Name: Microtumors使用3D人体Biogel培养体系和病人源性胶质母细胞瘤的Kinomic剖析和药物反应测试的生成 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 学习使用3D人体生物凝胶培养体系生成胶质母细胞瘤微肿瘤，并进行激酶组分析和高通量药物反应测试。该方法为个性化癌症治疗研究提供了微型且真实的肿瘤培养平台。

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由美国国立卫生研究院（NIH）R21基金（项目负责人：C. Willey，编号：CA185712-01）、脑肿瘤SPORE奖（项目负责人：G.Y. Gillespie，编号：P20CA 151129-03）以及SBIR合同（项目负责人：R. Singh，编号：N43CO-2013-00026）资助。

注意：所有异种移植治疗评估均采用机构动物护理和使用委员会批准的方案，通过胶质母细胞瘤的原位肿瘤模型进行。
1. 患者来源的胶质母细胞瘤异种移植细胞的分离
<ol>
	<li>试剂的制备
	<ol>
		<li>用无菌水重悬胶原酶-I，配制成5 mg/ml的浓度，并进行无菌过滤。分装为1 ml等份，于-20 °C保存（在100 ml酶溶液中终浓度为50 µg/ml）。</li>
		<li>将100 µg表皮生长因子（EGF）溶解于2 ml无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中。分装为100 µl（每份含5 µg/100 µl），于-20 °C保存，使用时终浓度为10 ng/ml。</li>
		<li>将100 µg FGF-β溶解于2 ml无菌PBS中。分装为100 µl（5 µg/100 µl）等份，于-20 °C保存，工作浓度为10 ng/ml。</li>
		<li>向一个500 ml的Neurobasal培养基（NBM）瓶中加入以下成分以制备完全NBM：10 ml 无维生素A的B-27添加剂、5 ml N2添加剂、100 µl EGF、100 µl 碱性成纤维细胞生长因子（FGF-Basic）、5 ml 两性霉素B、0.5 ml 庆大霉素、5 ml L-谷氨酰胺。</li>
		<li>将98.5 ml PBS、1 ml collagenase-1和0.5 ml 10x胰蛋白酶/EDTA混合，制备新鲜酶溶液，并通过0.22 µm孔径滤器过滤除菌。</li>
		<li>准备或获取少量无菌的含7%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）/F12细胞培养液，以及不含钙和镁的1×PBS。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肿瘤解离 
	注意：本实验操作需要使用此前已在右后肢侧 flank 区域接种肿瘤细胞并已形成可触及肿瘤块的裸鼠（athymic nu/nu 小鼠）。在本示例中，我们使用了来源于患者的异种移植胶质母细胞瘤细胞 JX10 和 JX12。17.
	<ol>
		<li>用2%氯己定喷洒工作区域以灭菌，并准备好所需器械和材料，包括一次性持针器、镊子、手术刀、玻璃培养皿、酶溶液、PBS和氯己定（参见 图2A).</li>
		<li>安乐死携带 flank 肿瘤的小鼠。CO₂ 的置换速率应控制在每分钟 20%。2 使用30% CO2. 小鼠出现呼吸骤停后，维持 CO2 持续流动约1分钟（通常总计3分钟）。将小鼠从舱室中取出，并通过颈椎脱位进行二次安乐死确认。用3%氯己定喷洒动物体表以消毒皮肤。</li>
		<li>在固定小鼠保持稳定的同时，使用带有#11刀片的一次性无菌手术刀，在距肿瘤组织约1.5 cm处作半圆形皮肤切口（适用于 flank 植瘤模型），切口起始于肿瘤头侧，向小鼠腹部方向切开，并环绕至尾侧末端。</li>
		<li>用手指在切口尾端施加轻柔牵引，将皮肤从肿瘤团块上翻起，然后按压皮肤表面，使肿瘤抬高，以获得最佳操作视野，同时避免触碰肿瘤（参见 图2B).</li>
		<li>使用镊子进行钝性解剖，轻柔地将肿瘤组织从腹膜壁和皮肤分离（参见 图2C).</li>
		<li>用镊子将肿瘤组织转移至无菌玻璃培养皿中（切勿使用塑料培养皿，以防剪切过程中破裂），妥善处理动物尸体，并将使用过的器械放置一旁。</li>
		<li>使用一套新的无菌器械（带#11刀片的手术刀、半弯镊子）清除肿瘤组织上的坏死组织以及覆盖肿瘤的膜状宿主结缔组织。</li>
		<li>在生物安全柜中，将15 ml酶溶液加入无菌带通气孔的消化烧瓶（含搅拌子），开始缓慢搅拌。</li>
		<li>在无菌玻璃培养皿中，用无菌 PBS 洗涤收获的肿瘤组织 3 至 5 次，以去除多余血液（可倾倒或使用注射器用 PBS 冲洗）。轻轻倾斜培养皿，用移液器或抽吸装置移除洗涤液。使用两把 #11 手术刀片将组织充分切碎（见 图 2D).</li>
		<li>向切碎的肿瘤组织中加入14 ml酶溶液，轻轻吹打2–3次。将混合物转移至带通气孔的消化烧瓶中，缓慢搅拌20分钟。准备5个50 ml锥形管，每管加入1.5 ml FBS，用于在步骤1.2.11中中和胰蛋白酶。</li>
		<li>20分钟后，从消化瓶中收集14 ml细胞悬液，加入含FBS的离心管中。向消化瓶中再加入14 ml新鲜酶溶液，继续搅拌。</li>
		<li>在室温下以150 × g离心收集的细胞8分钟，弃去上清液。向沉淀中加入45 ml完全NBM，轻轻混匀，重复离心以去除血清。将沉淀重悬于5 ml完全NBM中，置于冰上保存。</li>
		<li>重复细胞收获步骤，共进行5次收获，将所有收获的细胞合并至一个装有冰的锥形管中。</li>
		<li>将一个40 µm细胞筛置于50 ml锥形管顶部。先用10 ml DMEM/F12 + 7% FBS过筛，然后用10 ml PBS冲洗，以完成细胞筛的预处理。</li>
		<li>缓慢将细胞悬液加入滤筛中，使其自然滴落（参见 图2M）。每次添加新样品时，轻轻抬起细胞筛的标签，以打破可能形成的负压，使悬浮细胞自由通过（参见 图2N).</li>
		<li>将过滤后的细胞悬液按上述方法离心。用10 ml完全NBM重悬，加入0.04%台盼蓝，使用血细胞计数板计数，确定活细胞总数。将细胞置于冰上，直至进行微肿瘤制备。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 替代组织解离方案
<ol>
	<li>自动化组织解离仪及解离系统。
	<ol>
		<li>将解离管放入细胞解离仪中，选择程序 &#34;Tumor _02_02&#34;，启动并运行 32 秒。将管子转移至旋转仪，置于 37 °C 培养箱中孵育 40 分钟。</li>
		<li>在室温下以 150 × g 离心悬浮细胞 8 分钟，弃去上清液。在离心过程中，准备细胞悬液处理所需的试剂。加入 10 ml 无血清 NBM，并轻轻吹打混匀悬液。</li>
		<li>离心后，获得含有约 10 - 30 × 106 个活细胞（约 0.3 ml）的细胞沉淀。将沉淀重悬于 10 ml 无血清 NBM 中（见图 2O）。通过排阻法检测活细胞数量（见步骤 3.2.2）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 微肿瘤生成
<ol>
	<li>试剂的制备
	<ol>
		<li>按1.1.4步骤配制完全神经球培养基（NBM），并根据内部方案配制中和的高密度人源生物凝胶（HuBiogel）（HDHG，3 mg/ml）。也可使用类似的生物凝胶基质。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微肿瘤的生成与培养
	<ol>
		<li>将新鲜解离的PDX细胞以单细胞悬液形式置于冰上，使用完全NBM保存。</li>
		<li>将细胞悬液与等体积的台盼蓝溶液（PBS中0.4%）混合，用血细胞计数板通过台盼蓝排斥法测定细胞数量和活力18。根据所需生成每微肿瘤50,000个细胞的量，计算所需体积（体积 = (50,000 细胞/肿瘤 × 肿瘤数量) / (活细胞数 / 1 ml)），移除相应体积的细胞悬液，并转移至新的锥形管中。</li>
		<li>在室温下以150 × g离心8分钟浓缩细胞，弃去上清液，用预冷的HDHG溶液重悬细胞沉淀，最终比例为1份含FBS的细胞与4份HDHG。</li>
		<li>使用电子多通道移液器将10 µl细胞-HDHG混合物分配至96针钢制板（具有疏水涂层）上，形成微肿瘤（每个2 mm的微球含50,000个细胞）。</li>
		<li>将3D肿瘤微球置于组织培养孵育箱（37 °C、5% CO2、湿度饱和）中孵育15分钟，使微球凝胶化。</li>
		<li>凝胶化后，使用电子多通道移液器和定制针状装置，将微肿瘤（10 µl）转移至含有完全NBM的定制悬浮培养室（50 ml）或大体积培养皿（10 cm）中。</li>
		<li>在组织培养孵育箱中培养1–2天后，使用宽口移液器将微肿瘤转移至96孔培养板中，每孔含50 µl NBM，并进行各种检测与分析实验方案。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微肿瘤的药物处理与维持
	<ol>
		<li>选择药物测试的终浓度。 
		注：若该药物在二维培养中有已知活性，可选择其IC50值的2倍作为中间剂量浓度，并在其上下各选择3倍系列稀释浓度，共5个剂量水平。例如，若该药物在二维培养中的IC50为9 µM，则选择2 µM、6 µM、18 µM、54 µM和162 µM作为药物测试的终浓度。</li>
		<li>用完全NBM将二甲基亚砜（DMSO）储存液稀释，配制2倍药物给药溶液。再将给药溶液用含1% DMSO的培养基稀释，制备成5个剂量、3倍系列稀释的溶液。</li>
		<li>向每孔含有50 µl微肿瘤的检测板中加入50 µl给药溶液，使终DMSO浓度为0.5%。对每个药物剂量（按3.3.1确定）的每份重复样本（例如，4份）均重复此操作。</li>
		<li>将培养物置于37 °C、5% CO2、湿度饱和的组织培养孵育箱中维持1–14天。每周两次更换培养基和药物溶液以维持培养。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 微肿瘤的形态学和表型分析
<ol>
	<li>使用标准的活细胞染色方法确定微肿瘤中的细胞形态。
	<ol>
		<li>用DMSO配制1 mM的Calcein-AM储备液。分装后于-20 °C保存。</li>
		<li>在所需的培养时间点（1、7和14天），将用PBS（不含Ca/Mg）配制的Calcein-AM溶液加入96孔板中，使终浓度为1 µM。</li>
		<li>在37 °C、5% CO2、湿度充足的培养箱中孵育20分钟，然后使用荧光显微镜在2X、4X和10X下成像（激发：450 - 490 nm带通，发射：515 nm长通，二向色镜：500 nm）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微肿瘤生长/增殖检测
	<ol>
		<li>将MTT粉末溶于PBS（不含Ca/Mg）中，配制12 mM的储备液。经无菌过滤后分装，并于-20 °C保存。</li>
		<li>在所需的培养时间点（1、7和14天），每100 µl培养体积加入20 µl MTT溶液。在组织培养箱中孵育2小时。</li>
		<li>新鲜配制含10% SDS的0.01 M HCl裂解液，并按与培养液体积相等的量加入各孔板中。将密封的孔板在37 °C培养箱中孵育过夜。</li>
		<li>使用多孔板读数仪在570 nm处测定吸光度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于激酶组学分析的微肿瘤制备
	<ol>
		<li>通过将裂解缓冲液预冷至4 °C，然后分别加入1:100比例的100倍蛋白磷酸酶抑制剂（PPI）和100倍蛋白酶抑制剂（PI），配制裂解缓冲液。充分混匀后置于冰上保存。</li>
		<li>将2个微肿瘤转移至三个1.5 ml微量离心管中。去除上清液后，向每管中加入40 µl含有PPI和PI的裂解缓冲液，在4 °C下裂解30分钟。</li>
		<li>剧烈吹打样品以破碎肿瘤微球。在4 °C下以16,000 x g离心10分钟，随后将样品于-80 °C保存，直至进行激酶组学分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 微肿瘤的激酶组学分析
<ol>
	<li>蛋白酪氨酸激酶（PTK）分析
	<ol>
		<li>解冻试剂（10x 蛋白激酶（PK）缓冲液和 2% 牛血清白蛋白（BSA））至 4 °C。加入 PK 缓冲液（将 300 µl 10x PK 缓冲液原液加入 2.7 ml dH₂O 中）2将 O) 置于成型平台位置 #2 的注射器中。</li>
		<li>打开激酶活性检测软件程序，加载PTK协议文件，扫描芯片后在软件中对样品进行注释，然后点击“START”。将芯片放置于分析平台上，每个芯片阵列加入25 µl的2%牛血清白蛋白（BSA），随后点击LOAD，启动由软件控制的封闭步骤。</li>
		<li>将6 µM的100 mM ATP储备液用54 µl dH₂O稀释2O 配制 10 mM 三磷酸腺苷（ATP）。当软件开始 3rd，最后的洗涤步骤（屏幕上可见）将15 µg裂解物用dH2O补至28 µl2O，混匀后加入阵列。</li>
		<li>配制PTK主混合液（MM）（适用于最多12个样本）。加入32.6 µl dH₂O2O，用于重悬二硫苏糖醇（DTT），并向PTK-MM1管（已含有60 µl 10x BSA）中加入6 µl DTT和60 µl 10x PK溶液。</li>
		<li>等待激酶检测软件中出现“Load”提示后，向MM2（已预先分装有4.5 µl PY20 FITC抗体）中加入126 µl PTK-MM1、60 µl PTK添加剂和60 µl 10 mM ATP，并混匀。向每管样本裂解液中加入16 µl上述PTK主混合液，用移液器吹打混匀5次。</li>
		<li>确保盖玻片洁净，然后每个芯片加入 35 µl 裂解液/主混合液，关闭旋转舱盖，按下 LOAD 按钮。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>丝氨酸/苏氨酸激酶（STK）分析：
	<ol>
		<li>将试剂（10× PK缓冲液、10× STK缓冲液和2% BSA）在4 °C解冻。加入PK缓冲液（300 µl至2.7 ml dH₂O中）20）置于注射器位置#1，1:10和STK缓冲液（300 µl加入2.7 ml dH₂O）20）注入注射器位置 #2。</li>
		<li>打开激酶活性检测计算机软件程序，加载 STK 协议文件，扫描芯片后在程序中对样品进行注释，然后点击 START。将芯片放置于分析平台上，每阵列加入 25 µl 的 2% BSA，随后点击 LOAD，启动由软件控制的封闭步骤。</li>
		<li>将6 µM的100 mM ATP用54 µl dH₂O稀释2O. 最终步骤（3rd) 洗涤步骤：将2 µg裂解液混合，并用dH₂O定容至32.6 µl2O，混匀后加入阵列。</li>
		<li>配制STK主混合液：向STK-MM1管（含7 µl 100x BSA）中加入70 µl 10x PK，然后加入42 µl dH₂O2加入 O 至 STK-MM1 管中。</li>
		<li>等待激酶检测软件中出现“Load”提示，然后：向 STK-MM1 中加入 18 µl 10 mM ATP，并向每份样品裂解液中加入 9 µl MM1。充分混匀。</li>
		<li>确保盖玻片洁净，每个芯片加入 35 µl 裂解液/主混合液，关闭旋转舱盖，然后按 LOAD 键。</li>
		<li>在最终阶段（3rd洗涤步骤 向DMAB管（含3.03 µl STK一抗混合物）中加入1.05 µl STK-FITC二抗，加入39.6 µl AB缓冲液至DMAB，加入356.0 µl dH₂O2向DMAB中加入O，每个芯片加入30 µl DMAB，然后按LOAD。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>激酶组学数据分析 19,20
	<ol>
		<li>打开分析软件并加载图像分析应用程序。选择包含带有条形码和时间戳的PTK或STK数据全阵列图像的文件夹，选择与阵列布局文件匹配的文章编号（PTK为86312，STK为87102），并加载先前生成的阵列注释文件。</li>
		<li>验证所有图像的正确网格化，并运行曝光时间比例校正应用程序。对曝光时间/斜率的log2转换值进行统计比较，并使用洗涤前动力学曲线进行验证19-21.</li>
		<li>运行上游激酶预测软件，分析不同条件下变化的激酶组谱，以鉴定上游激酶22,23.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

R.S. 和 R.S.S. 是 Vivo Biosciences 的员工。J.C.A. 部分经费由 UAB Kinome Core 提供。

实验方案中的关键步骤主要涉及微肿瘤的生成以及药物的给药与维持。由于微肿瘤珠较为脆弱且容易破裂，在实验的建立阶段和维持过程中均需格外小心。如果在任一过程中出现错误，可能会干扰实验结果的解读，导致实验周期延长、不必要的重复，甚至数据被排除。
对微肿瘤形成过程的改进与故障排除，包括设计和制备一种用于制备微肿瘤珠的定制疏水工具。该工具可实现更快且更精确的微肿瘤生产。此外，对微肿瘤培养维护过程进行若干微小改进，有助于加快换液和给药操作。这些改进包括但不限于：使用多通道电子移液器从96孔板中移除和更换培养基，预先混合新鲜的药物溶液，并将2倍浓度的溶液按对应顺序排列在2 ml 96孔板中。
在三维建模中，培养条件的主要优化包括确定药物化合物的合适剂量，因为二维建模与三维建模之间的相关性较差。因此，将二维模型体系转化为三维微肿瘤模型时，通常需要进行系列稀释以建立剂量滴定曲线。
在从小鼠体内收获的异种移植瘤细胞生成微肿瘤时，需考虑的潜在问题包括细菌或真菌污染、原代异种移植瘤细胞获取不一致，...

最常见的原发性颅内恶性脑肿瘤是III级星形细胞瘤和IV级多形性胶质母细胞瘤（胶质母细胞瘤或GBM）。目前在美国，针对GBM的治疗手段下，患者的预后较差，中位生存期仅为12至15个月1-3。多模式治疗包括手术、放疗和化疗，后者包含替莫唑胺（TMZ）以及靶向激酶的药物。在GBM中，激酶信号通路常出现异常调控，部分肿瘤表现出表皮生长因子受体（EGFR）的扩增或激活突变，血小板源性生长因子受体（PDGFR）信号增强，磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）活性升高，以及通过血管内皮生长因子受体（VEGFR）介导的促进肿瘤血管生成的信号通路增强，还有其他由激酶驱动的通路异常4-6。现有的体外和体内模型常常无法维持这些具有代表性的分子改变7。此外，基因谱分析尚未带来预期的临床益处，这可能反映出一个事实：基因和表观遗传改变并不总能预测蛋白质活性水平的变化——而大多数激酶靶向药物正是直接作用于该层面，其他作用机制的疗法也可能在此层面间接发挥作用。
传统的永生化细胞系可无限传代，因其易于维护和可重复性，长期以来一直是药物测试的标准模型。然而，该模型存在高营养（且人为）的生长环境，会筛选出快速增殖的细胞，这些细胞与原始肿瘤存在显著差异。因此，人们越来越关注开发更贴近实际的模型系统，以更好地反映患者体内所存在的复杂肿瘤生物学体系。直接从原代肿瘤在小鼠体内生长后建立的肿瘤异种移植模型（&#34;异种传代系，&#34;即患者来源的异种移植模型，PDX）提供了一个更具代表性的模型体系，特别是在癌症治疗领域，因其被认为能更可靠地预测临床疗效。8 尽管该模型的生物学特性更接近真实情况，但其成本高昂，且建立和维持难度较大。此外，这类模型不适用于高通量研究。显然，迫切需要进一步开发能够更准确反映原发肿瘤分子改变的生物学模型，并利用激酶活性的直接检测方法（而非替代性遗传标志物）对这些模型进行分析和测试。
众所周知，与二维（2D）单层培养相比，三维（3D）或多细胞检测模型能够提供更接近生理状态的实验终点指标9-11常见的三维培养方法包括基质包被的微载体和细胞球体形成。肿瘤球体可通过搅拌瓶、聚羟乙基甲基丙烯酸酯（pHEMA）板和悬滴法等细胞聚集技术生成。这些方法的局限性包括：某些细胞无法形成稳定的球体、生长差异性以及在混合细胞类型中存在操作困难。此外，目前已开发出多种用于三维培养研究的合成基质（如水凝胶、聚合物）和动物来源基质（如从小鼠肉瘤中提取的Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）基质、牛胶原蛋白）。12-14小鼠EHS基质被广泛使用，但已知会促进细胞生长和分化 体外 和 体内15.
为了模拟三维肿瘤生物学特性，Raj Singh 博士开发了一种人类生物基质系统 等16. 天然的无生长因子人源生物胶可形成三维培养支架（如小球、圆盘），支持多种细胞类型的长期培养。已建立一系列用于研究肿瘤生长、黏附、血管生成及侵袭特性的三维人源生物胶培养体系。本文总结了人源生物胶相较于常用的小鼠EHS胶的优势与特性。 表1 和 表2.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>来源：</td>
			<td>人类羊膜 （组织混合样本） 
			无病原体，经机构审查委员会豁免或许可</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>细胞外基质特性：</td>
			<td>非变性生物凝胶 （GLP生产）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>关键步骤 
			组件：</td>
			<td>I 型胶原（38%）、层粘连蛋白（22%）、IV 型胶原（20%）、III 型胶原（7%）、entactin &amp;#38; HSPG（&#60; 3%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无生长因子：</td>
			<td>未检测到 EGF、FGF、TGF、VEGF、PDGF（非促血管生成、无毒）</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：人源性生物凝胶与常见EHS凝胶的特性比较。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>人类生物凝胶</td>
			<td>EHS 凝胶</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>天然人体基质</td>
			<td>重建小鼠基质</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>受控细胞生长 &amp;#38; 分化</td>
			<td>可促进细胞生长 &amp;分化</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>生理学基因表达</td>
			<td>基因表达的变异性</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>三维类组织培养模型</td>
			<td>基于培养板的培养模型</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：人源生物凝胶与常见EHS凝胶的比较优势。

<table><tbody><tr><td>胶原酶-I&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CO130</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶EDTA（10倍浓缩液）</td><td>Invitrogen</td><td>15400-054&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A</td><td>Life Technologies</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>N-2 补充剂</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>1× 终浓度</td></tr><tr><td>B-27 补充剂（不含维生素 A）</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td>1x 终浓度</td></tr><tr><td>重组人碱性成纤维细胞生长因子</td><td>Life Technologies</td><td>PHG0266</td><td>最终浓度为 10 ng/ml</td></tr><tr><td>重组人表皮生长因子</td><td>Life Technologies</td><td>PGH0315</td><td>最终浓度为 10 ng/ml</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>康宁 Cellgro Mediatech</td><td>25-005-CI</td><td>终浓度 2 mM</td></tr><tr><td>两性霉素B</td><td>Omega Scientific</td><td>FG-70</td><td>2.5 &amp;micro;g/ml 终浓度</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Omega Scientific</td><td>PS-20</td><td>100 U/ml 青霉素 G，100 &amp;micro;g/ml 链霉素终浓度</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15750-060</td><td>终浓度 50 ng/ml</td></tr><tr><td>MTT</td><td>Life Technologies</td><td>M6494</td><td>用 PBS 配制至 5 mg/ml，经无菌过滤，每孔 1 mg/ml</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher</td><td>BP166</td><td>用于MTT裂解缓冲液，配制为0.01中的10%&amp;nbsp;M HCl，5% 在孔中</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td>A144SI-212</td><td>用于MTT裂解缓冲液，配制至0.01&amp;nbsp;含SDS的M，5 mM，置于孔中</td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Life Technologies</td><td>C1430</td><td>1 mM DMSO 储存液，2&amp;nbsp;&amp;micro;PBS 染色液中的 M，1&amp;nbsp;&amp;micro;孔中最小值</td></tr><tr><td>停止&amp;rsquo;s 蛋白磷酸酶抑制剂混合物&amp;nbsp;</td><td>Pierce ThermoScientific</td><td>78420</td><td>MPER中1:100的比例&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Halt蛋白酶抑制剂&amp;nbsp;</td><td>Pierce ThermoScientific</td><td>87786</td><td>MPER中1:100的比例</td></tr><tr><td>哺乳动物蛋白提取试剂（MPER）</td><td>Pierce ThermoScientific</td><td>PI78501</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Pierce ThermoScientific</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>BP231</td><td>用于溶解钙黄绿素 AM &amp;和化合物</td></tr><tr><td>不含钙/镁的磷酸盐缓冲液</td><td>Lonza</td><td>17-517Q</td><td>用超纯水（MiliQ）稀释至1倍浓度，并经无菌过滤（用于细胞培养）</td></tr><tr><td>含钙/镁的杜尔贝科磷酸盐缓冲液</td><td>康宁 Cellgro Mediatech</td><td>20-030-CV</td><td>用MiliQ超纯水稀释至1x（用于固定前洗涤）</td></tr><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林</td><td>实验方案</td><td>032-060</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Pierce ThermoScientific</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>高密度 Hubiogel</td><td>Vivo Biosciences</td><td>HDHG-5</td><td></td></tr><tr><td>Halt 蛋白磷酸酶抑制剂</td><td>皮尔斯</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>Halt蛋白酶抑制剂</td><td>皮尔斯</td><td>87786</td><td></td></tr><tr><td>哺乳动物蛋白提取试剂（MPER）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>78501</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酪氨酸激酶（PTK）阵列分析芯片</td><td>PamGene</td><td>86312</td><td></td></tr><tr><td>PTK 激酶缓冲液</td><td>PamGene</td><td>36000</td><td>300 &amp;micro;l 10x PK缓冲液原液在2.7&amp;nbsp;毫升去离子水&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，PTK 试剂盒的货号</td></tr><tr><td>ATP</td><td>PamGene</td><td>36000</td><td>PTK试剂盒货号</td></tr><tr><td>PY20-FITC 标记抗体</td><td>PamGene</td><td>36000</td><td>PTK试剂盒货号</td></tr><tr><td>PTK添加剂</td><td>PamGene</td><td>32114</td><td></td></tr><tr><td>PTK-MM1 管（10× BSA）</td><td>PamGene</td><td>36000</td><td>PTK试剂盒货号</td></tr><tr><td>丝氨酸/苏氨酸激酶（STK）阵列分析芯片</td><td>PamGene</td><td>87102</td><td></td></tr><tr><td>STK 激酶缓冲液</td><td>PamGene</td><td>32205</td><td>STK试剂盒的货号</td></tr><tr><td>STK 一抗混合液（DMAB 管）</td><td>PamGene</td><td>32205</td><td>STK试剂盒的货号</td></tr><tr><td>FITC标记的二抗</td><td>PamGene</td><td>32203</td><td></td></tr><tr><td>STK-MM1 管（100 倍 BSA）</td><td>PamGene</td><td>32205</td><td>STK试剂盒的货号</td></tr><tr><td>STK 抗体缓冲液</td><td>PamGene</td><td>32205</td><td>STK试剂盒的货号</td></tr><tr><td>仪器设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#11 刀片，无菌</td><td>Fisher</td><td>3120030</td><td></td></tr><tr><td>#3 手术刀柄，无菌</td><td>Fisher</td><td>08-913-5</td><td></td></tr><tr><td>100 毫米玻璃培养皿</td><td>Fisher</td><td>08-748D</td><td></td></tr><tr><td>半弯止血钳</td><td>Fisher</td><td>12-460-318</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶处理培养瓶</td><td>Fisher</td><td>10-042-12B</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>Fisher</td><td>14-490-200</td><td></td></tr><tr><td>3/4&quot; 搅拌子</td><td>Fisher</td><td>14-512-125</td><td></td></tr><tr><td>B-D 细胞筛&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>#352340</td><td></td></tr><tr><td>B-D 50 ml 离心管</td><td>Fisher</td><td>#352098</td><td></td></tr><tr><td>PamStation 12</td><td>PamGene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioNavigator 6.0 动力学组分析软件&amp;nbsp;</td><td>PamGene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Evolve 激酶活性分析软件</td><td>PamGene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UpKin App 软件（上游激酶预测）</td><td>PamGene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS 组织解离仪</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>旋转式细胞培养系统（RCCS）</td><td>Synthecon</td><td>RCCS-D</td><td>使用10 ml一次性HARV</td></tr></tbody></table>

利用三维人类生物凝胶培养系统和患者来源的胶质母细胞瘤细胞生成微肿瘤用于激酶组学分析和药物反应测试

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

使用患者来源的异种移植瘤模型研究癌症，已在癌症生物学和药物反应性方面提供了重要见解。然而，此类模型耗时较长、成本高昂且劳动密集。为克服这些局限，许多研究团队转而采用癌细胞球状培养模型。尽管该模型具有一定价值，但肿瘤球状体或细胞聚集体无法模拟真实存在的细胞-基质相互作用 体内因此，利用细胞外基质支架的三维（3D）培养方法为研究提供了更为真实的模型系统。该方法始于皮下或颅内异种移植瘤，将肿瘤组织解离为单细胞悬液，类似于肿瘤干细胞神经球。随后将这些细胞嵌入人源性细胞外基质——3D人源生物胶（3D human biogel）中，以生成大量微肿瘤。有趣的是，这些微肿瘤可在高存活率条件下培养约一个月，可用于基于标准细胞毒性检测方法的药物反应测试，如3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）检测，以及Calcein-AM活细胞成像。此外，还可通过免疫组织化学进行分析，或收集用于分子谱型分析，例如基于芯片的高通量激酶组谱型分析，本文亦对此进行了详细描述。因此，三维微肿瘤代表了一种多功能的高通量模型系统，能够更紧密地模拟 体内 肿瘤生物学研究相较于传统方法更具优势。

我们已证明，三维生物凝胶培养系统可支持多种细胞类型的长期生长与功能。在此合作项目中，采用患者来源的胶质母细胞瘤异种移植细胞系（PDX）生成数百个微肿瘤。将细胞解离后（3 × 10⁶）5）或神经球（40–50个）被包埋于生物凝胶微珠（2 mm）中，经快速凝胶化后，在充满NB培养基的定制生物反应器中进行培养。检测细胞活力（Calcein-AM）、生长曲线（MTT）以及基于激酶组活性阵列的分析。PDX微肿瘤保持了多细胞结构和高细胞活力（&gt; 80%) 对于 &gt; 3 周。我们认为这 体内类器官生物学特性的维持依赖于三维细胞-基质结构的完整性（这是二维培养或类球体培养无法实现的）。此外，人们发现，使用脆弱的凝胶状蛋白支架难以生成三维肿瘤，这可能是由于缺乏胶原蛋白I所致。14使用PDX细胞和3D生物凝胶系统进行微肿瘤制备的工作方案总结于 图1 解离过程如图所示 图2.
<p class="jove_content" fo:keep-tog...

利用三维人类生物凝胶培养系统，可将多形性胶质母细胞瘤的患者来源异种移植瘤微型化为活体微肿瘤。这种模拟体内环境的三维肿瘤检测方法适用于药物反应测试和分子谱型分析，包括激酶组学分析。

使用患者来源的异种移植模型研究癌症，为了解癌症生物学特性及药物反应性提供了重要见解。然而，它们存在……

本患者来源的胶质母细胞瘤三维微肿瘤培养系统的主要目标是实现高通量药物筛选，并可与相应的分子谱型分析方法（如激酶组学检测）相结合。该方法有助于回答肿瘤研究领域中的关键问题，例如：为何某种治疗方案对一位患者的肿瘤有效，而对另一位患者却无效？该技术的主要优势在于提供了一种微型但高度模拟真实肿瘤的培养体系，适用于治疗方案的测试。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为患者来源的异种移植细胞的处理方式不同于长期建立的、永生化的肿瘤细胞系。这主要是由于前者较为脆弱，且对培养条件的变化非常敏感。对该方法进行可视化演示至关重要，因为微肿瘤的生成步骤具有独特的复杂制备方式，仅通过文字描述难以掌握。由本实验室的高级技术员兼实验室主管凯瑟琳·兰福德（Catherine Langford）演示肿瘤解离操作。由本实验室技术员瑞秋·谢文（Rachael Shevin）演示微肿瘤生成及药物处理操作。使用镊子进行钝性解剖，轻柔地将肿瘤组织从腹膜壁和皮肤上分离，并将肿瘤组织转移至无菌玻璃培养皿中。然后，使用带有11号刀片的无菌解剖刀和无菌半弯镊子，清除肿瘤组织中的坏死组织及膜状宿主结缔组织。用无菌RPMI溶液将清洗后的肿瘤组织洗涤3至5次，以去除多余的血液，每次冲洗之间轻轻倾斜培养皿以移除洗涤液。最后一次洗涤后，使用两把11号刀片将肿瘤组织仔细切碎。然后，使用无菌半弯镊子将肿瘤转移至含有酶溶液的消化管中。将该管放入细胞解离仪，并选择“Tumor 2”程序，点击“Start”运行解离仪，持续37秒。然后将试管转移至旋转仪，并将旋转仪放入37摄氏度培养箱中孵育40分钟。孵育结束后，将试管重新放回解离仪，运行Tumor 3程序37秒。程序结束后，离心细胞，并用10毫升无血清RPMI培养基轻轻混悬沉淀。接下来，将细胞缓慢加载到置于新50毫升离心管上的40微米细胞筛中，依靠重力使悬液自然滴滤通过滤膜。每次加入新的细胞时，轻轻抬起细胞筛的标签部分，打破细胞筛与离心管之间的负压，以使悬浮细胞自由通过筛网。当所有细胞均完成过滤后，离心收集单细胞悬液，并将沉淀重悬于10毫升完全Neurobasal培养基中。然后，通过台盼蓝排斥法确定活细胞数量，并将细胞置于冰上。为生成微肿瘤，离心分离所得的患者来源胶质母细胞瘤异种移植细胞系，然后将细胞沉淀重悬于每2 µL胎牛血清（FBS）含50,000个细胞的溶液中。接着，将细胞以1:4的细胞与基质胶比例，稀释于冰上预冷的高密度人源基质胶中。然后，使用电子多通道移液器将每种细胞混合物各10 µL分配至带有疏水涂层的96针钢板上的每个针位。在混合细胞、培养基和生物凝胶时，必须避免产生气泡，同时仍需快速高效地操作，以便在人源生物凝胶开始于针上凝固之前完成微肿瘤的制备。当所有微肿瘤接种完毕后，将3D肿瘤转移至组织培养孵育箱中，孵育20分钟，使肿瘤微球完成凝胶化。孵育结束后，将微肿瘤转移至含有完全Neurobasal培养基的10厘米培养皿中，并将肿瘤放回培养箱。1至2天后，使用宽口移液管将微肿瘤转移至96孔培养板的各孔中，每孔含50微升Neurobasal培养基，并向每孔加入50微升相应的给药溶液。将处理后的微肿瘤在组织培养箱中维持培养1至14天，每周两次更换新鲜培养基和药物溶液。为了评估微肿瘤细胞的形态，在培养的第一天、第七天和第十四天，将微肿瘤在组织培养孵育箱中用每孔1 µM新鲜稀释的Calcein-AM标记20分钟。随后，在荧光显微镜下以2倍、4倍和10倍放大倍数对肿瘤进行成像。为了评估微肿瘤的生长情况，在培养的第一天、第七天和第十四天，将培养物在组织培养孵育箱中用20 µL新鲜配制的MTT处理2小时。孵育结束后，用新鲜配制的10% SDS裂解缓冲液按照与培养孔体积1:1的比例裂解肿瘤，并密封培养板。然后将微肿瘤在裂解缓冲液中于37摄氏度孵育过夜，次日早晨使用多孔板读板仪在570纳米处测定吸光度。通过如上所述的活细胞成像Calcein-AM染色，可评估微肿瘤的细胞生长与活力，以及药物治疗对这些功能的影响。如所观察到的，未经处理的微肿瘤以及对实验药物治疗具有已知耐药性的微肿瘤在为期两周的培养期间表现出持续生长的模式。然而，这些对TMZ敏感的肿瘤细胞在培养结束时，经MTT检测显示，对TMZ最高浓度处理产生了细胞生长抑制。有趣的是，在10微摩尔TMZ处理后，对TMZ耐药的微肿瘤中激酶信号通路显示出多个肽段的信号强度发生显著变化。事实上，在本代表性实验中，利用上游激酶预测软件分析这些改变的激酶组谱，发现SYK、LCK和CTK酪氨酸激酶以及多种丝氨酸/苏氨酸激酶活性发生了特异性改变，提示可能存在新的潜在治疗靶点，有助于克服肿瘤治疗耐药性。一旦掌握，若操作得当，肿瘤解离可在两小时内完成。若操作得当，微肿瘤生成与药物处理技术总计可在三小时内完成。未来，该模型系统可被用作一种先证者风格的虚拟系统，通过将患者的肿瘤与现有的患者来源微肿瘤文库进行分子匹配，为临床医生提供最佳治疗方案的选择依据。

generation-microtumors-using-3d-human-biogel-culture-system-patient

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

Microtumors使用3D人体Biogel培养体系和病人源性胶质母细胞瘤的Kinomic剖析和药物反应测试的生成

在本视频中，我们利用三维人类生物凝胶将患者来源的肿瘤细胞生成微肿瘤。这些微肿瘤高度模拟体内肿瘤微环境，可作为潜在的药物测试平台。...

微肿瘤的生成：一种用于培养三维微肿瘤以分析药物处理反应的体外培养技术

采用无血清神经球培养基对分离的高级别胶质瘤手术标本进行传代培养，以富集具有肿瘤干细胞表型的细胞。对于无法形成神经球的标本，提供了一种替代性实验方案。同时介绍了保持神经球三维结构的石蜡包埋技术，用于免疫细胞化学分析。...

优化高级别胶质瘤手术标本的细胞培养，用于临床相关动物模型及三维免疫化学分析

以三维培养方式生长的神经球是研究胶质瘤生物学的有力工具。本文介绍了一种在通过石蜡包埋保持胶质瘤神经球三维结构的前提下进行免疫组织化学分析的实验方案。该方法可用于表征胶质瘤神经球的特性，如干性及神经分化能力。...

通过石蜡包埋的三维胶质瘤神经球培养物免疫组织化学评估胶质瘤生物标志物

本文介绍了一种易于使用的胶质母细胞瘤侵袭实验方法。该实验适用于胶质母细胞瘤干细胞样细胞。同时介绍了一种用于便捷定量分析侵袭、迁移和增殖的Fiji宏工具。...

一种用于胶质母细胞瘤的三维球状模型

在此，我们描述了一种从原代患者样本或患者来源的细胞培养物中生成胶质母细胞瘤（GBM）类器官并将其培养至成熟的方法。这些GBM类器官包含表型多样化的细胞群体，并可重建肿瘤微环境 离体.

维持人胶质母细胞瘤的细胞多样性 离体 使用三维类器官培养

本实验方案描述了一种用于评估机械和生化信号对患者来源的胶质母细胞瘤细胞在三维基质模拟培养中化疗反应影响的实验平台，该平台采用定制的紫外光照装置，可实现具有可调机械特性的水凝胶的高通量光交联。...

水凝胶阵列可提高三维肿瘤模型中基质组分与治疗药物筛选的通量

本文概述了一种全面的实验方案，用于生成和利用实验室工程化胶质母细胞瘤类器官（LEGO），以研究基因型与表型之间的依赖关系，并筛选潜在的胶质母细胞瘤治疗药物。...

实验室构建的胶质母细胞瘤类器官培养与药物筛选

本研究建立了一个代谢谱分析平台，该平台整合了三维（3D）胶质瘤类球体与基于细胞外通量分析的成像标准化方法。该方法可更准确地评估肿瘤对药物治疗的代谢反应，并有助于揭示潜在的耐药机制。...

三维脑肿瘤类球体药物筛选中的代谢谱分析进展

我们介绍一种利用新诊断和复发性肿瘤患者来源的磁性胶质瘤球体构建的三维胶质母细胞瘤迁移模型。该平台可实现对患者特异性迁移动态的可视化，并可用于评估治疗效果。在迁移完成后，该检测方法还可进行多重分析，以评估蛋白质的定位和表达模式。...

可重复的缺氧条件下磁性纳米颗粒介导类球体定位的三维胶质母细胞瘤迁移实验

本视频方案演示了如何应用荧光染料羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）根据细胞分裂频率来鉴定和分离人胶质母细胞瘤中的不同细胞亚群。...

利用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）鉴定和分离人胶质母细胞瘤中的慢分裂细胞

学习使用3D人体生物凝胶培养体系生成胶质母细胞瘤微肿瘤，并进行激酶组分析和高通量药物反应测试。该方法为个性化癌症治疗研究提供了微型且真实的肿瘤培养平台。

利用三维人类生物凝胶培养系统和患者来源的胶质母细胞瘤细胞生成微肿瘤用于激酶组学分析和药物反应测试

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