利用扫描电子显微镜观察离解组织以可视化细胞外基质

该方法的总体目标是在去除细胞及其他非基质成分后，对心脏基质的结构进行可视化观察。该方法可回答纤维化研究领域中的关键问题，特别是基质成分的差异如何影响基质的组织结构，以及这些变化可能如何影响不同类型的心肌病或其他纤维化疾病。该技术的主要优势在于，它能够提供对基质的定性观察结果，从而补充定量分析手段。

Galindo 博士和 Sawyer 博士最初在发现常规治疗后梗死后猪的心脏组织基因表达变化与基质成分变化相似时，便萌生了使用该技术的想法。对于刚接触该方法的研究人员，若缺乏扫描电镜样品制备的前期经验，可能会因所需精细操作技能而遇到困难。组织样本应足够大以便于观察，并保存在4%戊二醛溶液中，于4°C条件下储存。

将组织从低温保存环境中取出，并用蒸馏水冲洗。随后，将组织浸入新配制的10%氢氧化钠溶液（由氢氧化钠颗粒溶于水制得）中。操作时务必采取适当的防护措施。

将组织在室温下置于氢氧化钠溶液中放置 6 至 10 天。当组织颜色变为乳白色或白色时，继续下一步操作。随后用蒸馏水冲洗组织，直至其变为透明。

接下来，戴上手套，将组织在室温下浸入1%单宁酸中4小时。经过单宁酸处理后，用蒸馏水冲洗组织过夜。在准备过程中，在通风橱内戴手套操作，配制0.2摩尔的 cacodylate 钠缓冲液储备液和2%的四氧化锇水溶液储备液。

使用防溅罩，因为四氧化锇具有严重的吸入性危害。现在，配制 0.1 摩尔的二甲胂酸钠缓冲液稀释液，并将组织在其中孵育 5 分钟，同时轻轻振荡。更换缓冲液两次，共用二甲胂酸钠缓冲液洗涤组织三次。

接下来，将储备的二甲胂酸钠溶液与储备的四氧化锇溶液等体积混合。将组织置于该新配制的混合液中，在旋转摇床上孵育1小时。随后，将组织重新放入0.1摩尔的二甲胂酸钠溶液中，在温和振荡条件下孵育5分钟。

在15分钟内更换该浸泡液两次。随后，使用浓度递增的系列乙醇溶液对组织进行脱水。每次更换溶液后，在轻柔振荡条件下使组织浸泡15分钟。

接下来，将组织和溶液转移至一个盛有100%乙醇的浅培养皿中。然后，小心地用双手持两把非常锋利的剃须刀片，使刀片侧面的平面相互接触，且切割刃交叉，在样本上方形成一个等边三角形的两条边。现在，用你的优势手将第二把刀片置于样本的最左侧，向右切割。

因此，从相反方向相对滑动刀片，以实现一次平滑切割，最大限度减少形变或撕裂力。目标是在不损伤样本的前提下，暴露尽可能大的表面面积。重复此过程，直至制备出足够数量的满意横截面用于扫描电镜（SEM）观察。

使用刮勺或镊子将组织转移至临界点干燥仪（CPD）的样品台中，同时保持组织浸没在100%乙醇中。组织暴露于空气中的时间不得超过数秒。使用CPD将乙醇置换为液态二氧化碳，并按照制造商说明进行干燥程序。

然后，为每个样品制备扫描电镜（SEM）样品台。将碳导电胶带粘附在铝制样品台的顶面。在体视显微镜下，小心地将样品粘附在胶带上，使感兴趣的横截面朝上，背离胶带表面，并尽可能与样品台表面保持共面。

请勿探查或触碰目标表面。对于最小且最难处理的样本，可折断木制涂药棒用作刮勺。同时，应在一张较大的滤纸上操作，以防样本掉落丢失。

为提高附着性，可使用折断的涂布棒制作成锥形刷，并将银或碳导电漆涂于样品的底部和侧面。将漆以极细的线条延伸至待测表面的边缘，从而形成从待测表面到接地端的导电通路。

然后，在碳标签的边缘周围涂抹两到三个小点的导电漆，以提供从标签表面到金属载片的导电通路。此通路作为接地使用。将样品放置一旁，让导电漆干燥两个小时。

干燥后，使用溅射镀膜仪在样品表面镀上较厚的金钯合金或金膜，期望镀层厚度为30至40纳米。进行扫描电子显微镜观察时，应采用相对较低的加速电压，以尽量减少样品电荷散逸不良所引起的问题。

如果具备可变压力模式，请使用该模式。首先，增大工作距离，以提供足够的景深，从而在 Z 轴方向上对焦纤维。为此，请打开右上角的“导航”选项卡。

然后，从载物台菜单中进入“坐标”选项卡。在其中输入更大的 Z 坐标值，例如 20 毫米。最后，按下“前往”选项卡以执行该更改。

接下来，将感兴趣表面与电子束垂直对齐。按住鼠标右键，然后向左或向右滑动，以聚焦于感兴趣表面平面边缘附近的样品。记录下聚焦时的工作距离。

然后，使用手动用户界面操纵杆将视野移动到相对的边缘，并重复对焦方法。如果工作距离发生变化，请倾斜样品，使两个位置的成像大致一致。使用载物台菜单中的“坐标”选项卡，在 T 坐标中输入倾斜值。

现在，通过在 R 坐标字段中输入该数值，将样本旋转 90 度。然后重复倾斜过程，直到所有位置均大致聚焦于相同的工作距离。上述技术已应用于一名未使用的人类心脏移植供体的 cardiac 组织。

人类心脏基质是由交联蛋白构成的复杂网状结构，其横截面呈蜂窝状。每个蜂窝状结构的宽度约为40微米，通常环绕单个心肌细胞。当通过闰盘连接时，多个心肌细胞可被视为沿隧道状结构纵向延伸的杆状结构。

除了提供结构信息外，脱细胞组织的扫描电镜（SEM）还可用于对损伤性或非损伤性心肌病（如猪的梗死心肌组织）进行有意义的定性评估。在另一项研究中，NRG-1β的GGF2亚型被证明是治疗心力衰竭的一种潜在疗法。观看本视频后，您应能充分掌握如何处理组织（尤其是心肌组织）以用于扫描电子显微镜观察，包括暴露目标表面以及样本安装的技术。

完成此操作步骤后，可采用质谱、RNA测序及各种其他检测方法，以测定细胞外基质蛋白及其他与信号传导和组织学观察现象相关的分子。此外，请务必注意，四氧化锇是一种危险化学品，因其蒸气可能固定黏膜组织。操作时务必在通风橱中进行，佩戴腈类手套，并使用防溅护罩或通风橱窗。