扫描浸软组织的电子显微镜可视化的细胞外基质
2016年6月14日
这里显示的是一种可视化脱细胞心脏组织中细胞外基质超微结构的方法。
该方法的总体目标是在没有细胞或其他非基质材料的情况下可视化心脏基质的结构。这种方法可以回答纤维化领域的关键问题，特别是基质含量的差异如何影响基质的组织，以及这些变化如何影响不同的心肌病或其他纤维化疾病。这种技术的主要优点是它提供了可用于增强定量度量的矩阵的定性视图。
Galindo 博士和 Sawyer 博士在发现梗死后猪的常规治疗具有类似于治疗后基质含量变化的基因表达变化后，首先想到了使用这项技术。由于需要精细运动技能，如果刚接触这种方法的人之前没有 SEM 样品制备经验，他们可能会遇到困难。组织样本应足够大以便于观察，并储存在 4 摄氏度的 4% 戊二醛溶液中。
从冷藏中取出组织并用蒸馏水冲洗干净。然后，将组织浸入 10% 氢氧化钠溶液中，该溶液由水中的颗粒新鲜制成。请务必采取适当的预防措施。
在室温下将组织在氢氧化钠溶液中保存 6 至 10 天。当组织颜色变为灰白色或白色时继续。然后，用蒸馏水冲洗纸巾，直到它变得透明。
接下来，戴上手套，将组织在室温下浸入 1% 的单宁酸中 4 小时。单宁酸浴后，用蒸馏水冲洗组织过夜。制备过程中，在戴手套的通风橱中，制备 0.2 摩尔的二甲胂酸钠缓冲液储备液和 2% 的四氧化锇储备液。
使用防溅罩，因为四氧化锇有严重的吸入危险。现在，将二甲胂酸钠缓冲液稀释 0.1 摩尔，并在其中轻轻搅拌组织孵育 5 分钟。更换缓冲液两次，用二甲胂酸钠洗涤组织总共三次。
接下来，将二甲胂酸钠原液和四氧化锇原液进行一对一的混合物。将组织在旋转器上的新混合物中孵育一小时。然后，将组织放回 0.1 摩尔二甲胂酸钠中，并在轻轻搅拌下孵育 5 分钟。
在 15 分钟内更换此浴液两次。然后，使用一系列浓度递增的乙醇浴使组织脱水。让组织在每次浴中浸泡 15 分钟，轻轻搅拌。
接下来，将组织和溶液转移到装有 100% 乙醇的浅培养皿中。接下来，小心地握住两个非常锋利的剃须刀片，使侧面的平面相互接触，并且切割边缘交叉，在试样上方形成等边三角形的两条边。现在，用惯用手将第二个刀片放在样品的最左侧，然后向右切片。
因此，从相反的方向将刀片相互滑动，以最小的变形或撕裂力进行一次平滑的切割。目标是在不损坏试样的情况下暴露出尽可能大的表面积。重复该过程，直到准备好足够令人满意的横截面以供 SEM 检查。
使用抹刀或镊子将组织转移到 CPD 的样品架上，同时保持组织浸入 100% 乙醇中。组织暴露在空气中的时间不能超过几秒钟。使用 CPD 用液态二氧化碳代替乙醇，并按照制造商的指示执行干燥循环。
然后，为每个样品准备一个 SEM 样品存根。将碳粘合剂片粘在铝短管的顶面上。在立体镜下，小心地将标本粘附到粘合片上，感兴趣的横截面表面朝上，远离标签，并与短截表面最大地保持平面。
请勿探测或触摸感兴趣的表面。对于最小、最困难的标本，折断木制涂抹棒用作刮刀。此外，在一大块滤纸上工作，以避免丢失掉落的标本。
为了提高粘附性，使用破损的涂抹棒制作锥形刷，并在试样的底部和侧面涂抹银色或碳漆。将非常细的油漆线向上延伸到目标表面的边缘。这将形成一条从感兴趣表面到地面的充电路径。
然后，在碳片的周边涂上两到三个小的油漆，以提供从碳片表面到金属短截线的导电路径。这起到接地的作用。将样品放在一边，让导电漆干燥 2 小时。
干燥后，作溅射镀膜机在样品上涂上一层相对较重的金钯合金或金涂层。需要 30 至 40 纳米厚的涂层。在相对较低的加速电压下进行扫描电子显微镜检查，以最大限度地减少与样品中电荷耗散不良相关的问题。
如果可用，请使用可变压力模式。首先，提高工作距离以提供足够的景深来聚焦 Z 维度的纤维。为此，请打开右上角的 Navigation 选项卡。
然后，从舞台菜单访问 Coordinates 选项卡。在其中，为 Z 坐标输入一个较大的值，例如 20 毫米。最后，按 Go To 选项卡执行更改。
接下来，将感兴趣的表面与电子束正交。单击并按住鼠标右键，然后向左或向右滑动，将标本聚焦在准备好的感兴趣表面平面的外围附近。注意聚焦工作距离。
然后，使用手动用户界面纵杆，将视图移动到对边并重复聚焦方法。如果工作距离发生变化，则倾斜试样以在两个位置实现近似一致。使用 Stage 菜单的 Coordinates 选项卡，并在 T 坐标中输入倾斜值。
现在，通过在 R 坐标字段中输入该值，将试样旋转 90 度。然后，重复倾斜过程，直到所有位置都集中在大致相同的工作距离上。所述技术应用于未使用的人类心脏移植供体的心脏组织。
人类心脏基质是交联蛋白的复杂编织，横截面呈蜂窝状图案。每个蜂窝结构宽约 40 微米，通常绕过单个肌细胞。当通过插层椎间盘连接时，可以将几个心肌细胞想象成一根纵向穿过隧道状形状的杆。
除了提供结构信息外，脱细胞组织的 SEM 还可以对损伤或非伤害性心肌病（例如猪的心肌组织梗塞）进行有意义的定性评估。在另一项研究中，NRG-1 β 的 GGF2 亚型被证明是心力衰竭的潜在治疗方法。观看此视频后，您应该对扫描电子显微镜处理组织、心脏组织有一个很好的了解，包括暴露感兴趣表面和安装标本的技术。
按照此程序，可以使用其他技术，如质谱、RNA 测序和各种其他分析来测量细胞外基质蛋白和其他负责信号传导和其他组织观察现象的技术。另外，不要忘记四氧化锇是一种危险的化学物质，因为它可能会对粘膜进行蒸汽固定。永远记住在戴着丁腈手套的通风橱中工作，使用防溅罩或罩带。
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概览
本文介绍了一种可视化去细胞心脏组织中细胞外基质超微结构的方法。该技术旨在增强对基质组织及其在各种纤维化病症中的影响的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 心脏组织分析
- 细胞外基质可视化
- 纤维化研究
背景
- 该方法专注于无细胞成分的心脏基质。
- 它解决了与基质内容和组织相关的问题。
- 获得的见解可能有助于理解心肌病。
- 先前的研究表明基因表达的变化与基质内容有关。
研究目的
- 在去细胞环境中可视化心脏基质结构。
- 探索基质组成与纤维化疾病之间的关系。
- 提供质性见解，以补充定量数据。
使用的方法
- 心脏组织的去细胞化
- 用于可视化的扫描电子显微镜（SEM）
- 涉及戊二醛固定的样品准备
- 在受控温度下储存样品
主要结果
- 成功可视化了细胞外基质结构。
- 识别了基质组织的变化。
- 基质内容与纤维化疾病特征的关联。
- 该方法展示了进一步研究应用的潜力。
结论
- 该技术为研究心脏纤维化提供了一个有价值的工具。
- 它增强了对基质相关病理的理解。
- 未来的研究可能基于这些发现探索治疗途径。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding extracellular matrix ultrastructure is critical for de-risking cardiac fibrosis targets in early discovery. This method provides qualitative structural insights that complement quantitative fibrosis assays, enabling mechanistic validation of matrix-targeted hypotheses. It supports predictive confidence in lead identification by revealing how matrix organization influences disease progression and therapeutic response.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct visualization of matrix architecture to interrogate therapeutic hypotheses about fibrosis mechanisms.
- Operational Value: Provides a qualitative benchmark for assessing matrix-targeted compound effects on tissue ultrastructure.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates ultrastructural reference standards for assay validation and compound screening in fibrosis models.
- Operational Value: Supports development of reproducible, matrix-focused readouts for high-content imaging platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates correlation of matrix remodeling with disease phenotypes across preclinical models.
- Operational Value: Enables cross-species comparison of matrix structure to improve translational relevance of fibrosis studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical assessment, providing structural context for matrix-modulating interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing how matrix composition influences organization in fibrotic versus healthy tissue.
- Screening: Delivers qualitative outputs that help triage compounds based on their impact on matrix architecture.
- Analytics: Yields structural metrics (e.g., fiber spacing, pore size) that inform quantitative structure-function relationships.
- Translational Research: Enables preclinical continuity by allowing direct comparison of matrix ultrastructure across species and disease states.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for matrix characterization across multiple fibrosis indications and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in fibrosis research by providing direct visualization of extracellular matrix organization.
- Operational Value: Standardizes matrix evaluation through reproducible decellularization and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking compound effects to observable changes in matrix ultrastructure.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of matrix-targeted therapeutics based on structural validation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, electron microscopy, and hazardous chemical handling (e.g., osmium tetroxide, sodium hydroxide).
- Dependent on access to SEM, critical point dryer, sputter coater, and fume hood infrastructure.
- Necessitates standardized SOPs for tissue decellularization, staining, and mounting to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations for different tissue types (e.g., cardiac, hepatic, pulmonary) due to varying matrix density and cross-linking.
- Limited by the destructive nature of the process, precluding longitudinal analysis of the same sample.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:15
Decellularization of Heart Tissue Specimen
2:20
Osmication, Dehydration and Cross-sectioning for SEM
4:32
Critical Point Drying (CPD) and Mounting for SEM
6:33
SEM Examination of Heart Tissue Specimens
8:18
Results: Structural and Quantitative Analyses
9:22
Conclusion
