制备与分析 体外 三维乳腺癌替代模型

本系列实验方案的总体目标是建立三维细胞培养模型，作为体外乳腺癌替代模型，并介绍一种在替代模型的组织学切片中测量细胞生长的方法。与二维细胞培养相比，三维细胞培养是一种在体外更符合生理条件的细胞行为模拟方法。通过在实验条件下改变细胞组成，该系列方案可被调整以解决多种生物学问题，并评估候选治疗药物的有效性。

为将细胞掺入细胞外基质（ECM），请在冰上操作，将细胞以及随附文稿中表一列出的前四种相关组分加入一个2毫米的微量离心管中。接下来，用移液器轻轻混匀，避免产生气泡。利用10XD MEM中的酚红监测pH值，确保混合液呈现橙粉色，表明pH为7。

如果混合物呈黄色且pH值过低，应逐滴缓慢加入7.5%碳酸氢钠，直至达到适当颜色。注意始终保持混合物处于冰上，并迅速操作，以防止细胞外基质（ECM）过早聚合。对于固体3D培养，应将腔室载玻片置于冰上，以防止细胞外基质（ECM）过早聚合。

将100微升细胞外基质（ECM）混合物缓慢加入八孔板的每个孔中，并将细胞ECM混合物沿孔的边缘吹打，以帮助更均匀地分布。接着，将类器官在37摄氏度、5% CO2条件下孵育45分钟，以促进ECM聚合。45分钟后，向每个孔中加入100微升培养基，并在37摄氏度和5% CO2条件下继续孵育，直至实验结束。

每隔两天更换一次培养基。三维培养的一个局限性在于，氧气和营养物质向培养物内部的扩散可能不足以维持细胞活力。引入生物反应器系统有助于克服这一限制，并促进细胞生长。

为了在生物反应器系统中进行三维培养，需无菌地准备并组装用于容纳替代物的生物反应器部分。在细胞培养罩内，使用带有26号针头的注射器，将细胞外基质（ECM）混合物注入灌注式生物反应器中设计用于容纳细胞的区域，并立即进入下一步操作。为确保细胞在替代物内分布更加均匀，将装载有替代物的生物反应器组件放入50毫升锥形管中。

以18 rpm持续旋转替代物，在原位杂交炉或培养箱中37摄氏度孵育45分钟，以促进细胞外基质（ECM）聚合。聚合完成后加入培养基，将生物反应器组件连接至泵。在37摄氏度、5% CO2的培养箱中开始培养基灌注。

在实验期间持续进行培养基灌注，并根据具体实验设计的需要更换培养基。实验结束时，将模拟物包埋于标本处理凝胶中，以确保在后续处理过程中模拟物保持完整，并便于进行组织学切片。操作时，将标本处理凝胶置于60°C水浴中加热至完全融化，待用。

然后，用移液器将约 300 微升标本处理凝胶加入已标记的冷冻模具底部。使用手术刀片和镊子，小心地从生物反应器或八孔腔室载玻片的孔中取出一个替代物，并将其放入含有标本处理凝胶的冷冻模具中。再用移液器加入约 300 微升标本处理凝胶，以完全覆盖冷冻模具中的替代物。

然后在 4 摄氏度下孵育 30 分钟。待标本处理凝胶凝固后，将含有替代物的标本处理凝胶从冷冻模具中取出，并放入组织包埋盒中。如果需要将多个替代物放入同一个组织包埋盒中，可在固定和处理后使用组织标记染料以区分样品。

随后，将含有替代物的组织包埋盒置于10%中性缓冲福尔马林溶液中，在室温下固定10至12小时，以确保完全固定。固定完成后，将含有替代物的组织包埋盒转移至70%乙醇中。固定好的替代物现已可进行石蜡包埋及后续组织学切片处理。

为了测量细胞密度以及H和E染色切片的显微图像，打开替代样本的图像文件。在ImageJ中使用多边形工具，并以细胞外基质（ECM）的边缘为参考，通过拖动鼠标并单击以创建锚点，勾勒出替代样本的区域。完成勾勒后，在“分析”选项卡下选择“测量”。

接下来，通过将用于测量替代区域的图像文件拖拽到文件列表中，将其上传至 Cell Profiler。然后，在“名称和类型导入”模块中为每个导入的图像分配名称，并选择图像类型。分析流程生成后，启动测试模式，然后在 Cell Profiler 中点击运行。

评估过滤后的对象，确保测试图像中的大部分细胞核被准确识别，并选择最佳参数以识别细胞。被包含的细胞核将以绿色圈出。然后保存项目，退出测试模式，并点击“分析图像”。

图中显示的是灌注型替代物培养七天后H&E染色切片的代表性图像。这是固体替代物培养七天后H&E染色切片的代表性图像，培养基每两天更换一次。固体替代物中的细胞密度明显较低。

该图表显示了生长七天后每单位面积内有核细胞平均数量的比较结果。一种灌注型与实心型替代物。这些数值数据支持了苏木精和伊红染色切片显微照片中的细胞密度。

该图显示了Ki-67标记指数的比较结果，该指数用于衡量灌注型和实体型替代组织在培养7天后的细胞增殖情况。这些数据再次支持灌注型替代组织具有更强的生长能力。在此步骤之后，可对替代组织的组织学切片进行原位杂交和氨基酸组织化学等其他方法，以研究RNA和蛋白质的表达等问题。

观看本视频后，您应能够充分理解如何制备和处理三维体外组织替代物，并对经 H 和 E 染色的组织学切片进行替代物分析。