 原液</td></tr><tr><td>ActiProbe-1K 文库</td><td>Timtec</td><td>ActiProbe-1K</td><td>10&amp;nbsp;DMSO 中的 mM 储存液</td></tr><tr><td>SB 415286</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2729</td><td>用DMSO溶解至10&amp;nbsp;mM</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S2924</td><td>用DMSO溶解至10&amp;nbsp;毫摩尔（mM）</td></tr><tr><td>抗胶原蛋白 I 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab23730</td><td>免疫染色使用比例为1:100，可与鱼类反应</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 驴抗兔 IgG (H+L)</td><td>分子探针</td><td>A31573</td><td>免疫染色使用比例为1:200</td></tr><tr><td>封片剂（Vectorshield）</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>24孔板</td><td>VWR</td><td>10062-896</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td>Dumont #55</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td>75x25 mm</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR</td><td>48366-045</td><td>18 mm</td></tr><tr><td>塑料封口膜</td><td>Fisher Scientific</td><td>22305654</td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Fisher Scientific</td><td>1213100</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Leica</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>蔡司</td><td>LSM700</td><td></td></tr></tbody></table>

建立乙醇诱导的斑马鱼肝纤维化模型以研究前体细胞介导的肝细胞再生

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

持续的肝纤维化伴随细胞外基质（ECM）蛋白的不断积聚，会导致肝脏细胞功能丧失，进而引发肝硬化及肝细胞功能障碍。在多种肝脏损伤因素中，酒精滥用可导致严重的健康问题，包括肝功能衰竭和肝细胞癌。然而，针对酒精刺激后再生肝细胞的内源性细胞来源，目前尚未得到充分研究。此外，关于酒精诱导损伤后肝细胞再生的有效模型也鲜有报道。我们近期报道了一种在斑马鱼中建立的乙醇（EtOH）诱导肝纤维化模型，在该模型中，肝前体细胞（HPCs）在纤维化刺激存在的情况下，于几乎完全丧失肝细胞后再生为新的肝细胞。进一步地，利用该模型进行的小分子化合物筛选，我们鉴定出多种可促进肝细胞再生的小分子。本文详细描述了在斑马鱼中建立乙醇诱导肝纤维化模型以及利用该模型进行化合物筛选的具体操作步骤。该方案将成为解析纤维化肝脏中肝细胞再生分子与细胞机制的关键工具。此外，这些方法将有助于在活体（in vivo）条件下发现治疗慢性肝病的新型治疗策略。

图1 展示了在斑马鱼幼体中建立乙醇诱导的纤维化肝模型的方法。为了优化斑马鱼幼体暴露于乙醇（EtOH）的实验方案，我们首先评估了乙醇的毒性。受精后2.5天（dpf）的幼体分别暴露于1%、1.5%或2%的乙醇浓度中24小时，随后进行24小时的乙醇与甲硝唑（MTZ）联合处理。2%乙醇处理导致高死亡率，而暴露于1%或更低浓度乙醇的幼体几乎全部存活，且纤维化改变轻微，仅偶见胶原等细胞外基质蛋白的沉积。根据这些结果，选择1.5%乙醇对幼体进行24小时预处理（2.5–3.5 dpf），随后在3.5–4.5 dpf期间同时给予MTZ处理24小时。图1A）。经EtOH/MTZ处理的幼鱼表现出形态学异常，包括躯干和尾部向上弯曲、心包水肿以及 swim bladder 无法充气。图1B）。我们使用了三种转基因品系来分析乙醇/甲硝唑处理后幼鱼肝脏中的纤维化改变：1） Tg(fabp10a:CFP-NTR)gt1 该品系在肝细胞特异性启动子...

持续的纤维化伴随过量细胞外基质蛋白沉积可导致肝硬化。酒精滥用是严重肝病的主要病因之一。我们建立了一种乙醇诱导的斑马鱼肝纤维化模型，用于研究酒精诱导损伤后促进肝细胞再生的机制与策略。

持续的肝纤维化伴随细胞外基质（ECM）蛋白的不断积聚，导致肝脏细胞功能丧失，进而引发……

本实验方案的总体目标是建立乙醇诱导的斑马鱼纤维化肝模型，并利用该模型进行化学筛选。该方法有助于回答肝脏再生领域中的关键科学问题，例如肝细胞在纤维化肝脏中再生的分子与细胞机制。该技术的主要优势在于，它在体外化学筛选中具有成本效益高且节省时间的特点。此外，通过单细胞的可视化，可进行详细的动态过程分析。演示该实验操作的将是来自实验室的博士后 Mianbo Huang 和研究生 Jin Xu。根据文本方案配制试剂后，使用携带脂肪酸结合蛋白10a:CFP-NTR与Tp1:mCherry以及Tg(hand2:EGFP)的成年转基因斑马鱼（Zebrafish），设置带有隔离板的交配缸。次日早晨，在移除隔离板两小时后，通过过滤系统水收集胚胎，并将胚胎转移至含有胚胎培养基的100毫米培养皿中。在受精后56小时（即HPF），向胚胎中加入1.5%乙醇。用塑料薄膜覆盖培养板，以防止乙醇蒸发。然后在 28 摄氏度下孵育 24 小时。配制新鲜的 15 毫摩尔 MTZ 和含 0.1% DMSO 的胚胎培养基，并加入乙醇使其终浓度为 1.5%。随后，在80 HPF时，每皿加入20毫升乙醇MTZ溶液处理分选后的胚胎。用塑料封口膜封住培养皿以防止乙醇挥发，并用铝箔包裹以避光。然后在28摄氏度下孵育24小时。次日，使用CFP滤光片和80倍放大倍数，在落射荧光显微镜下观察胚胎，筛选出肝细胞几乎完全消融的幼虫。为进行化合物筛选，从−80 °C冰箱中取出含有DMSO中10 mM化合物储备液的96孔板。用铝箔覆盖孔板以防止化合物发生光催化降解，并在室温下轻轻振荡使其解冻。在1.5毫升离心管中，通过将5微升10毫摩尔的母液用1毫升胚胎培养基稀释，配制终浓度为50微摩尔的化学溶液。随后，将肝细胞几乎完全消融的5条幼虫转移至含有胚胎培养基的24孔板中，每孔5条。然后，吸除胚胎培养基，并向每孔加入500微升上述化学溶液。用铝箔覆盖培养板，并在28摄氏度下孵育幼虫50小时。孵育结束后，在落射荧光显微镜下以80倍放大倍数观察表达CFP的肝细胞的数量和/或荧光强度。对表达CFP的肝细胞数量增多或减少和/或荧光强度改变的活体幼虫进行成像。将携带脂肪酸结合蛋白10a:CFP-NTR和TP1:mCherry的转基因斑马鱼进行交配，并将筛选出的幼鱼培育至6至12个月龄。使用网具将成年转基因斑马鱼转移至交配缸中。用系统用水新鲜配制1%乙醇溶液，然后取500毫升该溶液替换交配缸中的系统用水。将鱼缸在 28 摄氏度下孵育 72 小时，在孵育期间每天将鱼转移至新鲜的乙醇溶液中，并移除任何死亡的鱼。在系统水中配制含 0.1% DMSO 的新鲜十毫摩尔 MTZ 溶液，然后向一升交配鱼缸中的鱼加入 500 毫升预热的 MTZ 溶液。使用铝箔覆盖鱼缸。在28摄氏度下孵育八小时，并按照正文方案进行分析。根据正文方案麻醉后，使用剪刀从肛门鳍至鳃盖沿腹部剪开皮肤及下方肌肉，暴露胃肠道器官。然后沿鱼体侧面从背部向后剪至肛门鳍。将鱼放入一个15毫升的锥形管中，用PBS洗涤一次。随后移除PBS，加入4毫升新配制的含3%甲醛的PEM缓冲液。在4°C下孵育过夜以固定鱼体。次日，按照文本方案洗涤样本后，剪开食管，从体腔中分离出连同肝脏的整个消化道。然后将胃肠道器官置于切片模具中，用4%低熔点琼脂糖包埋组织。接着将组织块修整为梯形，并将其黏附至底座上。然后使用振动切片机，从组织的内端开始，以50 μm的间隔将样本切成横截面，并收集到冰冷的PBS中。用1号画笔将切片转移至含有PBS的6孔板中。根据文本方案对切片进行免疫染色后，用1号画笔小心地将切片转移至载玻片上。用擦镜纸除去多余的PBS，然后滴加一滴封片剂并加盖盖玻片。接着用指甲油密封盖玻片。最后，使用配备40倍1.3数值孔径油镜的共聚焦系统，以20%至50%的强度、1微米间隔采集Z轴层扫图像。该图显示，经乙醇和MTZ处理的幼虫出现躯干和尾部上弯、心包水肿以及 swim bladder 无法充气的现象。如图所示，经DMSO处理的对照组肝脏未见纤维连接蛋白I型胶原沉积；而经乙醇和MTZ处理的肝脏在消融后25和50小时显示出明显的I型胶原积聚增加。此外，与经DMSO处理的对照组肝脏相比，乙醇联合MTZ处理的再生肝脏中肝星状细胞（HSC）数量增加，并呈现类似肌成纤维细胞的形态，缺乏胞质突起。该图展示了在成年斑马鱼中通过1%乙醇联合MTZ处理建立乙醇诱导的肝纤维化模型。通过这些时间过程分析发现，在消融后第2、3、4天，乙醇联合MTZ处理的再生肝脏中I型胶原沉积显著升高，相较于DMSO处理的肝脏。在此化学筛选实验中，肝细胞在含有1.5%乙醇和15毫摩尔MTZ的条件下被消融，随后将幼虫暴露于化学物质中50小时。多种wint激动剂，如糖原合成酶激酶-3抑制剂以及wint激活剂，与DMSO相比均促进了肝细胞再生。这些数据表明，这种持续性纤维化模型为发现促进肝细胞再生的小分子提供了宝贵的工具。一旦掌握，若操作得当，该技术可在一周内完成。在实施该过程时，需牢记实现肝细胞近乎完全消融，并在整个过程中维持乙醇浓度。通过该方案，可测试已鉴定化学化合物在哺乳动物肝损伤模型中的有效性。该技术建立后，将为细胞再生治疗领域开辟新的途径，有助于探索针对慢性肝衰竭患者的新治疗策略。观看本视频后，您应能充分掌握如何建立乙醇诱导的斑马鱼纤维化肝模型，以及如何开展化合物筛选。请注意，使用甲醛可能具有极高危险性，进行本操作时应始终采取预防措施，例如佩戴手套并在化学通风橱中操作试剂。

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科研

JoVE Journal

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发育生物学

乙醇引起的肝纤维化模型的斑马鱼发展研究祖细胞介导的​​肝细胞的再生

为了理解乙醇诱导的发育损伤的分子机制，我们建立了一种乙醇暴露的斑马鱼模型，并正在探索乙醇暴露后发生的物理、细胞和遗传改变1。随后，我们试图在此动物模型中寻找潜在的干预措施并快速对其进行测试。...

评估酒精暴露胎儿斑马鱼模型中的致畸变化

代谢记忆是指即使通过药物实现正常血糖后，糖尿病并发症仍持续进展的现象。本文描述了一种独特的糖尿病斑马鱼模型，可用于研究代谢记忆中可通过有丝分裂遗传的表观遗传组分 体内.

糖尿病及代谢记忆的斑马鱼模型

为了帮助评估斑马鱼胆管驱动的肝脏再生背后的分子机制，我们建立了一种肝损伤模型，该模型中表达硝基还原酶的肝细胞在甲硝唑处理后被遗传性消融。在本方案中，我们描述了如何熟练地操作、监测和分析肝细胞消融及胆管驱动的肝脏再生过程。...

斑马鱼肝细胞特异性消融以研究胆管驱动的肝脏再生

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斑马鱼急性酒精性肝损伤的组织学分析

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利用明场显微镜定量斑马鱼幼鱼肝脏大小

本研究介绍了一种利用顶空气相色谱法测定斑马鱼胚胎中乙醇含量的实验方案，内容涵盖从适当的暴露方法到胚胎处理及乙醇分析的全过程。...

利用顶空气相色谱法测定斑马鱼胚胎中的乙醇含量

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本研究描述了一种模块化Tol2转基因系统方案，该方法基于Gateway克隆技术，用于构建转基因载体并将其注射到斑马鱼胚胎中。...

斑马鱼 Tol2 系统：一种基于 Gateway 的模块化与可变转基因方法

本文介绍了一种在受精后至少1至7天内的任何阶段，对斑马鱼胚胎和幼鱼进行细胞移植的实验方案，可实现高时空分辨率的移植操作。...

高分辨率细胞移植在胚胎期和幼体期斑马鱼中的应用

了解利用斑马鱼建立乙醇诱导肝纤维化模型的方法，研究肝细胞再生的分子机制。该技术具有成本效益，可用于化学筛选和单细胞可视化分析，为开发肝病治疗策略提供重要工具。

建立乙醇诱导的斑马鱼肝纤维化模型以研究前体细胞介导的肝细胞再生

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