Name: 鼠标中枢神经系统的光透明使用被动CLARITY (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: 了解改进的被动CLARITY光透明技术，用于小鼠中枢神经系统的高分辨率三维成像。该方法提高了组织透明化的一致性和成本效益，有助于神经科学研究中神经元形态与连接的可视化分析。

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本工作得到了美国国立卫生研究院/国立神经疾病与卒中研究所（NIH/NINDS）基金项目1R01NS086981以及康拉德·N·希尔顿基金会的慷慨资助。我们感谢Laurent Bentolila博士和Matthew Schibler博士在共聚焦显微镜技术方面提供的宝贵帮助。我们感谢所有为CLARITY论坛（http://forum.claritytechniques.org）做出贡献的人员。我们特别感谢Karl Deisseroth博士向公众开放其实验室，传授这一引人入胜的技术。作者们还衷心感谢脑图谱医学研究组织、脑图谱支持基金会、Pierson-Lovelace基金会、Ahmanson基金会、Capital Group Companies慈善基金会、William M. 和 Linda R. Dietel慈善基金以及Northstar基金提供的慷慨支持。本出版物所报告的研究工作还部分得到了国家研究资源中心以及美国国立卫生研究院院长办公室的支持，资助编号为C06RR012169、C06RR015431和S10OD011939。本内容完全由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

所有实验均按照机构动物护理和使用委员会（IACUC）指南进行。本实验使用了 THY1-YFP、PLP-EGFP 和 PV-TdTomato 小鼠，但任何表达荧光蛋白的小鼠均可成功进行透明化处理和成像。
1. 组织制备
注意：多聚甲醛（PFA）和丙烯酰胺具有毒性且为刺激物。使用这些试剂进行实验时，必须在通风橱中操作，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、手套和护目用具）。
<ol>
	<li>将动物放入安乐死舱，加入约 1 ml 异氟烷，直至呼吸停止（约 2 - 3 分钟）。</li>
	<li>使用蠕动泵以约 5 ml/min 的流速，在 4 °C 条件下经心脏灌注灌注液（表 1），直至组织中的血液完全清除（5 - 10 分钟）。</li>
	<li>将灌注液更换为固定液（表 1），在 4 °C 条件下继续灌注，直至颈部和尾部明显变僵硬（5 - 10 分钟）。</li>
	<li>停止灌注并切除动物头部。首先去除颅骨周围的结缔组织，然后从颅骨腹侧去除骨组织，并小心将脑组织取出（图 1a），操作方法如文献20所述。 
	注意：需特别小心去除小脑绒球小结叶周围以及嗅球周围的颅骨。
	<ol>
		<li>按照文献21所述方法，用精细尖头剪刀轻轻插入脊髓与椎骨之间，逐段剪开椎骨，从而将脊髓从椎体中分离出来。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将脑组织置于塑料小鼠脑切片模具中，沿中线使用模具刀片将脑组织切为左右半球。</li>
	<li>将每个半脑和脊髓分别放入装有约 40 ml 水凝胶溶液（表 1）的 50 ml 离心管中。自此步骤起，所有后续操作中均需用铝箔包裹离心管，以保护荧光染料。</li>
	<li>将含有样本的离心管置于 4 °C 环境中，在轻柔振荡（约 30 rpm）条件下孵育 7 天。</li>
</ol>
2. 聚合反应
<ol>
	<li>弃去约25&#160;ml水凝胶，保留样品及约25&#160;ml水凝胶于离心管中。</li>
	<li>通过打开管盖并将离心管放入干燥器罐中，连接真空泵进行脱氧处理。抽真空至少10分钟，使溶解的气体从溶液中逸出并形成气泡。轻轻摇动以去除气泡。</li>
	<li>在2–3分钟内用100%氮气替换干燥器罐中的真空环境。当压力平衡后（干燥器罐盖可打开时），迅速盖紧管盖，防止氧气重新进入。</li>
	<li>将装有样品的离心管置于37 °C水浴中反应3小时，使水凝胶完成聚合。聚合完成后的水凝胶将呈现凝胶状质地（图1b）。注意：顶部残留少量未聚合水凝胶是可接受的。</li>
	<li>使用刮刀将聚合后的样品从离心管中取出，然后切除样品上多余的水凝胶。</li>
	<li>将样品置于无尘擦拭纸上，轻轻擦拭并滚动组织，通过此方式去除残留的水凝胶，仅在样品表面保留一层薄薄的聚合水凝胶。</li>
</ol>
3. 脂质去除
注意：脂质清除后的组织较为脆弱，需小心操作。排空管中液体时应使用细胞筛，以避免样本丢失。此外，样本在透明化过程中会逐渐膨胀，但这种膨胀可在折射率匹配过程中逆转。
注意：十二烷基硫酸钠（SDS）和硼酸具有刺激性。使用这些试剂时，应在通风橱中操作，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、手套和护目用具）。
<ol>
	<li>将聚合后的样品转移至一个洁净的50 ml离心管中，加入45 ml透明化缓冲液（表1）。在45 °C下轻轻振荡（约30 rpm）孵育。最初7天内每天更换缓冲液：将用过的透明化缓冲液倒入化学废液容器中，并加入约45 ml新鲜的透明化缓冲液。用铝箔包裹含有样品的离心管，以保护荧光团。</li>
	<li>初始7天后，将样品在40 °C下继续孵育，并每2–3天更换一次透明化缓冲液。持续透明化处理，直至所有脂质被溶解且组织达到透明状态（图1c）。小鼠脑半球通常需要4–6周，脊髓则需要2–4周。</li>
	<li>组织完全透明后，将样品转移至新的50 ml离心管中，在40 °C下用PBST（表1）轻轻振荡（约30 rpm）清洗4次，每次清洗持续24小时，以去除残留的SDS。</li>
</ol>
4. 分子染色
注意：4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）具有刺激性，使用该试剂的所有实验均应在通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、手套和护目用具）。
<ol>
	<li>将样品转移至洁净的15 ml离心管中，并加入含1 µg/ml DAPI的1x PBST（pH 7.5）。室温（RT）孵育24小时。用铝箔包裹含有样品的离心管，以保护荧光染料。</li>
	<li>在室温下用PBST洗涤3次，每次至少6小时。</li>
</ol>
5. 折射率匹配
注意：2,2′-硫代二乙醇（TDE）具有刺激性，使用该物质的任何实验均应在通风橱中进行，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、手套和护目用具）。
<ol>
	<li>将样品转移至洁净的 15 ml 离心管中，加入 30% (v/v) TDE 的 1x PBS 溶液（pH 7.5）至满管。在 40 °C 下轻轻振荡（约 30 rpm）孵育 24 小时。</li>
	<li>将 30% TDE 更换为 63% (v/v) TDE 的 1x PBS 溶液（pH 7.5）。在 40 °C 下轻轻振荡孵育 24 小时。 
	注意：样品将收缩回大约原始大小。</li>
	<li>在平坦、洁净的表面上，将一块可重复使用的粘性材料揉成直径均匀的圆柱体，其直径略大于样品的厚度。</li>
	<li>将可重复使用的粘性圆柱体以开口圆环形式（内径约 25 mm，顶部留有小开口）放置于 40 mm 玻底培养皿上。如需调整，可将圆柱体从玻璃表面取下，并用刀片进行修整。</li>
	<li>使用 p1000 移液枪头沿粘性圆柱体外缘滚动，以在可重复使用粘性材料与玻璃之间形成密封。</li>
	<li>在玻底培养皿上加入约 100 µl 63% TDE 溶液，并均匀铺展，覆盖粘性圆环内的玻璃表面。</li>
	<li>使用刮铲小心地将样品置于圆环中央，注意避免产生气泡。</li>
	<li>直接在样品上再加入 100 µl 63% TDE 溶液，然后立即盖上 40 mm 圆形盖玻片，使其覆盖在可重复使用的粘性材料上。</li>
	<li>用双手的食指、中指和无名指，小心地沿圆周边缘按压，直至盖玻片与样品完全接触。</li>
	<li>缓慢将玻底培养皿竖立并靠在支撑面上，然后用移液枪向其中加入 63% TDE 溶液，直至液面达到顶部的小开口处。使用无尘擦拭纸擦干移液枪头，防止溶液滴落在玻璃上。为避免腔室内产生气泡，切勿将移液枪完全排空。</li>
	<li>通过顶部的小开口加入硅胶弹性体，以封闭圆环并形成密闭腔室。静置 5 分钟使其干燥后再进行成像。</li>
</ol>
6. 显微镜观察
警告：共聚焦显微镜、单平面照明显微镜和光片显微镜中使用的激光器功率很高，可能导致失明。任何使用激光器的实验都必须在经过充分培训后，极其谨慎地进行，并佩戴适当的眼部防护装备。
<ol>
	<li>将含有样品的成像腔室放置在激光扫描共聚焦显微镜的载物台上。</li>
	<li>打开成像软件（参见材料表）。点击程序顶部的配置选项卡，然后点击激光器图标以启动氩激发激光器。勾选氩激光器旁边的复选框以开启激光器电源，并将滑动条调节至30%。观察指针缓慢升温至选定位置。
	<ol>
		<li>返回顶部的“采集”选项卡。在大框中 &#34;光路设置&#34; 转到加载/保存设置框，从下拉菜单中选择合适的波长通道以成像YFP（527 nm）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过查找标有红色超链接的“选择合适的成像物镜”来确定成像所需的适当物镜 &#34;目标：当前对象&#34; 在通道设置框下方。点击该选项卡将显示所有可用的物镜，选择某一物镜可自动旋转物镜转换器。
	<ol>
		<li>使用物镜（例如，10倍）且具有较大工作距离（大于待成像组织的厚度， 例如， 11 毫米）和较大的数值孔径（例如，0.3）以最大化平面内图像分辨率并最小化光学切片厚度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在左侧的下拉菜单栏中，打开 &#34;XY：分辨率&#34; 设置采集矩阵的窗口，称为 &#34;格式&#34;，调整为 1,024 × 1,024 或与物镜横向分辨率极限相匹配的数值。将缩放系数设置为尽可能低（例如., 1.7).</li>
	<li>在同一窗口中，通过下拉分别标注的菜单，设置8线平均和1帧平均参数。为获得高信噪比，请使用较大数值；为实现快速采集，请使用较小数值。 
	注意：对小鼠脑半球进行8次线平均和1次帧平均，大约需要4小时即可获得高质量图像。</li>
	<li>使用载物台控制装置定位样本。当观察到具有代表性的视野后，调节增益和偏移。 
	注意：增益和偏移值会因所成像的组织类型、荧光团和/或解剖特征的不同而有显著差异。对于YFP，将增益值设置为760至780，偏移值设置为-1.0至-1.5。</li>
	<li>选择 &#34;平铺扫描&#34; 并选择感兴趣区域的边界。设置待采集的z轴层叠图像的上限和下限。根据物镜的光学切片分辨率极限来设定光学切片的厚度。 
	注意：物镜的光学切片分辨率极限主要由其数值孔径决定。大多数显微镜控制软件会自动计算适用于所用物镜的数值。对于数值孔径为0.3的10倍物镜，该值约为11 µm。</li>
	<li>开始采集。 
	注意：这可能需要数小时。</li>
	<li>使用高倍物镜采集特定感兴趣区域的更高分辨率图像。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

水凝胶包埋组织的被动透明化技术（passive CLARITY）是一种简单且经济的组织透明化方法，适用于大块组织。该方法无需专用设备，可在温控摇床中轻松完成。经过数周时间，即使是全脑或脊髓等体积较大、高度髓鞘化的组织，也能变得透明，适合显微成像。尽管本报告主要关注中枢神经系统组织的透明化，但 passive CLARITY 可应用于任何类型的组织。
光学透明技术的相对优缺点此前已在文献中有所讨论13,17,22,，但最清晰的总结见于文献23。被动型CLARITY技术适用于需要同时处理大量样本且对可重复性要求较高的实验。利用水凝胶为组织提供额外支撑，有助于对组织进行多次探针标记。本报告中展示了小分子量染料DAPI的应用，但该方法同样可实现多轮抗体探针标记。
上述方法在几个关键方面与我们先前发表的方案15有所不同。首先，在当前的方法中，样本未通过心脏灌注水凝胶。这是因为水凝胶可能在灌注装置的管路和针头中过早聚合，导致灌注不完全和组织透明效果不一致。将经多聚甲醛固定的...

对完整神经解剖结构进行成像的能力，对于理解健康和疾病状态下的大脑具有极其重要的价值。传统上，三维成像需要对组织进行切片，以获得轴向分辨率并可视化深层解剖结构。这种方法能够产生高分辨率的数据集，但需要复杂的图像重建技术，且劳动强度极大。因此，其应用一直局限于小体积组织的成像1-3。相比之下，光学切片技术非常适合生成荧光标记组织的高分辨率三维图像。由于光学切片本质上是三维的，因此无需大量计算即可获得三维图像体积。然而，光散射和组织不透明性限制了组织光学切片的成像深度。在激光扫描共聚焦显微镜中，成像深度通常限制在约150 µm，而在双光子激发显微镜中也不超过800 µm4-8。
为了克服这些局限性，近年来开发并进一步优化了多种光学透明化技术，以实现对完整组织的深层显微成像。使用苯甲醇和苯甲酸苄酯（BABB）使固定组织透明是最早的方法之一9。然而，该方法受限于样本中荧光信号的淬灭以及高度髓鞘化结构的透明化不完全10。该技术的改进方法，如溶剂清除器官三维成像法（3D Imaging of Solvent Cleared Organs, 3DISCO），实现了快速且完全的组织透明化，但仍存在荧光信号迅速丢失的问题，尤其是黄色荧光蛋白（YFP）10。基于水的透明化溶液，如Sca/e11和SeeDB12，能够较好地保存荧光信号，但无法完全透明化高度髓鞘化的组织。清晰、无阻碍的大脑成像鸡尾酒法及计算分析（Clear, Unobstructed Brain Imaging Cocktails and Computational analysis, CUBIC）是一种有前景的新型光学透明化技术，似乎克服了先前开发的水基透明化溶液的局限性13。与其他光学透明化技术不同，脂质交换丙烯酰胺杂交的刚性成像兼容组织水凝胶法（Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel, CLARITY）14将脑组织包埋于多孔基质中，该基质可维持蛋白质、核酸和小分子的结构完整性，同时使脂质处于未结合状态。随后通过电泳方式去除脂质，最终获得光学透明的大脑样本，可利用常规技术轻松进行可视化观察和探测。
电泳组织透明化（ETC）在CLARITY技术中用于去除水凝胶包埋组织中的脂质，但ETC在实际操作中难以保持一致性，且经电泳处理的组织可能出现形变、褐变、荧光信号减弱以及抗体反应性下降等问题。被动脂质清除方法可避免上述局限，但所需透明化时间更长15-17。被动清除还允许同时处理大量样本，不受可用ETC设备数量的限制。降低多聚甲醛浓度并从水凝胶中去除双丙烯酰胺，可在导致组织更大程度膨胀的前提下显著加快透明化速度16。相较于原始CLARITY技术所用的折射率匹配溶液，目前已开发出成本更低的替代方案17-19。2,2'-二硫代乙醇（TDE）是一种价格低廉且高效的脑组织透明化试剂，可部分逆转脂质去除过程中发生的组织膨胀18。本报告将水凝胶包埋组织的被动透明化方法与TDE作为折射率匹配溶液的应用整合至原始CLARITY技术中，建立了一种高度可重复且成本低廉的小鼠中枢神经系统光学透明化实验方案。

<table><tbody><tr><td>10倍磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Fisher</td><td>BP399-1</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>32% 多聚甲醛（PFA）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714-5</td><td>灌注与水凝胶</td></tr><tr><td>2,2'-硫代二乙醇（TDE）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>166782-500G</td><td>折射率匹配溶液</td></tr><tr><td>40% 丙烯酰胺</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td>水凝胶</td></tr><tr><td>2% 双丙烯酰胺</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td>水凝胶</td></tr><tr><td>VA-044 引发剂</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>VA044</td><td>水凝胶</td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td>透明缓冲液</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Fisher</td><td>BP166-5</td><td>透明缓冲液</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Fisher</td><td>55255-1</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52002-100G</td><td>防腐剂</td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500G</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393-50KU</td><td>灌注</td></tr><tr><td>硝酸钠</td><td>Fisher</td><td>BP360-500</td><td>灌注</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td>细胞核染料</td></tr><tr><td>99.9% 异氟烷</td><td>Phoenix</td><td>57319-559-06</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Fisher</td><td>A1445-500</td><td>缓冲液</td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>Willco</td><td>HBSB-5040</td><td>Willco培养皿</td></tr><tr><td>可重复使用粘合剂</td><td>Bostick</td><td>371351</td><td>Blu-Tack</td></tr><tr><td>硅胶弹性体</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-CAST</td><td>Kwik-Cast</td></tr><tr><td>无尘擦拭纸</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td>KimWipe</td></tr><tr><td>小鼠脑切片模具</td><td>Roboz</td><td>SA-2175</td><td>组织切片</td></tr><tr><td>模具刀片</td><td>Roboz</td><td>RS-9887</td><td>组织切片</td></tr><tr><td>蠕动泵</td><td>Cole-Parmer</td><td>77122-24</td><td>灌注</td></tr><tr><td>激光扫描共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td>显微成像</td></tr><tr><td>成像软件</td><td>Leica</td><td>LAS AF</td><td>显微成像</td></tr></tbody></table>

小鼠中枢神经系统的被动clarity光学透明化处理

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

传统上，组织可视化需要将目标组织进行连续切片和成像，而每一片组织切片都会经历独特的非线性形变，这极大地阻碍了对中枢神经系统（CNS）中细胞形态、分布及连接性的评估。然而，光学透明化技术正在改变组织成像的方式。这些方法允许研究人员深入观察完整器官样本，从而在健康和疾病状态下对组织的结构组织提供前所未有的洞察。例如，透明脂质交换丙烯酰胺杂交刚性成像兼容组织水凝胶（CLARITY）技术通过构建一种能够固定重要生物分子、同时允许散射光的脂质自由扩散出去的基质，实现了这一目标。在去除脂质后，再通过折射率匹配，使组织变得透明，从而可方便地进行三维（3D）成像。然而，原始CLARITY方案中使用的电泳组织透明化（ETC）技术在实际操作中较难成功实施，且所用的专有折射率匹配溶液导致该技术常规应用成本较高。本报告展示了如何实施一种简单且低成本的光学透明化方案，该方案结合了被动CLARITY以提高组织完整性，以及先前报道的折射率匹配溶液2,2′-硫代二乙醇（TDE）。

可视化大脑的结构组织对于理解形态和连接性如何影响健康与疾病状态下的脑功能至关重要。光学透明化技术使得在完整组织中对细胞群体进行三维成像成为可能，从而能够系统性地研究形态学特征与连接性。
表达由特定细胞亚群启动子驱动的荧光蛋白的小鼠，使得研究者能够解析大脑中复杂的神经连接模式。THY1-YFP 转基因小鼠在光学透明化研究中被广泛使用，因为这些小鼠在大脑皮层和海马体以及其他脑区的一类投射神经元中表达 YFP（图 2a 和 2b）。此外，YFP+ 的皮层第五层神经元通过脊髓中的皮质脊髓束投射（图 2c 和 2d），使其在评估轴突损伤和/或脊髓损伤对皮层神经元影响方面具有重要价值15。结合共聚焦显微镜与光学透明化组织的光学切片技术，可轻松评估大范围解剖结构中神经元密度的差异。
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光学透明化技术正在彻底改变组织成像的方式。在本报告中，我们描述了对原始的“清除脂质-丙烯酰胺杂交的刚性成像兼容组织水凝胶”（CLARITY）方案所进行的改进，这些改进可获得更一致且成本更低的结果。

小鼠中枢神经系统的被动CLARITY光学透明化处理

传统上，组织可视化需要对目标组织进行连续切片和成像，使每个组织切片经历独特的……

本方案的总体目标是展示对原始CLARITY方案的改进，以获得更一致且更具成本效益的结果。该方法有助于解答神经科学中的关键问题，例如中枢神经系统中的三维形态和连接性。该技术的主要优势在于提高了小鼠中枢神经系统中光学透明化和显微成像的一致性。以一种经济高效且可重复的方式。该方法的可视化演示至关重要，因为成像室的构建过程较为复杂，仅通过文字描述难以清晰呈现。获取表达荧光蛋白的小鼠的多聚甲醛固定的脑和脊髓组织。将脑组织置于塑料小鼠脑切片矩阵中，沿中线用矩阵刀片进行半切。将每个半脑和脊髓分别加入到独立的50毫升离心管中。每管含有 40 毫升水凝胶溶液。用铝箔包裹试管，以保护荧光染料。将含有样品和水凝胶的试管置于 4 摄氏度条件下，轻轻振荡孵育 7 天。孵育结束后，弃去25毫升水凝胶，保留样品及约25毫升水凝胶于离心管中。随后打开管盖，将离心管放入真空干燥罐内，并将干燥罐连接至真空泵以去除氧气。抽真空至少持续10分钟。轻轻摇晃以去除释放出的氧气气泡。10分钟后，用100%氮气在两到三分钟内替换干燥器罐中的真空。待压力平衡且干燥器罐盖可以打开后，迅速盖紧试管，防止氧气重新进入。接下来，将装有样品的离心管置于37摄氏度水浴中反应三小时，使水凝胶完成聚合。三小时后，聚合完成的水凝胶将呈现类似凝胶的质地。使用刮铲将聚合后的样品从离心管中取出，然后切除样品周围多余的水凝胶。最后，将样品置于无尘擦拭纸上，轻轻擦拭并滚动组织，以去除残留的水凝胶，仅在样品上留下一层薄薄的聚合水凝胶。开始脂质清除过程时，将聚合后的样品转移至含有45毫升透明缓冲液的洁净50毫升离心管中，在45摄氏度下轻柔振荡孵育七天。在此初始七天期间，每天更换缓冲液，将用过的透明缓冲液倒入化学废液容器中。加入45毫升新鲜的透明化缓冲液。待所有脂质完全溶解且组织达到透明后，将样品转移至一个新的含有45毫升PBST的50毫升离心管中，在接下来的24小时内于40摄氏度下以温和振荡方式洗涤四次，以去除残留的SDS。最后一次PBST洗涤后，将样品转移至一个洁净的15毫升离心管中，管内含有1微克/毫升的DAPI和1×PBST。用铝箔包裹，室温孵育24小时。次日用PBST在室温下洗涤三次，每次洗涤至少六小时。随后进行折光率匹配。开始本步骤时，将样品转移至一个洁净的 15 毫升离心管中，管内含有 pH 7.5 的 2-2 硫代二乙醇和 1×PBS，按屏幕上所示进行孵育。在第二次孵育即将结束时，取一段可重复使用的粘合剂，将其搓成一个直径均匀的圆柱体，其直径略大于样品厚度。将该圆柱体以开口的环形置于一个 40 毫米玻璃底培养皿上，形成成像腔室。然后使用P1000移液器吸头沿圆柱形容器外缘滚动，使可重复使用的粘合剂与玻璃之间形成密封。向玻璃培养皿中加入约100微升63%TDE，使其扩散并覆盖粘合剂圈内的玻璃表面。接着用刮铲小心地将样品置于圆圈中央，注意避免产生气泡。接着，用移液枪吸取 100 微升 63% TDE，直接加到样本上，并立即在可重复使用的粘性密封垫上放置一个 40 毫米的圆形盖玻片。用双手的食指、中指和无名指小心地沿圆周边缘轻压，直到盖玻片与样本完全接触。然后，将玻璃底培养皿缓慢竖起并靠在支撑面上，再用移液枪缓慢加入 63% TDE，直至液体上升至顶部的小开口处。使用无尘布擦干移液枪头，以免溶液滴落在玻璃上。最后，向小开口处加入硅胶弹性体，封闭圆形区域以形成密闭腔室。静置五分钟干燥后，进行成像。将装有样品的成像室置于激光扫描共聚焦显微镜的载物台上。打开成像软件，点击程序顶部的“配置”选项卡，然后点击激光器图标，以开启氩离子激发激光。勾选氩离子激光器旁边的复选框以启动激光器，并将滑动条调节至30%。随后返回顶部的“采集”选项卡。在光路设置框中，进入加载-保存设置框，选择下拉菜单以选取用于发射 YFP 的合适波长通道。在通道设置框中，通过点击标有“objective current object”的红色超链接来选择适合成像的物镜。应选用工作距离大于组织厚度的物镜。并采用大数值孔径以最大化平面内图像分辨率，并最小化光学切片厚度。在下拉菜单的左列中打开XY分辨率窗口，将采集矩阵（称为格式）设置为1024×1024，或根据物镜的横向分辨率极限选择适当的数值。将缩放因子设置为尽可能低。使用1.7。在同一窗口中，通过下拉相应标签的菜单，设置第八行平均和单帧平均参数。使用载物台控制装置定位样品。当观察到具有代表性的视野后，将YFP的增益设置为760至780之间，偏移量设置为1.0至1.5之间。选择拼图扫描（tile scan），然后设定待采集Z轴层叠图像的上限和下限范围。根据物镜的光学切片分辨率极限设置光学切片厚度，然后开始采集。该图像显示了以5倍放大倍率成像并在三维中重建的大脑皮层和海马体中的YFP阳性神经元。比例尺代表1毫米。该脑皮层10倍图像堆栈的最大强度投影展示了皮层第五层锥体神经元的树突分支。此处比例尺代表100微米。此处显示了在完整颈段和胸段脊髓中THY-1YFP的表达，以5倍放大倍率成像，并进行三维重建。比例尺代表2毫米。最后，该脊髓10倍成像图像堆栈的最大强度投影显示了单个轴突，比例尺代表100微米。若操作得当，完整脊髓标本的处理可在2至4周内完成，半切脑标本则需4至6周。完成此操作后，可进一步采用其他方法（如免疫组织化学）来回答需要更复杂生化表型分析的问题。观看本视频后，您应能够充分理解如何对小鼠中枢神经系统进行光学透明化处理及成像，具体方法包括被动透明化技术与激光共聚焦显微镜成像。

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神经科学

鼠标中枢神经系统的光透明使用被动CLARITY

通过在成像前对器官进行光学透明化处理，可实现对整只小鼠器官的多光子显微成像，但并非所有方案都能保留荧光蛋白的荧光信号。我们采用基于乙醇脱水和苯甲醇：苯甲酸苄酯透明化的光学透明方法，展示了表达黄色荧光蛋白（YFP）的整只小鼠脑组织的高分辨率多光子图像。...

表达黄色荧光蛋白的小鼠脑组织透明化后的多光子显微成像

采用激光光凝法对小鼠眼睛的房水引流系统进行处理，以诱导慢性高眼压。激光处理后，眼内压（IOP）可升高并持续数月。通过视觉运动反应测试监测实验动物的视力和对比敏感度下降情况。...

一种表征视觉缺陷的激光诱导小鼠慢性眼压升高模型

本文中，我们详细描述了以高分辨率重建荧光标记小鼠大脑精细脑解剖结构的完整实验流程。所述方案包括样本制备与透明化处理、成像用样本的装载、数据后处理以及多尺度可视化。...

利用共聚焦光片显微镜对整只小鼠大脑进行微米级分辨率光学断层成像

上脊髓投射对痛觉感知及其他行为具有重要作用，其中5-羟色胺能纤维是这类纤维系统之一。本研究重点探讨将CLARITY/CUBIC联合技术应用于小鼠脊髓，以研究这些5-羟色胺能纤维的终止分布。...

利用CLARITY/CUBIC技术对小鼠脊髓中的5-羟色胺能纤维进行成像

本文描述了一种利用高分辨率谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）对小鼠视网膜进行活体成像的实验方案。重点针对视乳头周围区域的视网膜神经节细胞（RGC），介绍了多种扫描与定量分析方法。...

光学相干断层扫描：活体成像小鼠视网膜神经节细胞 In Vivo

本文介绍了一种通过将水通道蛋白-4（AQP4）特异性T细胞从AQP4-/-小鼠转移至野生型（WT）小鼠，以诱导瘫痪和视神经脊髓炎症的实验方案。此外，我们还展示了如何利用连续光学相干断层扫描来监测视觉系统功能障碍。...

诱导特异性针对视神经脊髓炎自身抗原水通道蛋白-4的T细胞在小鼠中引发瘫痪和视觉系统损伤

本文介绍了两种新颖的方法——psPACT和mPACT，可用于实现啮齿类动物完整中枢神经系统组织血管结构的最大光学透明化，并进而进行显微分析。...

新型被动透明化方法用于快速实现全中枢神经系统组织光学透明

本文介绍了一种将CLARITY方法应用于全层视网膜组织的实验方案，旨在提升视网膜神经元及其亚细胞结构的标准免疫组织化学染色质量和高分辨率成像效果。...

采用CLARITY组织透明化方法对整体视网膜进行免疫染色

本方案提供了一种利用组织透明化方法ScaleSF对脑切片进行神经元成像的详细操作流程。该方案包括脑组织制备、组织透明化处理、透明化切片的操作以及从介观到微观水平对神经元结构进行共聚焦激光扫描显微镜成像。...

一种用于从介观到微观尺度神经元成像的组织透明化方法

光学透明技术，例如吸收性分子溶液，可暂时减少光散射，以增强生物成像效果，并具有生物相容性和可逆性 体内...

利用吸收性分子实现短暂光学透明化 离体 和 体内 成像

了解改进的被动CLARITY光透明技术，用于小鼠中枢神经系统的高分辨率三维成像。该方法提高了组织透明化的一致性和成本效益，有助于神经科学研究中神经元形态与连接的可视化分析。

小鼠中枢神经系统的被动CLARITY光学透明化处理

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