制备及分析体外三维乳腺癌代理项

这套程序的总体目标是生成三维细胞培养物以用作体外乳腺癌替代物，并提出一种测量替代物组织学切片中细胞生长的方法。与二维细胞培养相比，三维细胞培养是一种在体外模拟细胞行为的生理学上更相关的方法。通过在实验条件下改变细胞组成，这套程序可以适应解决各种生物学问题，并评估候选疗法的疗效。

为了将细胞掺入 ECM 中，在冰上，将细胞和随附手稿表 1 中列出的前四个相关成分加入 2 毫米微量离心管中。接下来，通过移液轻轻混合它们，避免形成任何气泡。使用 10XD MEM 中的酚红监测 pH 值，确保混合物呈橙粉色，表明 pH 值为 7。

如果混合物呈黄色且 pH 值太低，请缓慢加入 7.5% 的碳酸氢钠，一次一滴，直到达到适当的颜色。请记住将混合物保存在冰上，并迅速工作以防止 ECM 过早聚合。对于固体 3D 培养物，将腔室载玻片保持在冰上，以防止 ECM 过早聚合。

将 100 微升细胞 ECM 混合物缓慢移液到八孔室载玻片的每个孔中，并将细胞 ECM 混合物移液到孔的边缘，以帮助更好地分配混合物。接下来，将替代物在 37 摄氏度、5% CO2 下孵育 45 分钟，以允许 ECM 聚合。45 分钟后，向每个孔中加入 100 微升培养基，并在 37 摄氏度和 5% 的 CO2 下孵育整个实验期间。

每两天更换一次培养基。3D 培养的一个局限性是氧气和营养物质扩散到体积中可能不足以支持细胞活力。添加生物反应器系统可能有助于克服这一限制并促进生长。

要在生物反应器系统中大量 3D 培养物，请以空间方式准备和组装生物反应器系统中容纳替代物的部分。在细胞培养罩中，使用带有 26 号针头的注射器，将细胞 ECM 混合物注射到设计用于容纳细胞的灌注生物反应器区域，然后快速进行下一步。为确保细胞在替代物内分布更均匀，请将容纳替代物的生物反应器组件放入 50 毫升锥形管中。

18 rpm 的速度连续旋转替代物，同时在 37 摄氏度下在原位杂交炉或培养箱中孵育 45 分钟，以允许 ECM 聚合。聚合并添加介质后，将生物反应器组件连接到泵上。在 37 摄氏度、5% CO2 的培养箱中开始培养基灌注。

在实验期间继续培养基灌流，并根据特定实验设计的要求更换培养基。在实验结束时，将替代物包裹在标本处理凝胶中，以在处理过程中保持替代物完整，并促进组织学切片。为此，将样品处理凝胶在 60 摄氏度的水浴中熔化，直到准备好使用。

然后，将大约 300 微升样品处理凝胶移液到标记的低温模具底部。使用手术刀刀片和镊子，小心地从生物反应器或 8 孔室载玻片的孔中取出替代物，并将其放入含有样品处理凝胶的冷冻模具中。移液大约 300 微升样品处理凝胶以覆盖冷冻模具中的替代物。

然后，在 4 摄氏度下孵育 30 分钟。样本处理凝胶凝固后，从低温模具中取出含有替代物的样本处理凝胶，并将其放入组织盒中。如果要将多个替代物放入同一个组织盒中，则在固定和处理后，可以使用组织标记染料来区分样品。

随后，将含有替代物的组织盒放入 10% 中性缓冲配方奶粉中，在室温下放置 10 至 12 小时，以完全固定。固定后，将含有替代物的组织盒转移到 70% 乙醇中。固定的替代物现在可以处理为石蜡和随后的组织学切片。

要测量 H 和 E 染色切片的细胞密度和照片显微图像，请打开代理物的图像文件。使用 ImageJ 中的多边形工具和 ECM 的边缘作为指导，通过拖动鼠标并单击来绘制代理项的区域，以制作锚点。列出轮廓后，选择 Analyze 选项卡下的 Measure。

接下来，通过将图像文件拖到文件列表中，将用于测量代理面积的图像文件上传到 Cell Profiler 中。然后，为 Names and Types Import 模块中导入的每个图像分配一个名称，并选择图像类型。生成分析管道后，启动 Test Mode 并单击 Run in Cell Profiler。

并评估过滤后的对象，以确保测试图像中的大部分细胞核得到适当识别，并选择最佳参数来识别细胞。包含的原子核将用绿色圈出。然后，保存项目，退出测试模式，然后单击 Analyze Images。

此处显示的是生长 7 天的灌注替代物的 H 和 E 染色切片的代表性图像。这是来自固体替代物的 H 和 E 染色切片的代表性图像，生长 7 天，每两天更换一次培养基。实体代理物中的细胞数量要低得多。

该图显示了生长 7 天后每个区域的平均有核细胞数的比较。灌注的固体替代品。这些数值数据支持 H 和 E 染色切片的照片显微照片中的细胞性。

该图显示了 Ki-67 标记指数的比较，Ki-67 标记指数是灌注和固体替代物生长 7 天后细胞增殖的测量值。这些数据再次支持灌注代孕的更大增长。按照此程序，可以对替代物的组织学切片进行其他方法，例如原位杂交和氨基组织化学，以回答 RNA 和蛋白质表达等问题。

看完这个视频，你应该对如何制备和处理三维体外组织替代物，以及对 H 和 E 染色的组织学切片进行替代分析有一个很好的了解。