乙醇引起的肝纤维化模型的斑马鱼发展研究祖细胞介导的​​肝细胞的再生

该方案的总体目标是在斑马鱼中建立乙醇诱导的纤维化肝脏模型，并使用该模型进行化学筛选。这种方法可以帮助回答肝脏再生领域的关键问题。例如肝细胞如何在纤维化肝脏中再生的分子和细胞机制。

该技术的主要优点是，它在 vevo 化学筛选中具有成本效益且节省时间。此外，可以通过单个单元格的可视化来执行详细的时程分析。演示该程序的博士后 Mianbo Huang 和实验室的研究生 Jin Xu 将负责演示。

根据文本方案制备试剂后，使用含有脂肪酸结合蛋白 10a：CFP-NTR 的成年转基因斑马鱼与 Tp1：mCherry 和 Tg（hand2：EGFP）斑马鱼设置带有分隔器的交配罐。第二天早上，在移除隔板两小时后，通过过滤系统水并将胚胎转移到含有胚胎培养基的 100 毫米培养皿中来收获胚胎。在受精后 56 小时 （HPF），向胚胎中加入 1.5% 的乙醇。

使用保鲜膜盖住板以防止乙醇蒸发。然后在 28 摄氏度下孵育 24 小时。用 0.1% DMSO 制备新鲜的 15 毫摩尔 MTZ 和胚胎培养基，并加入乙醇至终浓度为 1.5%。

然后，在 80 HPF 下，每个培养皿用 20 毫升乙醇 MTZ 溶液处理分选的胚胎。使用保鲜膜盖住板以防止乙醇蒸发，并用铝箔覆盖以避光。然后在 28 摄氏度下孵育 24 小时。

第二天，使用 CFP 滤光片和 80 倍放大倍率在落射荧光显微镜下观察胚胎，以分选出几乎完全消融肝细胞的幼虫。要进行化学筛选，请从负 80 度冰箱中取出含有 10 毫摩尔 DMSO 化学储备液的 96 孔板。使用铝箔覆盖板以防止化学品的光催化降解，并在室温下轻轻摇动解冻。

在 1.5 毫升试管中，用 1 毫升胚胎培养基稀释 5 微升 10 毫摩尔储备溶液至终浓度为 50 微摩尔，以制备化学溶液。接下来，将每孔 5 只幼虫以接近完全的回转细胞消融转移到充满胚胎培养基的 24 孔板中。然后，去除胚胎培养基并向每个孔中加入 500 微升化学溶液。

用铝箔盖住板，并在 28 摄氏度下孵育幼虫 50 小时。孵育后，在表观显微镜下以 80 倍放大倍率观察表达 CFP 的肝细胞的数量和/或强度。对表达 CFP 的回传细胞数量和/或强度增加或减少的活幼虫进行成像。

将含有脂肪酸结合蛋白 10a：CFP-NTR 的转基因斑马鱼与 TP1：mCherry 进行交配，并将分选的幼虫饲养到 6 至 12 个月大。使用网将成年转基因斑马鱼转移到交配罐中。在系统水中制备新鲜的 1% 乙醇，然后使用 500 毫升溶液替换配套罐中的系统水。

将水箱在 28 摄氏度下孵育 72 小时，将鱼转移到新鲜的乙醇溶液中，并在孵化期间每天清除任何死鱼。在含有 0.1% DMSO 的系统水中制备新鲜的 10 毫摩尔 MTZ 溶液，然后将 500 毫升预热的 MTZ 溶液添加到 1 升交配池中的鱼中。使用铝箔覆盖水箱。

在 28 摄氏度下孵育 8 小时，并根据文本方案进行分析。根据文本方案麻醉后，用剪刀剪开皮肤，并沿着从臀鳍到鳃盖的腹部肌肉下划线，暴露胃肠道器官。然后沿着鱼的侧面向后切回臀鳍。

将鱼放入 15 毫升锥形管中，用 PBS 洗涤一次。然后去除 PBS，并在 PEM 缓冲液中加入 4 毫升新鲜制备的 3% 甲醛。在 4 摄氏度下孵育过夜以固定鱼。

第二天，根据文本方案清洗样本后，切开食道，从体腔中解剖整个肠道和肝脏。然后将胃肠道器官放入切片模具中，并使用 4% 的低熔点琼脂糖包埋组织。接下来，将块修剪成梯形并将其粘在底座上。

然后使用振动切片机，从组织的内端开始，以 50 微米的间隔将样品切成横向切片，以冰冷的 PBS 进行。使用一号画笔将切片转移到含 PBS 的六孔板上。根据文本方案对切片进行免疫染色后，使用 1 号画笔轻轻地将切片转移到载玻片上。

使用 kimwipes 去除多余的 PBS，然后添加一滴封固剂和盖玻片。然后用指甲油密封盖玻片。最后，使用配备 40x 1.3 NA 油透镜的共聚焦系统，以 20% 至 50% 的强度和 1 微米安培的间隔捕获 Z 堆栈图像。

该图显示乙醇 MTZ 处理的幼虫躯干和尾巴向上弯曲，paricardialidema，并且无法使鱼鳔充气。如图所示，DMSO 处理的对照肝脏显示腓骨 1 型胶原沉积。而乙醇 MTZ 处理的肝脏在消融后 25 小时和 50 小时表现出 1 型胶原蛋白积累增加。

此外，与 DMSO 处理的对照肝脏相比，HSC 的数量增加，并在乙醇 MTZ 处理的再生肝脏中采用缺乏细胞质过程的肌原纤维母细胞样形状。该图显示了乙醇诱导的纤维化肝模型在成年斑马鱼中用 1% 乙醇处理，然后用 MTZ 处理。从这些时间进程分析中，与 DSMO 处理的肝脏相比，在消融后 2 天、 3 天和 4 天观察到乙醇 MTZ 处理的再生肝脏中 1 型胶原蛋白沉积显着升高。

在该化学筛选实验中，在 1.5% 乙醇和 15 毫摩尔 MTZ 存在下消融肝细胞。然后将幼虫暴露于化学品中 50 小时。与 DMSO 相比，许多 Wint 激动剂，例如糖原合成酶激酶-3 抑制剂和 Wint 激活剂，可促进肝细胞再生。

这些数据表明，这种持续的纤维化模型为发现增强肝细胞再生的小分子提供了宝贵的工具。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在一周内完成。在尝试此程序时，重要的是要记住实现肝细胞的近乎完全消融，并在整个过程中保持乙醇浓度。

按照此程序，可以在哺乳动物肝损伤模型中测试已鉴定化合物的效率。该技术开发后，可以在细胞再生治疗领域开辟新的途径，以探索慢性肝衰竭患者新治疗策略的潜在发现。看完这个视频，你应该对如何在斑马鱼中建立乙醇诱导的纤维化肝脏模型以及如何进行化学筛选有一个很好的了解。

不要忘记，与甲醛一起工作可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如戴手套和在化学通风橱中处理试剂。