鼠标中枢神经系统的光透明使用被动CLARITY
June 30th, 2016
光学透明化技术正在彻底改变组织的可视化方式。在本报告中，我们描述了原始 Clear Lipid 交换的丙烯酰胺杂交刚性成像兼容的 Tissue-hYdrogel （CLARITY） 方案的修改，该方案可产生更一致且成本更低的结果。
该方案的总体目标是展示对原始 CLARITY 方案的修改，从而产生更一致和更具成本效益的结果。这种方法可以帮助回答神经科学中的关键问题，例如 3D 形态学和中枢神经系统的连接性。该技术的主要优点是它提高了小鼠中枢神经系统中光学透明化和显微镜检查的一致性。
以经济高效且可复制的方式。这种方法的视觉演示至关重要。由于成像室结构复杂，从书面描述中不易看出。
从表达荧光蛋白的小鼠中获得多聚甲醛固定的脑和脊髓组织。通过将大脑放置在塑料小鼠脑基质中并用基质刀片沿中线切割来半切开大脑。添加每个半球和脊髓，以分隔 50 毫升离心管。
每个含有 40 毫升水凝胶溶液。用铝箔覆盖试管以保护荧光团。并将含有样品和水凝胶的试管在 4 摄氏度下轻轻摇动孵育 7 天。
孵育期结束后，丢弃 25 毫升水凝胶，留下样品，并在离心管中丢弃大约 25 毫升水凝胶。接下来，通过取下盖子，将离心管放入干燥罐中，并将罐连接到真空中，对样品进行脱氧。真空至少 10 分钟。
轻轻摇晃以去除排出的氧气气泡。10 分钟后，在 2 到 3 分钟内用 100% 氮气更换干燥罐中的真空。一旦压力达到平衡并且可以打开干燥罐的顶部，请迅速盖上管子以防止氧气重新引入。
接下来，将装有样品的试管置于 37 摄氏度的水浴中 3 小时，直至聚合完成，从而聚合水凝胶。三小时后，聚合的水凝胶将呈现出凝胶状的稠度。用刮刀从离心管中取出聚合样品，然后从样品中切掉多余的水凝胶。
最后，将样品放在不起毛的抹布上，轻轻摩擦和滚动其上的组织，去除剩余的水凝胶，在样品上只留下一层薄薄的聚合水凝胶。要开始脂质去除过程，请将聚合样品转移到装有 45 mL透明缓冲液的干净的 50 mL离心管中，并在 45 摄氏度下轻轻摇动孵育 7 天。在最初的 7 天内，每天更换缓冲液，将用过的澄清缓冲液倒入化学废物容器中。
并加入 45 毫升新鲜的清除缓冲液。一旦所有脂质都溶解并且组织达到透明度，将样品转移到装有 45 毫升 PBST 的新 50 毫升离心管中，并在接下来的 24 小时内在 40 摄氏度下轻轻摇晃洗涤四次，以去除残留的 SDS。最后一次 PBST 洗涤后，将样品转移到干净的 15 毫升离心管中，其中填充有每毫升 1 微克 DAPI 和 1xPBST。
用箔纸包裹并在室温下孵育 24 小时。第二天，在室温下在 PBST 中洗涤 3 次，每次洗涤至少 6 小时。然后进行折射率匹配。
要开始这部分程序，请将样品转移到一个干净的 15 毫升离心管中，该离心管在 PH 值为 7.5 时填充有 2-2 硫代二乙醇和 1xPBS，并如屏幕所示孵育。在第二次孵育结束时，通过将一块可重复使用的粘合剂滚动到直径均匀的圆柱体中来创建和成像室，该圆柱体的直径仅略大于样品的厚度。将圆筒放在 40 毫米玻璃底盘上的开口圆圈中。
然后使用 P1000 移液器吸头在圆筒外缘滚动，在可重复使用的胶粘剂和玻璃之间形成密封。将大约 100 微升 63%TDE 移液到玻璃皿上，并将其涂抹在可重复使用的粘合剂圆圈内以覆盖玻璃表面。然后用刮刀小心地将样品放在圆圈中间，注意不要形成气泡。
接下来，将另外 100 微升 63%TDE 直接移液到样品上，并立即将 40 毫米圆形盖玻片放在可重复使用的粘合剂上。用双手的食指、中指和无名指小心地按压圆圈的周边，直到盖玻片与样品接触。现在，慢慢地将玻璃底培养皿靠在表面上直立，然后用移液管加入 63%TDE，直到溶液到达顶部的小开口。
使用无绒布擦干移液器吸头，以免溶液滴落在玻璃杯上。最后，在小开口处添加硅弹性体以封闭圆圈并创建一个封闭的腔室。等待 5 分钟干燥，然后继续成像。
将装有样品的成像室放在激光扫描共聚焦显微镜的载物台上。打开成像软件，打开氩激发激光器，单击程序顶部的配置选项卡，然后单击激光器图标。选中氩气旁边的框以为激光器供电，并将载玻片刻度移动到 30%返回到顶部的采集选项卡。
在光束路径设置框中，转到 load-save 设置框，然后选择下拉菜单以选择合适的波长通道来发射 YFP。在通道设置框中，通过单击标记为 objective current object 的红色超链接来选择合适的物镜进行成像。使用工作距离大于组织厚度的物镜。
以及一个大的数值孔径，以最大限度地提高面内图像分辨率，并最大限度地减少光学截面厚度。在下拉菜单的左列上，打开 XY 分辨率窗口以设置采集矩阵，称为 format （格式） 或 1024x1024 或适合物镜横向分辨率限制的值。将缩放系数设置得尽可能低。
此处使用了 1.7。在同一窗口中，通过相应地下拉单独标记的菜单来设置第 8 行平均和 1 帧平均参数。使用载物台控件找到样品。
看到代表性磁场后，将增益设置为 760 到 780 之间，并将 YFP 的偏移设置为 1.0 到 1.5 之间。选择 tile scan。然后设置要获取的 Z 堆栈的上限和下限。
根据物镜光学截面分辨率限制设置光学截面的厚度，然后开始采集。该图像显示了大脑皮层和海马体中的 YFP 阳性神经元，成像为 5 倍放大并以 3D 重建。比例尺表示 1 毫米。
大脑皮层 10 倍图像堆栈的这种最大强度投影妖孖了皮层第 5 层锥体神经元的树突状化。这里的比例尺代表 100 微米。在这里，THY-1YFP 表达显示在完整的颈椎和胸椎脊髓中，以 5 倍放大倍率成像，并以 3D 重建。
比例尺表示 2 毫米。最后，脊髓的 10 倍成像堆栈的最大强度投影展示了单个轴突，比例尺代表 100 微米。如果作得当，这种技术可以在 2 到 4 周内完成整个脊髓，4 到 6 周完成半切开的大脑。
按照此程序，可以采用其他方法，例如免疫化学，以回答需要更复杂的生化表型分析的问题。观看此视频后，您应该对如何对小鼠中枢神经系统进行光学透明化和成像有了很好的了解。使用被动清晰度和激光共聚焦显微镜。
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概述
本报告讨论了对原始CLARITY协议的修改，增强了光学清澈技术的一致性和成本效益。这些进步对于神经科学研究中的组织可视化至关重要。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 光学成像
- 组织清澈技术
背景
- 光学清澈技术改善了组织可视化。
- CLARITY协议在神经科学成像中被广泛使用。
- 修改旨在增强可重复性并降低成本。
- 视觉演示对于理解复杂的方法至关重要。
研究目的
- 展示对CLARITY协议的修改。
- 在光学清澈中实现更一致的结果。
- 为神经科学研究提供一种成本效益的方法。
使用的方法
- 对原始CLARITY协议的修改。
- 成像腔构建的视觉演示。
- 在小鼠中枢神经系统中的应用。
- 专注于3D形态和连接性分析。
主要结果
- 光学清澈的一致性得到改善。
- 为研究人员提供了成本效益的方法。
- 增强了神经科学的成像能力。
- 为复杂的程序提供了视觉辅助。
结论
- 对CLARITY协议的修改是有益的。
- 一致的结果可以推进神经科学研究。
- 视觉演示有助于理解复杂的方法。
常见问题
Executive Industry Relevance
Optical clearing techniques like passive CLARITY enable 3D visualization of intact neural tissue, addressing a key bottleneck in neuroscience target validation where serial sectioning introduces artifacts that compromise morphological and connectivity analysis. By improving consistency and reducing cost, this method supports reliable preclinical modeling of CNS disorders, enhancing predictive confidence in early discovery stages. The approach facilitates mechanistic de-risking by allowing direct observation of structural phenotypes in disease-relevant systems without tissue deformation artifacts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through intact 3D morphology and connectivity analysis in the mouse CNS.
- Operational Value: Provides biological de-risking by preserving tissue integrity while removing light-scattering lipids for clear imaging.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by generating quantitative structural data on neuronal networks for target validation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows by rendering tissue transparent and amenable to high-resolution imaging.
- Reproducibility: Addresses assay standardization through passive CLARITY modifications that improve consistency in clearing outcomes.
- Platform Reuse: Enables scalable compound evaluation by creating reusable imaging chambers compatible with laser scanning confocal microscopy.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Supports translational biomarker alignment by allowing longitudinal imaging of structural changes in intact spinal cord and brain models.
- Preclinical Continuity: Bridges discovery through preclinical validation by providing 3D structural readouts applicable to disease progression studies.
- Risk-Adjusted Decisions: Facilitates advancement decisions by delivering clear axonal and dendritic morphology data for mechanistic de-risking.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery through Lead Identification to Preclinical work, specifically supporting hypothesis testing and pathway clarification in CNS target validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling 3D imaging of neuronal morphology and connectivity in intact mouse CNS tissue.
- Screening: Describes assay readiness through tissue transparency achieved via lipid removal and refractive index matching with TDE.
- Analytics: Highlights quantitative outputs such as 3D reconstruction of YFP-positive neurons, dendritic arborization, and axonal tracking for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing structural biomarkers in disease-relevant CNS models without sectioning artifacts.
- Enterprise Reuse: Frames the technique as a reusable capability through the construction of a durable imaging chamber using reusable adhesive and glass-bottom dishes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through reduced mechanistic ambiguity in CNS structural analysis.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via passive CLARITY protocol modifications that eliminate electrophoretic variability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by providing reliable 3D structural data to reduce late-stage biological risk in CNS programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through quantitative imaging of neuronal networks for target validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histology, hydrogel polymerization, and lipid clearing techniques.
- Needs instrumentation including centrifuge tubes, water baths, vacuum desiccators, and laser scanning confocal microscopes.
- Demands cross-team standardization for buffer exchange, washing steps, and refractive index matching procedures.
- Involves adaptation considerations across model systems, as timing varies from 2-4 weeks for spinal cords to 4-6 weeks for hemisected brains.
- Includes practical limitations such as the need for fluorescent protein expression or immunostaining for visualization and careful handling to avoid bubble formation during imaging chamber setup.
