Name: 扫描浸软组织的电子显微镜可视化的细胞外基质 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 学习使用扫描电子显微镜可视化脱细胞心脏组织的细胞外基质结构。该方法通过戊二醛固定和SEM成像技术，帮助研究人员定性分析基质组织及其在纤维化疾病中的变化。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）、心肺血液研究所（NIHLB）资助：K01-HL-121045、K08-HL-094703、5T32HL007411-35、P20 HL101425、U01 HL100398。
成像和组织处理（经氢氧化钠消化后）由范德比尔特大学医学中心（VUMC）细胞成像共享资源中心（CISR）完成（该中心由美国国立卫生研究院资助项目 CA68485、DK20593、DK58404、DK59637 和 EY08126 支持）。我们特别感谢范德比尔特大学医学中心细胞成像共享资源中心的核心负责人 Sam Wells 博士和 W. Gray (Jay) Jerome 博士，他们提供了宝贵的技术建议，并为拍摄本文所强调的技术方法提供了核心实验空间和资源。
我们谨向范德堡大学转化与临床研究心脏病学核心实验室的Yan Ru Su博士和Kelsey Tomasek女士致以最诚挚的谢意，感谢她们为本研究提供了专业技术支持并收集了所使用的人体组织样本。

伦理声明： 动物操作方案已获得范德堡大学机构动物护理和使用委员会（IACUC，方案编号 M/10/117（猪）和 M/10/219（小鼠））批准，并依照国际实验动物评估和认证委员会（AAALAC-International）标准进行。使用储存的人类心脏组织已获得范德堡大学医学中心机构审查委员会（IRB）批准（方案编号 100887）。
1. 样本采集与保存
<ol>
	<li>配制新鲜的4%戊二醛磷酸盐缓冲液（0.1 M PB）溶液。 
	注意：戊二醛具有毒性，操作时需佩戴手套并在通风橱中进行。
	<ol>
		<li>使用21.8 g Na2HPO4 和6.4 g NaH2PO4 配制pH 7.4的0.2 M PB储备液，用去离子水（dH2O）定容至1,000 ml。Quantum satis（Q.s.）。</li>
		<li>将400 µl 50%戊二醛加入2.5 ml PB储备液和2.1 ml dH2O中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将一块组织（面积不超过2 cm2）浸入4%戊二醛溶液中。注意：也可使用更小的组织块，但应保证足够大小（不小于5 mm2），以便肉眼清晰观察，利于后续实验步骤的操作。</li>
	<li>室温孵育1小时，之后可在4 °C长期保存。</li>
</ol>
2. 心脏组织的脱细胞
<ol>
	<li>使用 10 g NaOH 颗粒溶于 100 ml dH2O 配制新鲜的 10% 水溶液。 
	注意：NaOH 溶液具有腐蚀性，可导致碱性灼伤，请佩戴手套操作。</li>
	<li>用 dH2O 冲洗组织。</li>
	<li>将组织在 10% NaOH 溶液中室温孵育 6 至 10 天（直至组织颜色由红褐色变为灰白色或白色）。</li>
	<li>用 dH2O 冲洗至组织变得透明。</li>
	<li>将组织在 1% 单宁酸溶液中室温浸泡 4 小时。每 4 ml dH2O 中加入 1 ml 5% 储存液。 
	注意：单宁酸为强刺激物，请佩戴手套操作。</li>
	<li>用 dH2O 冲洗过夜。</li>
</ol>
3. 心脏组织的四氧化锇固定及脱水（为安全起见，在通风橱中操作）
<ol>
	<li>使用21.4 g二甲胂酸钠、10.0 g氯化钙和450 ml去离子水配制0.2 M二甲胂酸钠缓冲液储备液2O. 混匀，然后根据需要加入盐酸，调节pH至7.4。 Q.s. 加 dH₂O 定容至 500 ml2O. 
	警告：二甲胂酸钠和盐酸具有毒性，操作时需佩戴手套并在通风橱中进行。</li>
	<li>在通风橱中，将1 g四氧化锇晶体溶于50 ml dH₂O，配制2%的四氧化锇水溶液母液以确保安全2O. 
	警告：四氧化锇具有严重的吸入危险性；可能对黏膜或眼球造成蒸气固定损伤，因此仅可在通风橱内佩戴手套操作。建议使用防溅护罩。</li>
	<li>用0.1 M二甲胂酸钠缓冲液（将贮存液与去离子水按1:1混合）冲洗组织2在旋转仪（或轻柔振荡）上孵育5分钟。</li>
	<li>重复上一步骤两次，共计三次缓冲液洗涤。</li>
	<li>将组织置于含1%四氧化锇的0.1 M二甲胂酸钠缓冲液中（按1:1比例混合储存液二甲胂酸钠与储存液四氧化锇），在旋转仪上室温孵育1小时。</li>
	<li>在旋转器上用 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液冲洗组织，每次 5 分钟，共冲洗 3 次。</li>
	<li>使用旋转器，依次用浓度递增的乙醇（30%、50%、75%、85%、95%，最后100%）冲洗组织，每步15分钟。</li>
</ol>
4. 扫描电镜用横截面样品制备
<ol>
	<li>将组织转移至含有100%乙醇的浅底培养皿中，培养皿内也需盛有100%乙醇。</li>
	<li>用双手各持一片非常锋利的刀片，使两片刀片的侧面平面对齐接触，刀刃交叉形成位于样本上方的等边三角形的两条边。具体操作为：左手持一片刀片置于样本最右侧，向左切割；同时右手持另一片刀片置于样本最左侧，向右切割。两片刀片从相反方向相对滑动，从而完成一次平滑的切割。</li>
	<li>使两片刀片的平面侧边相互滑动，以实现对样本的极为整齐的切割，尽量减少形变或撕裂力，最好在不损伤样本的前提下暴露出尽可能大的表面区域。</li>
	<li>对每个样本重复上述操作，以获得尽可能洁净的横截面，用于扫描电镜（SEM）观察。</li>
</ol>
5. 心脏组织的临界点干燥（CPD）
<ol>
	<li>使用刮刀或镊子将组织转移至临界点干燥仪（CPD）的样品台，确保组织始终处于100%乙醇中。确保样品台浸没在乙醇中，并在转移过程中使组织暴露于空气的时间不超过数秒。</li>
	<li>按照用户手册操作CPD，完成3次 purge-and-fill 循环，以液态二氧化碳置换乙醇。</li>
	<li>按照用户手册操作CPD，实现样品的临界点干燥，并通过受控释放CO2使样品恢复至大气压。</li>
</ol>
6. 心脏组织样本的扫描电镜制样
<ol>
	<li>为每个样品准备一个SEM样品台，将碳导电胶带粘附在铝制样品台的顶面。</li>
	<li>在体视显微镜辅助下，小心地将样品粘附在导电胶带上，使待观察的横截面朝上（远离胶带，保持可见），并尽可能与样品台表面平行。切勿触碰或探压待观察表面。</li>
	<li>折断一根木制涂药棒，形成锥形刷头，适用于涂抹导电涂料。在样品的底部和侧面涂抹银或碳导电涂料，以增强样品与样品台之间的粘附性。</li>
	<li>从样品底部沿侧面向待观察表面的边缘延伸一条极细的银或碳导电涂料线，以提供从待观察表面到接地的导电通路。</li>
	<li>在碳胶带周围的边缘处涂抹2至3小点银或碳导电涂料，以形成从碳胶带表面到金属样品台进而接地的导电路径。</li>
	<li>让导电涂料干燥两小时。</li>
	<li>按照用户手册操作溅射镀膜仪，对样品进行较厚的金-钯合金或金镀层（目标厚度范围为30–40 nm）。将样品室抽真空至约0.1 mbar；设定定时器为40秒；将气体调节阀打开至8:00位置（中等氩气流量）。按下“开始”按钮，以30 mA电流启动溅射镀膜。此时应在样品室内观察到紫色辉光放电。</li>
</ol>
7. 心脏组织样本的扫描电镜检查
<ol>
	<li>采用相对较低的加速电压进行扫描电子显微镜观察，以尽量减少因样品电荷耗散不良（充电效应）引起的成像问题。建议的初始成像条件为：5 kV 加速电压，10 mm 工作距离。</li>
	<li>在有经验的操作人员协助下，通过增加工作距离，以扩展在需要对多个焦平面中的纤维或在 z 轴方向延伸较长的纤维进行聚焦时的景深。
	<ol>
		<li>对于本实验所用的显微镜（参见 材料表），在用户界面中点击右上方的“Navigation”（导航）选项卡。</li>
		<li>从“Stage”（载物台）菜单中进入“Coordinates”（坐标）选项卡。为增加工作距离，请在 Z 坐标中输入更大的毫米数值，然后点击“Go To”（前往）选项卡，使样品台移动至设定的工作距离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在有经验的操作人员协助下，通过倾斜和旋转样品，使待观察表面与电子束方向垂直。在此基础上额外倾斜 10 至 30 度，可能有助于更好地观察和记录基质结构。
	<ol>
		<li>对于本实验所用的显微镜（参见 材料表），在用户界面中按住鼠标右键，然后向左或向右滑动，对感兴趣制备表面边缘附近的样品区域进行聚焦，并记录此时的聚焦工作距离。</li>
		<li>使用手动用户界面操纵杆移动至表面相对的另一边缘，重复聚焦操作。如果此时的工作距离与第一个位置不近似相等，则通过“Stage”（载物台）菜单中的“Coordinates”（坐标）选项卡（参见 7.2）调整样品倾斜角度，在 T 坐标中输入倾斜值，使两个位置的工作距离大致一致。</li>
		<li>将样品旋转九十度（在 R 坐标字段中输入数值），并重复上述过程，直至所有位置均能在近似相同的工作距离下实现聚焦。 
		注意：如有条件，可采用可变压力扫描电镜（variable pressure SEM）以改善电荷耗散。高真空是扫描电子显微镜的标准工作模式。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突披露。

横截面表面制备是本实验方案中最关键的步骤。为了保持精细结构，脱水后的样品必须始终保存在100%乙醇中，直至进入临界点干燥步骤。因此，为获得用于电子显微镜观察的表面，样品切片操作必须在浅皿中的乙醇浸没条件下进行。此外，在后续操作中，必须避免触碰或探压暴露的表面。该技术应用于其他组织类型以进行类似的基质观察时，预计无需进行重大修改，尽管无论样品来源如何，实验方案中的扫描电镜部分都可能需要进行基本的电子显微镜故障排查。从纤维性样品获取的图像容易因电荷散逸不良而引入伪影（&#34;荷电&#34;）。通常可通过降低加速电压、提高扫描速度（也称为停留时间）以及减小电子束斑尺寸来最小化荷电问题。将多次快速扫描图像进行叠加，可在避免电荷伪影的同时，获得与较慢、高分辨率的单次扫描图像相当的信噪比图像质量。
该技术本质上是定性的，因此在结合定量测量（例如，Masson 三色染色或苦味酸-天狼星红染色、羟脯氨酸含量测定、质谱分析和 RNA 测序）时具有互补价值，可用于判断所观察到的结构差异可能如何与不同的发育阶段或疾病状态相关联。然而，尽管存在这一局限性，该方法的意义远不止于心脏纤维化...

纤维化会破坏心肌正常的胶原网络，而该网络对于心肌细胞的正常力学功能1,2以及细胞间通讯、细胞内信号传导和细胞存活至关重要3。纤维化的形成是决定心脏功能的重要因素，由多种病因引起的心肌间质纤维化重构会导致左心室僵硬度增加和舒张功能障碍4。心肌纤维化还可能引发心律失常，无论纤维化重构是全身性还是局部性的进展，均与缺血性和非缺血性心肌病患者的不良预后密切相关5。同样，心肌纤维化的缺失是心室功能恢复和长期生存的强有力预测指标6。
纤维化的特征是过量胶原蛋白的沉积，其抗张强度与钢相当7，可在多个层面不利地影响心肌细胞功能。由过度胶原化基质产生的机械力可导致心肌细胞萎缩8,9、组织被动僵硬度增加10、张力性收缩引起的心肌僵硬11-13，以及向残存心肌细胞输送氧气的能力下降。心肌细胞与肌成纤维细胞之间的缝隙连接耦合也可能损害心脏的电学特性，增加心律失常发生的风险14-16。血管周围纤维化会改变心壁内冠状动脉和小动脉的血管运动反应性17，并导致管腔狭窄，从而减少氧气供应，影响心肌细胞的存活17-22。病理性纤维化及电学重构从最初的缺血性损伤或能量失衡部位开始，最终不可避免地进展为心力衰竭。
心肌细胞坏死会启动纤维化反应，随后可能产生不良的纤维化重塑，且该过程与病因无关。找到控制心肌纤维化的方法，将对缺血性及特发性心肌病、高血压性心脏病、肥厚型心肌病、瓣膜性心脏病以及肌营养不良蛋白病的临床治疗具有重要意义23-42。无论纤维化疾病过程如何起始，可溶性促纤维化因子均可穿过间质空间，激活远离初始纤维化瘢痕部位的间质和外膜成纤维细胞，从而引发级联效应，最终导致心力衰竭。理想的情况是，在心肌病进展至收缩期泵功能衰竭、舒张性心力衰竭或其他终末期结局之前，利用靶向治疗手段干预心肌肥厚的代偿阶段，从而调控纤维化过程。最终目标是逆转纤维化，使死亡的心肌细胞得以替换，并完全恢复心脏功能。
基质的重要性已被广泛认识，但研究基质的方法主要局限于对主要结构成分（尤其是胶原蛋白）进行定量测定，以及对不同基质蛋白和基质细胞蛋白的相对水平进行分析。本实验方案重点介绍一种很少使用但可用于评估心脏基质中定性差异的技术。该技术最近被用于比较和对比不同病因的心脏疾病（在人类移植心脏样本中）所导致的心脏基质基本差异，分析经神经调节蛋白-1β的胶质生长因子（GGF）亚型处理的梗死后猪心脏与未处理动物之间的差异43，以及探究不同年龄的mdx小鼠（杜氏肌营养不良症常用的动物模型）心脏组织基质与野生型对照组之间的差异。该技术最早由Caulfield和Borg博士于1979年提出44，但此后极少有研究采用这一强大技术45-47，本文在此重新引入，仅做了轻微修改。该方法是一种有价值的研究工具，因为它能够提供有关细胞外基质超微结构的定性信息，而这些信息在仅测量基质成分含量或纤维化程度时可能被忽略。

<table><tbody><tr><td>氯化钙</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12340</td><td>100 g</td></tr><tr><td>碳导电胶</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12664</td><td>30 g</td></tr><tr><td>碳导电胶片</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>77825</td><td>按样品台尺寸订购</td></tr><tr><td>双刃不锈钢剃须刀片</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td>250/包</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15055</td><td>450 ml</td></tr><tr><td>戊二醛，50% 溶液</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16310</td><td>电镜级，蒸馏提纯</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16760 或 16770</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>磷酸二氢钠 NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9251-250G</td><td>250 g</td></tr><tr><td>四氧化锇</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19100</td><td>1 g</td></tr><tr><td>银导电胶</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12686-15</td><td>15 g</td></tr><tr><td>氢氧化钠 (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-1KG</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠 (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264-500G</td><td>500 g</td></tr><tr><td>单宁酸，5% 水溶液&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>21702-5</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>三水合二甲胂酸钠</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12300</td><td>100 g</td></tr><tr><td>金-钯合金或金靶材</td><td>Refining Systems, Inc.&amp;nbsp;</td><td>视情况而定</td><td>根据溅射镀膜仪的具体型号确定</td></tr><tr><td>临界点干燥仪</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>850</td><td></td></tr><tr><td>普通木质涂药棒</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-102</td><td></td></tr><tr><td>Quanta 250 环境扫描电镜</td><td>FEI</td><td>Q250 SEM</td><td></td></tr><tr><td>溅射镀膜仪</td><td>Cressington Scientific Instruments Ltd.</td><td>Model 108</td><td></td></tr><tr><td>铝制 SEM 样品台</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>75220-12</td><td>与显微镜型号匹配</td></tr></tbody></table>

利用扫描电子显微镜观察离解组织以可视化细胞外基质

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

无论病因如何，纤维化是所有类型心脏病的共同特征。尽管心脏基质生物学领域已取得诸多进展，但在基质形成机制、生理性与病理性重塑之间的差异，以及更为重要的——如何调控基质动态以促进组织修复并抑制纤维化等方面，仍存在重大知识空白。目前尚无任何治疗手段能够控制、预防或逆转心肌纤维化。部分原因可能在于心脏瘢痕形成过程本身的极端复杂性，例如心肌梗死后立即发生以替代死亡或濒死心肌细胞的过程。细胞外基质本身通过激活组织驻留细胞，并协助引导浸润性细胞迁移至功能丧失的病灶区域，从而参与重塑过程。基质还类似于一种储存库，可储存对正常基质 turnover 及纤维化信号传导至关重要的基质细胞蛋白。此外，已有研究证实基质在心肌组织中具有电机械功能。目前大多数评估纤维化的方法并非定性性质，而是提供可用于比较两组之间的定量结果，却无法反映基质底层结构的相关信息。本文重点介绍一种用于可视化心脏基质超微结构的技术。对去细胞化心脏组织进行扫描电子显微镜观察，可揭示出传统定量研究方法难以发现的显著结构差异。

该高亮技术已应用于未使用的人类心脏移植供体的心脏组织（图1）、心脏移植受体的切除组织、野生型和营养不良型小鼠的心脏组织（图3），以及猪心肌损伤模型中心肌梗死后的心脏样本（图2）。如图1所示，人类心肌基质是由交联蛋白构成的复杂网状结构，在横切面观察时呈现出蜂窝状结构。在图1的平面视图中，每个“蜂窝”结构的宽度约为40 µm，通常环绕单个心肌细胞。当通过闰盘连接时，多个心肌细胞可被视为沿“隧道”纵向延伸的一根杆状结构，若将此比喻扩展至三维空间则更为直观。图1还强调了切割操作的重要性：切割过程中精度更高可获得更具揭示性的拓扑结构数据（图1，左上），而切割过程中被“压碎”的切片则效果较差（图1，右上）。
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-pag...

此处展示了一种用于可视化脱细胞心脏组织中细胞外基质超微结构的方法。

纤维化是所有类型心脏病（无论病因如何）的共同特征，尽管在心脏基质研究领域已取得诸多进展……

该方法的总体目标是在去除细胞或其他非基质成分后，对心脏基质结构进行可视化观察。该方法可解答纤维化研究领域中的关键问题，特别是基质成分的差异如何影响基质的组织结构，以及这些变化可能如何影响不同类型的心肌病或其他纤维化疾病。该技术的主要优势在于，它能够提供对基质的定性观察，从而补充定量分析结果。Galindo博士和Sawyer博士最初在发现常规治疗后梗死后猪的心脏组织基因表达变化与治疗后基质成分变化相似时，产生了使用该技术的想法。对于没有扫描电镜样品制备经验的研究人员而言，由于该方法需要精细的动手操作能力，可能会在初次尝试时遇到困难。组织样本应足够大以便于观察，并在4%戊二醛溶液中于4°C条件下保存。将组织从冷藏环境中取出，并用蒸馏水冲洗。随后，将组织浸入新配制的10%氢氧化钠溶液（由氢氧化钠颗粒溶于水制得）中。操作时务必采取适当的防护措施。将组织在室温下置于氢氧化钠溶液中保存6至10天，待组织颜色变为乳白色或白色时继续后续操作。随后用蒸馏水冲洗组织，直至其变得透明。接下来，戴上手套，将组织置于1%单宁酸中，在室温下浸泡4小时。经过单宁酸处理后，用蒸馏水冲洗组织过夜。在准备过程中，于通风橱内戴手套操作，配制0.2摩尔的钠-卡可基缓冲液储备液和2%的四氧化锇水溶液储备液。使用防溅罩，因为四氧化锇具有严重的吸入性危害。现在，配制 0.1 摩尔的二甲胂酸钠缓冲液稀释液，并将组织在其中孵育 5 分钟，同时轻轻振荡。更换缓冲液两次，共用二甲胂酸钠缓冲液洗涤组织三次。接下来，将储备的二甲胂酸钠溶液与储备的四氧化锇溶液等体积混合。将组织置于该新配制的混合液中，在旋转摇床上孵育1小时。随后，将组织重新放入0.1摩尔的二甲胂酸钠溶液中，在温和振荡条件下孵育5分钟。在15分钟内更换此浸泡液两次。随后，使用浓度递增的系列乙醇溶液对组织进行脱水。每次更换溶液后，在温和振荡条件下让组织浸泡15分钟。接下来，将组织和溶液转移至一个盛有100%乙醇的浅培养皿中。然后，小心地用双手持两把非常锋利的剃须刀片，使刀片侧面的平面相互接触，且切割刃交叉，在样本上方形成一个等边三角形的两条边。现在，用你的优势手将第二把刀片放在样本的最左侧，向右切割。因此，从相反方向滑动刀片，使其相互配合，完成一次光滑的切割，以尽量减少形变或撕裂力。目标是在不损伤样品的前提下，暴露出尽可能大的表面区域。重复该过程，直至制备出足够数量且符合要求的横切面，用于扫描电镜（SEM）观察。使用刮勺或镊子将组织转移至临界点干燥仪（CPD）的样品台中，同时保持组织浸没在100%乙醇中。组织暴露于空气中的时间不得超过数秒。使用CPD将乙醇置换为液态二氧化碳，并按照制造商说明进行干燥程序。然后，为每个样品制备扫描电镜（SEM）样品台。将碳导电胶带粘附在铝制样品台的上表面。在体视显微镜下，小心地将样品粘附在胶带上，使待观察的横截面朝上，背离

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Research

科研

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Biology

生物学

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