Name: 体外测定菌落为表征的三效祖细胞从成人胰腺小鼠隔离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 学习使用甲基纤维素半固体培养基体外培养小鼠胰腺祖细胞集落的方法，以评估其自我更新与分化潜能。该技术有助于深入理解胰腺细胞生物学特性及再生医学应用前景。

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感谢希望之城分析流式细胞术核心实验室的Lucy Brown和Alexander Spalla在细胞分选方面的协助。本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为R01DK081587和R01DK099734（授予H.T.K.），U01DK089533（授予A.D.R.），以及美国国家科学基金会NSF-DMR-1206121和加州再生医学研究所RB5-07398（授予D.A.T.）。同时感谢加州理工学院Joseph J. Jacobs分子医学工程研究所对D.A.T.的支持，以及Oxnard基金会和Ella Fitzgerald基金会对H.T.K.的支持。
资助信息：本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）向 H.T.K. 提供的 R01DK081587 和 R01DK099734 基金、向 A.D.R. 提供的 U01DK089533 基金，以及美国国家科学基金会（NSF-DMR-1206121）和加州再生医学研究所（RB5-07398）向 D.A.T. 提供的资助支持。同时感谢加州理工学院 Joseph J. Jacobs 分子医学工程研究所向 D.A.T. 提供的支持，以及 Oxnard 基金会和 Ella Fitzgerald 基金会向 H.T.K. 提供的支持。本出版物所报告的研究包括在分析流式细胞术核心设施和光显微镜数字成像核心设施中完成的工作，这些设施由美国国立卫生研究院国家癌症研究所通过资助号 P30CA33572 提供支持。
研究资助方： 资助方未参与本研究的设计、数据收集、分析或解释。

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<li>Kopp, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox9%2B+ductal+cells+are+multipotent+progenitors+throughout+development+but+do+not+produce+new+endocrine+cells+in+the+normal+or+injured+adult+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas.</a> Development. 138, 653-665 (2011).</li>
<li>DiGiusto, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-based+gene+therapy+for+HIV+with+lentiviral+vector-modified+CD34%28%2B%29+cells+in+patients+undergoing+transplantation+for+AIDS-related+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma.</a> Science translational medicine. 2, 36-43 (2010).</li>
<li>Inada, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbonic+anhydrase+II-positive+pancreatic+cells+are+progenitors+for+both+endocrine+and+exocrine+pancreas+after+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Carbonic anhydrase II-positive pancreatic cells are progenitors for both endocrine and exocrine pancreas after birth.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 19915-19919 (2008).</li>
<li>Solar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+exocrine+duct+cells+give+rise+to+insulin-producing+beta+cells+during+embryogenesis+but+not+after+birth%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth.</a> Dev Cell. 17, 849-860 (2009).</li>
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<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colony-forming+cells+in+the+adult+mouse+pancreas+are+expandable+in+Matrigel+and+form+endocrine%2Facinar+colonies+in+laminin+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).</li>
<li>Fu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-26a+targets+ten+eleven+translocation+enzymes+and+is+regulated+during+pancreatic+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-26a targets ten eleven translocation enzymes and is regulated during pancreatic cell differentiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 17892-17897 (2013).</li>
<li>Ghazalli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+Pancreas+of+Mice+Contains+Tripotent+Progenitors+Capable+of+Giving+Rise+to+Duct%2C+Acinar%2C+and+Endocrine+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Postnatal Pancreas of Mice Contains Tripotent Progenitors Capable of Giving Rise to Duct, Acinar, and Endocrine Cells In Vitro.</a> Stem Cells Dev. , (2015).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colony-forming+progenitor+cells+in+the+postnatal+mouse+liver+and+pancreas+give+rise+to+morphologically+distinct+insulin-expressing+colonies+in+3D+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Diabet+Stud%22%5BJournal%5D)">Colony-forming progenitor cells in the postnatal mouse liver and pancreas give rise to morphologically distinct insulin-expressing colonies in 3D cultures.</a> Rev Diabet Stud. 11, 35-50 (2014).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Multilineage+Differentiation+and+Self-Renewal+of+Single+Pancreatic+Colony-Forming+Cells+from+Adult+C57Bl%2F6+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">In Vitro Multilineage Differentiation and Self-Renewal of Single Pancreatic Colony-Forming Cells from Adult C57Bl/6 Mice.</a> Stem Cells Dev. , (2014).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> Embo J. 32, 2708-2721 (2013).</li>
<li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+three-dimensional+niches+deconstruct+pancreas+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro.</a> Development. 140, 4452-4462 (2013).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+and+conversion+of+human+pancreatic+ductal+cells+into+insulin-secreting+endocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Expansion and conversion of human pancreatic ductal cells into insulin-secreting endocrine cells.</a> Elife. 2, e00940(2013).</li>
<li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organoid-initiating+cells+in+mouse+pancreas+and+liver+are+phenotypically+and+functionally+similar%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The organoid-initiating cells in mouse pancreas and liver are phenotypically and functionally similar.</a> Stem Cell Res. 13, 275-283 (2014).</li>
<li>Ku, H., Yonemura, Y., Kaushansky, K., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombopoietin%2C+the+ligand+for+the+Mpl+receptor%2C+synergizes+with+steel+factor+and+other+early+acting+cytokines+in+supporting+proliferation+of+primitive+hematopoietic+progenitors+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Thrombopoietin, the ligand for the Mpl receptor, synergizes with steel factor and other early acting cytokines in supporting proliferation of primitive hematopoietic progenitors of mice.</a> Blood. 87, 4544-4551 (1996).</li>
<li>Ku, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-expressing+colonies+developed+from+murine+embryonic+stem+cell-derived+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors.</a> Diabetes. 56, 921-929 (2007).</li>
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<li>Suzuki, A., Nakauchi, H., Taniguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+multipotent+pancreatic+progenitors+using+flow-cytometric+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting.</a> Diabetes. 53, 2143-2152 (2004).</li>
<li>Seaberg, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+identification+of+multipotent+precursors+from+adult+mouse+pancreas+that+generate+neural+and+pancreatic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages.</a> Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

此处所述的胰腺集落实验及单个集落分析，借鉴了过去几十年中在解析造血祖细胞生物学方面发挥重要作用的含甲基纤维素的造血集落实验。 23。在这些实验中（图5将解离的胰腺细胞接种至含有甲基纤维素的半固体培养基中，该培养基包含支持形成环状、致密状或内分泌/腺泡样克隆的适当生长因子和细胞外基质蛋白 7一种能够产生细胞克隆的单个前体细胞被称为PCFU。通过微流控qRT-PCR和整体免疫染色对单个克隆进行表征，可推断出起源PCFU的谱系潜能。研究发现，大多数成年小鼠PCFU具有三向分化潜能，能够分化为导管细胞、腺泡细胞和内分泌谱系细胞 体外 7,9虽然小鼠细胞外基质蛋白可促进三向潜能集落形成单位向导管系分化，但层粘连蛋白水凝胶能够支持高效的内分泌和腺泡细胞系分化 7,9. 为了评估 体外 PCFUs 的自我更新能力可通过将初次小鼠 ECM 集落形成实验中生长的环状或致密集落消化为单细胞悬液，并重新接种至二次小鼠 ECM 集落形成实验中进行验证 7研究发现，在小鼠ECM蛋白中，...

胰腺由三种主要细胞谱系组成：腺泡细胞分泌消化酶，导管细胞分泌黏蛋白以抵御病原体并将消化酶转运至肠道，内分泌细胞则分泌包括胰岛素和胰高血糖素在内的激素，以维持葡萄糖稳态。在胰腺的胚胎发育过程中，早期导管细胞是三向潜能祖细胞的来源，这些祖细胞能够分化为成年动物胰腺中的三种细胞谱系1,2。由于成体干细胞和祖细胞（如骨髓干细胞）已成功用于治疗多种疾病3，因此寻找存在于成体胰腺中的干细胞和祖细胞引起了广泛关注。如果能够实现对成体胰腺干细胞和祖细胞的分离与操控，这些细胞将有望用于治疗1型糖尿病等疾病，该病中胰岛素分泌细胞因自身免疫反应而被破坏。
在胚胎发育完成后，三潜能祖细胞是否仍存在于成年胰腺导管中，这一问题在科学界存在激烈争论。在此争议中，Inada 及其同事利用 体内 cre-lox 谱系示踪技术表明，用碳酸酐酶 II 作为标记的成年小鼠导管细胞能够产生全部三种胰腺谱系细胞4。然而，使用其他导管细胞标记物（如 HNF1b5 和 Sox92）的研究则得出结论：导管细胞并非成年小鼠中 β 细胞的主要来源。
几年前，我们提出，上述争议的原因可能是由于该领域缺乏 6,7，以及可用于测量自我更新和多向分化能力的适当分析工具——这两项是定义干细胞所必需的标准。该 体内 上述提到的 cre-lox 谱系示踪技术可在群体水平上提供祖细胞与子代细胞之间谱系关系的证据。然而，该谱系示踪技术在判断单个祖细胞是否具有自我更新能力并分化为多个谱系方面存在局限性。单细胞分析至关重要，因为若将多个具有不同谱系潜能的单能祖细胞合并分析，其总体结果可能表现出多谱系分化能力的假象。此外，干细胞通常仅占成体器官中的少数细胞群体，其活性可能被优势细胞群体所掩盖。因此，群体水平研究的阴性结果并不一定意味着干细胞的缺失。最后，目前的 cre-lox 谱系示踪技术尚无法用于评估自我更新能力。
为了填补胰腺前体细胞生物学领域的技术空白，研究人员设计了使用三维培养系统的克隆7-11或类器官12-15检测方法。我们实验室开发了两种针对胰腺前体细胞的克隆检测方法：一种包含商用的小鼠细胞外基质蛋白（ECM）制剂（见方法和设备表），另一种则包含层粘连蛋白水凝胶，即一种定义明确的人工ECM蛋白7-11。前体细胞被混合在含有甲基纤维素的半固体培养基中。甲基纤维素是一种由木浆纤维制备而成的生物学惰性且黏稠的物质，长期以来被常规用于造血克隆检测16。含甲基纤维素的半固体培养基限制了单个前体细胞的移动，从而防止其重新聚集；但该培养基又足够柔软，允许前体细胞在三维空间中生长并分化为细胞克隆。沿袭血液学领域的传统，能够产生细胞克隆的胰腺前体细胞被称为胰腺克隆形成单位（PCFU）。PCFU在含小鼠ECM的克隆检测体系中培养时，会形成囊状克隆，命名为&#34;环状&#34;克隆7。当在含小鼠ECM的培养体系中加入Wnt激动剂R-spondin1后，部分环状克隆会转变为&#34;致密&#34;克隆7。本文中，将这两种在小鼠ECM培养体系中生长的克隆统称为&#34;环状/致密&#34;克隆。当环状/致密克隆被解离为单细胞悬液，并重新接种至含有层粘连蛋白水凝胶的培养体系中时，会形成&#34;内分泌/腺泡&#34;克隆7。
通过单克隆分析发现，来自成年（2-4月龄）的大多数环状/致密型以及内分泌/腺泡型克隆 7,11 或幼龄（1周龄） 9 小鼠胰腺中表达全部三种谱系标志物。这表明大多数起源的PCFU具有三向分化潜能。在含小鼠细胞外基质的克隆形成实验中，成年小鼠PCFU在培养中表现出强大的自我更新能力，在11周内扩增约500,000倍。 7小鼠ECM优先支持导管细胞向导管系的分化，而非内分泌系和腺泡系；而在层粘连蛋白水凝胶存在的情况下，小鼠胰腺前体细胞集落形成单位（PCFUs）则更倾向于分化为内分泌细胞和腺泡细胞，向导管系的分化则相对减少。 7,9,11. 重要的是，胰岛素+胰高血糖素- 在层粘连蛋白水凝胶培养中生成单激素细胞，并在葡萄糖刺激下分泌胰岛素 体外 7,9，表明其功能上的成熟性。三谱系分化潜能 7,9 自我更新 11 通过单细胞显微操作确认单个PCFU的形成 即，每孔接种一个细胞以形成克隆。综上，这些结果表明，在出生后小鼠胰腺中存在具有三维培养活性的、能够自我更新且具有三向分化潜能的类祖细胞。
本文所述的小鼠PCFU检测方法源自先前为小鼠胚胎干细胞（mESCs）分化而来的祖细胞设计的克隆形成实验17。该方案已在另一篇JoVE出版物中有详细记录18。用于成年小鼠PCFU的含小鼠细胞外基质（ECM）克隆形成实验所需的培养组分和技术，与用于mESC来源祖细胞的方法相同17,18。因此，本文不再重复这些内容，而将重点介绍以下操作步骤：1）成年小鼠胰腺的解离及CD133+Sox9/EGFP+导管细胞的分选，以富集成年小鼠中的PCFU7；2）分选后细胞的单细胞操作；3）利用微流控qRT-PCR和整体免疫染色进行单克隆分析；4）将克隆解离为单细胞悬液，并重新接种至含小鼠ECM或层粘连蛋白水凝胶的克隆形成实验体系中。

<table><tbody><tr><td>小鼠细胞外基质蛋白（Matrigel）</td><td>Becton Dickinson（美国新泽西州富兰克林湖）</td><td>354230</td><td>储存于 -20 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>层粘连蛋白水凝胶</td><td>由 David Tirrell（美国加利福尼亚州帕萨迪纳）提供</td><td></td><td>-20 保存的储备液 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>甲基纤维素</td><td>Shinetsu Chemical（日本东京）</td><td></td><td>1,500 厘泊（动力黏度单位，等于 15 g/cm/sec）（高黏度）</td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液</td><td>Mediatech（美国弗吉尼亚州马纳萨斯）</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco（美国纽约州格兰岛）</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 圆锥形瓶</td><td>康宁股份有限公司（Corning, NY, USA）</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>100 mm × 20 mm 悬浮培养皿</td><td>康宁股份有限公司（美国纽约州康宁市）</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma（美国密苏里州圣路易斯）</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco（美国纽约州格兰岛）</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>DNase1</td><td>Calbiochem（德国达姆施塔特）</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶B</td><td>罗氏（CH-4070，巴塞尔，瑞士）</td><td>11088831001</td><td>储存于 -20 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD16/32</td><td>Biolegend（美国加利福尼亚州圣地亚哥）</td><td>101310</td><td>低内毒素，无叠氮化物</td></tr><tr><td>PE-Cy7 大鼠 IgG2a &amp;kappa; 同型对照</td><td>Biolegend（美国加利福尼亚州圣地亚哥）</td><td>400522</td><td></td></tr><tr><td>大鼠IgG1 &amp;kappa; 同型对照</td><td>eBioscience（美国加利福尼亚州圣地亚哥）</td><td>13-4301-82</td><td></td></tr><tr><td>抗CD133-生物素</td><td>eBioscience（美国加利福尼亚州圣地亚哥）</td><td>13-1331-82</td><td></td></tr><tr><td>抗CD71-PE-Cy7</td><td>Biolegend（美国加利福尼亚州圣地亚哥）</td><td>113812</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素-别藻红蛋白</td><td>Biolegend（美国加利福尼亚州圣地亚哥）</td><td>405207</td><td></td></tr><tr><td>4',6-二脒基-2-苯基吲哚</td><td>Invitrogen（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆，&amp;nbsp; 美国</td><td>3571</td><td>-20 保存的储备液 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>抗黏蛋白1</td><td>赛默飞世尔科技公司（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）</td><td>HM-1630-P1</td><td></td></tr><tr><td>Dylight 649 山羊抗叙利亚仓鼠</td><td>杰克逊免疫（美国宾夕法尼亚州韦斯特格罗夫）</td><td>127-495-160</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科改良伊格尔培养基：F-12营养混合物</td><td>Mediatech（美国弗吉尼亚州马纳萨斯）</td><td>10-092-CV</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Tissure Culture Biologicals（美国加利福尼亚州长滩）</td><td>101</td><td>-20 保存的储备液 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>Tris 乙二胺四乙酸</td><td>TEKnova（美国加利福尼亚州霍利斯特）</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Micro 试剂盒</td><td>Qiagen（荷兰芬洛）</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTec 逆转录试剂盒</td><td>Qiagen（荷兰芬洛）</td><td>205310</td><td></td></tr><tr><td>CellsDirect 一步法 qRT-PCR 试剂盒</td><td>Ambion/Invitrogen（美国纽约州格兰岛）</td><td>11753-100</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Santa Cruz Bio（美国加利福尼亚州圣克鲁斯）</td><td>SC-281692</td><td></td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>杰克逊免疫（美国宾夕法尼亚州韦斯特格罗夫）</td><td>005-000-121</td><td>储存于 -20 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>驴血清</td><td>杰克逊免疫（West Grove, PA, USA）</td><td>0017-000-121</td><td>储存于 -20 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma（美国密苏里州圣路易斯）</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Sigma（美国密苏里州圣路易斯）</td><td>T-4799</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>Invitrogen（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆，&amp;nbsp; 美国</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Life Technologies（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>无菌水</td><td>Gibco（美国纽约州格兰岛）</td><td>15230-147</td><td>分子生物学级</td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA)</td><td>13-678-8B</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m滤器网</td><td>Fisher Scientific（美国宾夕法尼亚州匹兹堡）</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 滤膜网格</td><td>Fisher Scientific（美国宾夕法尼亚州匹兹堡）</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>TC板 96孔悬浮</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924（先前为83.1835）</td><td></td></tr><tr><td>1 cc 注射器</td><td>Becton Dickinson（美国新泽西州富兰克林湖）</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>10 cc 注射器</td><td>Becton Dickinson（美国新泽西州富兰克林湖）</td><td>301604</td><td></td></tr><tr><td>48.48 动态阵列芯片</td><td>Fluidigm（美国加利福尼亚州旧金山）</td><td>BMK-M-48.48</td><td></td></tr><tr><td>Fluidigm GE 48.48 动态阵列样本 &amp;amp; 检测上样试剂盒</td><td>Fluidigm（美国加利福尼亚州旧金山）</td><td>85000800</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems（美国纽约州格兰岛）</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇单月桂酸山梨醇酯</td><td>Sigma（美国密苏里州圣路易斯）</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>MatTek（美国马萨诸塞州阿什兰）</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>带玻璃底的35 mm培养皿</td></tr><tr><td>吹嘴/橡胶管</td><td>Renova Life Inc. (College Park, MD, USA)</td><td>MP-SET</td><td></td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma（美国密苏里州圣路易斯）</td><td>N0636</td><td>-20 保存的储备液 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>血管内皮生长因子</td><td>R&amp;amp;D Systems（美国明尼苏达州明尼阿波利斯）</td><td>293-VE</td><td>-80 保存的储备液 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>激活素B</td><td>R&amp;amp;D Systems（美国明尼苏达州明尼阿波利斯）</td><td>659-AB</td><td>储存于 -80 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>艾塞那肽4</td><td>Sigma（美国密苏里州圣路易斯）</td><td>E7144</td><td>-20 保存的储备液 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>Rspondin-1</td><td>R&amp;amp;D Systems（美国明尼苏达州明尼阿波利斯）</td><td>3474-RS</td><td>储存于 -80 &amp;#176;C</td></tr><tr><td>Falcon 5 ml 聚苯乙烯圆底管</td><td>康宁股份有限公司（美国纽约州康宁市）</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide 针头 18 G x1 1/2</td><td>Becton Dickinson（美国新泽西州富兰克林湖）</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide 针头 16 G x 1 1/2</td><td>Becton Dickinson（美国新泽西州富兰克林湖）</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>Costar 超低吸附表面 24 孔平底板&amp;nbsp;</td><td>康宁股份有限公司（美国纽约州康宁市）</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96 孔黑色培养板</td><td>康宁股份有限公司（美国纽约州康宁市）</td><td>3603</td><td>平底、透明，带盖。&amp;nbsp; 黑色聚苯乙烯TC处理的细胞培养微孔板</td></tr><tr><td>蔡司 LSM510 META NLO Axiovert 200M 倒置显微镜</td><td>卡尔蔡司股份公司（Carl Zeiss AG，德国奥伯科亨）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biomark HD&amp;nbsp;</td><td>Fluidigm（美国加利福尼亚州旧金山）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aria 特殊订单研究产品细胞分选仪</td><td>Becton Dickinson（美国新泽西州富兰克林湖）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS/BSA</td><td></td><td></td><td>1× PBS&lt;br/&gt;
0.1% (wt/vol) BSA&lt;br/&gt;
青霉素-链霉素（49 单位/毫升青霉素，49 &amp;mu;g/ml 链霉素</td></tr><tr><td>PBS/BSA/Dnase1</td><td></td><td></td><td>1× PBS&lt;br/&gt;
0.1% (wt/vol) BSA&lt;br/&gt;
青霉素-链霉素（49 单位/毫升青霉素，49 &amp;mu;g/ml 链霉素&lt;br/&gt;
Dnase 1（每胰腺2,400单位/毫升）</td></tr></tbody></table>

体外集落形成实验用于鉴定从成年小鼠胰腺中分离的三潜能前体细胞

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

来自成年胰腺的干细胞和祖细胞可能是治疗1型糖尿病患者的一种潜在的治疗性类β细胞来源。然而，目前尚不清楚成年胰腺中是否存在干细胞和祖细胞。利用成年小鼠进行cre-lox谱系示踪的研究策略得出了相互矛盾的结果：一些研究支持β细胞可由导管产生——这正是推测成年胰腺祖细胞可能存在的部位；而另一些研究则否定了这一观点。然而，这些体内 cre-lox谱系示踪方法无法回答自我更新和多向分化能力这两个定义干细胞所必需的关键问题。为了初步弥补这一技术空白，我们设计了用于胰腺祖细胞的三维克隆形成实验。在我们首次发表该方法后不久，其他实验室独立开发出一种类似但并不完全相同的方法，称为类器官实验。与类器官实验相比，我们的方法采用甲基纤维素，其可形成黏性溶液，从而允许在较低浓度下添加细胞外基质蛋白。含甲基纤维素的实验体系更便于在单细胞水平上检测和分析祖细胞，这对于祖细胞仅占极小亚群的情况尤为重要——许多成年器官的干细胞正是如此。综合多个实验室的研究结果表明，从小鼠胰腺中分离出的类祖细胞可在体外实现自我更新和多向分化。本实验方案描述了两种基于甲基纤维素的克隆形成实验，用于鉴定小鼠胰腺祖细胞：一种含有商用的小鼠细胞外基质蛋白制剂，另一种则含有一种称为层粘连蛋白水凝胶的人工细胞外基质蛋白。本文展示的技术包括：1）成年小鼠胰腺的解离及CD133+Sox9/EGFP+导管细胞的分选；2）分选后细胞的单细胞操作；3）利用微流控qRT-PCR和整体免疫染色对单个克隆进行分析；以及4）将初级克隆解离为单细胞悬液，并重新接种至次级克隆实验中，以评估其自我更新或分化潜能。

可通过荧光激活细胞分选技术富集成年胰腺前体细胞（图1）。本研究中使用的Sox9/EGFP转基因小鼠品系最初由GENSAT脑图谱项目构建19，其中EGFP报告基因受控于一个细菌人工染色体，该染色体包含Sox9基因上游约75 kb和下游约150 kb的序列20。在这些小鼠中，EGFP能够高效且特异性地标记胰腺导管22。获取胰腺组织后，将其消化为单细胞悬液，并使用与生物素偶联的抗CD133抗体进行染色，随后用与STV-APC偶联的二抗进行染色。所得细胞通过流式细胞术结合适当的设门参数进行分析（图1）。采用不同设门参数获得的细胞可被分选并接种至含甲基纤维素的克隆形成实验中以评估克隆形成能力。既往研究表明，克隆形成能力仅存在于分选得到的CD133+Sox9/EGFP+导管细胞中7。
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体外 设计了用于检测从成年小鼠胰腺分离的前体细胞自我更新和分化能力的克隆形成实验。在这些实验中，胰腺前体细胞在含有甲基纤维素的半固体培养基中以三维形式形成细胞克隆。本文描述了单细胞操作及单个克隆表征的实验方案。

成体胰腺中的干细胞和祖细胞可能是治疗1型糖尿病患者的类β细胞的潜在治疗来源。

这些实验方案的总体目标是利用含甲基纤维素的半固体培养基培养体系，对从成年小鼠分离的胰腺前体细胞所形成的细胞克隆进行表征。我们的方法有助于回答胰腺前体细胞生物学领域的关键问题，例如：成年胰腺中的前体细胞具有怎样的自我更新能力和分化潜能？这些技术的主要优势在于能够对单个前体细胞进行研究，这对于明确其真实的生物学潜能至关重要。我们最初产生这些方法的想法，是在意识到研究造血干细胞的集落形成实验同样可应用于胰腺细胞群体时。来自我实验室的博士研究生Jacob Tremblay、博士后Janine Quijano以及技术员Angela Luo将演示这些操作步骤。动物处死后应立即用剪刀在腹壁正中线做一纵向切口，打开腹腔。用镊子轻轻提起脾脏，用剪刀剪断脾脏与胰腺脾叶之间的结缔组织。以相同方式剪断十二指肠叶和胃叶的结缔组织，将胰腺组织置于含有添加0.1% BSA及抗生素的DPBS、并置于冰上的培养皿中。然后，在解剖显微镜下，使用尖头镊子去除脂肪组织。现在将胰腺组织转移至组织培养超净台中，用三个连续的100毫米培养皿中的预冷PBS加BSA溶液（每皿含10毫升）依次冲洗组织。最后一次洗涤后，将胰腺组织放入无菌的干燥培养皿中，尽可能去除PBS加BSA溶液，然后将组织转移至另一盛有冰的干燥培养皿中。接下来，使用弹簧剪刀剪切胰腺组织2至3分钟，直至形成细小的组织碎片，并将组织碎片悬浮于2至3毫升新配制的预冷PBS、BSA和DNase I溶液中。用一个10毫升的移液管将组织块转移至一个50毫升的锥形管中，并加入足量的PBS BSA DNase I，使总体积达到10毫升。然后向组织中加入350至450微升的胶原酶B。将管子置于37摄氏度水浴中孵育8分钟，每隔3至4分钟轻轻摇晃一次。孵育结束后，使用带有16.5号针头的10毫升注射器吸取组织溶液，并在室温下沿50毫升离心管管壁反复吹打7次。随后将组织放回水浴中继续孵育8分钟，期间偶尔轻轻摇晃，然后如前所述再通过注射器吹打7次。最后一次机械解离后，取10 µL细胞悬液滴加至干燥的培养皿中，利用倒置相差显微镜配合10倍物镜观察，确认单细胞及小细胞团的存在。接下来，将离心管置于冰上，并用 PBS BSA DNase I 将总体积补至 50 毫升。离心细胞，然后使用 P1000 移液器将沉淀重悬于 5 毫升预冷的 PBS BSA DNase I 中。接着将细胞悬液依次通过 70 微米尼龙筛网和 40 微米尼龙筛网，滤入一个新的 50 毫升聚丙烯离心管中。用 PBS BSA DNase I 调整体积至 5 毫升，并进行细胞计数。然后将单细胞悬液用预冷的 PBS BSA DNase I 在冰上稀释至终浓度为每毫升 2 × 10⁷ 个细胞。为了对在含有甲基纤维素的半固体培养基中生长的胰腺克隆进行整体免疫染色，首先使用本生灯制备具有细小开口的玻璃巴斯德吸管。接着，将一个1毫升吸头的小端连接到一段薄壁橡胶管的一端，并在另一端连接吹吸口。将玻璃巴斯德吸管连接到吸头的粗端。然后用嘴控移液管吸取含有1%甲基纤维素的DMEM/F12培养基10至50微升。将含有克隆的培养皿置于倒置相差显微镜载物台上，使用10倍物镜寻找适合挑取的克隆。接着将移液管口靠近目标克隆，缓慢用嘴施加负压，吸起单个克隆。为了有效收集，放置玻璃移液管开口靠近细胞簇之前，务必确保目标菌落处于焦点位置。一旦菌落被收获，立即将移液管尖端插入含有4%多聚甲醛的96孔板中的一个孔内，并将菌落释放到孔中。待所有菌落收集完毕后，在4°C条件下轻轻振荡固定过夜。第二天早晨，在室温下用 PBS 清洗菌落两次，每次 10 至 30 分钟。从此步骤开始，使用带弯曲尖端的塑料 P10 移液枪吸取菌落。第二次清洗后，将固定的菌落在 1.5 毫升离心管中于 4 摄氏度下在石蜡中保存过夜。然后将菌落转移至96孔黑色底透板的各个孔中，每孔含有200 µL封闭缓冲液。在4°C下轻轻振荡孵育过夜。次日早晨，将菌落转移至新的孔中，每孔含有200 µL目标一抗，于4°C下继续轻轻振荡孵育过夜。次日早晨，将菌落转移至三个连续的孔中，每个孔内含有 200 µL PBS 加 0.1% Tween 20，在室温下每次洗涤 10 分钟。第三次洗涤后，将菌落转移至含有 200 µL 对应二抗的新孔中，于室温避光孵育两小时。孵育结束后，如上所述用 PBS-Tween 溶液洗涤菌落三次，然后将菌落转移至含有 DAPI 的新孔中，在室温下染色 5 分钟。然后将免疫染色的克隆集落收集到一个35毫米玻璃底培养皿中，并用盖玻片覆盖。最后在共聚焦显微镜下观察克隆集落。可通过荧光激活细胞分选技术富集成体胰腺前体细胞，使用适当的设门参数进行分选，因为形成克隆集落的能力仅存在于CD133 Sox9/EGFP阳性的导管细胞中。随后可根据其形态，通过倒置相差显微镜对胰腺类器官进行分类。经手动挑选后，还可通过微流控qRT-PCR分析检测其基因表达，或通过整体免疫染色检测其蛋白表达。事实上，许多单个类器官表达导管细胞、内分泌细胞和腺泡细胞的谱系标志物，例如，这表明这些类器官的起始胰腺类器官形成前体细胞大多具有三向分化潜能。熟练掌握后，若操作得当，解剖、解离、细胞染色与分选以及将细胞接种至含甲基纤维素的半固体培养基中的整个流程可在六到七小时内完成。在形成细胞集落后，可进一步采用定量 RT-PCR、Western 印迹或胰岛素分泌检测等方法，以探究集落的基因表达水平或功能特性。观看本视频后，您应能充分掌握如何解离成年小鼠胰腺，以及如何在含甲基纤维素的半固体培养体系中对胰腺前体细胞所形成的集落进行表征。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

体外测定菌落为表征的三效祖细胞从成人胰腺小鼠隔离

一种三维克隆形成实验方法，可使类似胰腺的前体细胞分化为表达胰岛素的克隆集落。该方法利用含有甲基纤维素、Matrigel 和生长因子的半固体培养基，使单个前体细胞在其中增殖并分化。...

一种用于定量检测表达胰岛素的集落形成前体细胞的实验方法

本研究描述了一种诱导人类胚胎干细胞向胰腺分化的定向分化方法。具有重要意义的发现是，内皮细胞共培养可介导由人类胚胎干细胞衍生的胰腺前体细胞成熟为表达胰岛素的细胞。...

内皮细胞共培养在定向分化策略中促进人胚胎干细胞向胰岛素生成胰腺细胞的成熟

本文描述了一种从人胎儿胰腺细胞中分离、培养和成像胰岛细胞簇（ICCs）的实验方案。...

人胎儿胰腺细胞簇的分离、培养与成像

本方案所述的三维培养方法可重现小鼠胚胎胰腺前体细胞发育为分支器官的过程，包括前体细胞的大量扩增、分化及形态发生。该方法适用于对微环境进行成像观察、功能干扰及操作干预。...

体外 从小鼠胚胎前体细胞诱导胰腺器官发生

在此，我们描述了一种四阶段方案，用于将人类胚胎干细胞分化为NKX6-1阳性细胞。+ 胰腺前体细胞 体外...

高效地将多能干细胞分化为NKX6-1+胰腺前体细胞

本文介绍了一种从悬浮培养的 e10.5...

由小鼠胰腺前体细胞生成无支架三维胰岛素表达胰腺类器官 体外

本方案比较了两种不同诱导方案在将人牙髓干细胞（hDPSCs）向胰腺谱系分化中的应用...

体外诱导人牙髓干细胞向胰腺谱系分化

本方案描述了一种改进的方法，可提高人多能干细胞（hPSCs）在平面单层培养中衍生的胰腺前体细胞共表达PDX1和NKX6.1转录因子的效率。该方法通过更换新鲜基质、调控细胞密度以及解离内胚层细胞来实现。...

人多能干细胞在二维培养系统中向胰腺β细胞前体的分化

干细胞向胰岛细胞的分化为传统的糖尿病治疗和疾病建模提供了替代方案。本文介绍了一种详细的干细胞培养方案，该方案结合商用分化试剂盒与先前已验证的方法，有助于在体外生成可分泌胰岛素的干细胞来源胰岛细胞。...

人多能干细胞向胰岛素分泌型胰岛样细胞团的分化

本文介绍了一种定向分化及功能分析类β细胞的方法。我们描述了在生成胰岛素分泌型胰腺细胞前，人多能干细胞所需的最佳培养条件和传代方法。该六阶段分化过程从定型内胚层形成开始，最终获得能够响应葡萄糖刺激而分泌胰岛素的功能性类β细胞。...

从人多能干细胞生成功能性胰岛素分泌胰腺细胞的优化方案

我们提供一种微创方案，用于将人干细胞来源的胰腺干细胞胰岛移植到免疫缺陷小鼠的肌肉内 体内...

小鼠肌肉内移植人多能干细胞衍生的胰腺内分泌细胞

学习使用甲基纤维素半固体培养基体外培养小鼠胰腺祖细胞集落的方法，以评估其自我更新与分化潜能。该技术有助于深入理解胰腺细胞生物学特性及再生医学应用前景。

体外集落形成实验用于鉴定从成年小鼠胰腺中分离的三潜能前体细胞

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