Name: 生物发光成像检测到非洲锥虫病的晚期感染 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 了解如何使用生物发光成像技术在小鼠体内实时追踪非洲锥虫感染，从血液阶段到晚期脑部感染。该方法将药物评估时间从180天缩短至90天，为开发新型治疗策略提供重要依据。

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我们感谢约翰·凯利（John Kelly）和马丁·泰勒（Martin Taylor）（伦敦卫生与热带医学院） &amp;#38; 热带医学）提供 T. b. brucei GVR35-VSL-2 以及伦敦卫生与热带医学院的 Andrea Zelmer 博士提供的建议 体内 成像。本研究由比尔及梅琳达·盖茨基金会全球健康项目（资助编号 OPPGH5337）资助。

伦理学 
所有工作均在英国国内事务部《1986年动物（科学程序）法》以及伦敦卫生与热带医学院动物实验伦理委员会的批准下进行。 &amp;#38；热带医学动物福利与伦理审查委员会。本报告遵循ARRIVE指南。
1. 活体内 发光布氏布氏锥虫的传代
<ol>
	<li>移除一份冷冻保存的菌种储备液（称为稳定剂） T. b. brucei 菌株 GVR35-VSL-2（可向伦敦卫生与热带医学院的 John Kelly 教授索取） &amp;#38; 通过 MTA 获取热带医学相关材料)9 从液氮中取出并恢复至室温。将稳定剂稀释至 2 x 104 布氏锥虫/ml，置于无菌磷酸盐缓冲葡萄糖盐水（PBS-G）pH 8.0（1 L PBS + 15 g葡萄糖）中10. 
	注意： T. b. brucei GVR35-VSL-2 对人类无感染性，但实验需在具备 SAPO 许可资质的设施中进行。</li>
	<li>通过腹腔注射（i.p.）途径，使用25 G针头向一只20–25 g的雌性CD1小鼠注射0.2 ml稀释的锥虫。这是 &#34;供体小鼠&#34;将感染的小鼠放入特定病原体阴性（SPF）笼具中饲养 随意摄取. 
	注意：CD1小鼠为远交系品系 T. b. brucei GVR35 感染在此品系中已有明确表征。然而，本方案同样适用于近交系或基因修饰品系，但需注意毛色可能影响成像的敏感性6,9.</li>
	<li>通过采血监测外周血寄生虫血症。将小鼠放入塑料固定器中，用21 G针头穿刺尾静脉或行尾静脉切开，采集5 µl血液，与0.85%无菌氯化铵按1:10比例混合，以裂解红细胞，便于计数。</li>
	<li>在改良纽鲍尔血细胞计数板中计数稀释后的血液
	<ol>
		<li>将稀释后的血液加入两个计数室中。计数其中一个计数室的整个中央方格区域，以获得 n 锥虫。血液中锥虫浓度 = n ×104 每毫升锥虫数，校正任何稀释因子，并计算两个计数室的平均值。 
		注意：感染后约5-7天，外周血寄生虫血症应上升至足够水平，可进行浓度为2 x 104 锥虫/毫升</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当锥虫水平达到所需小鼠数量的足够浓度时，进入步骤 1.6。寄生虫血症水平为 6 x 104 每毫升含锥虫数足以感染10只小鼠的供体小鼠。 
	注：对于具有统计学意义的组样本量， n 每种处理组的小鼠需要6只8对于其他感染模型，需要应用功效计算来确定合适的组大小。</li>
	<li>将小鼠放入热箱（28–30 °C，约5–10分钟），使尾静脉扩张。为诱导终末麻醉，使用25 G针头经静脉注射戊巴比妥钠20 mg/kg。轻压小鼠足垫以确认无缩足反射，确保小鼠已处于麻醉状态。</li>
	<li>用1 ml注射器连接21 G针头，吸取5,000 USP单位/ml的肝素溶液5 ml至Bijou管中，反复抽吸针头两次，以肝素化针头。</li>
	<li>取肝素化的21 G针头和1 ml注射器，对麻醉的小鼠进行心脏穿刺，将针头从肋骨下方中央位置插入（可见血液在针尖处聚集），轻轻回抽活塞，避免心脏腔室塌陷。采集至少0.7 ml血液。</li>
	<li>将感染血液稀释，制备成浓度为 2 x 10 的接种物4 PBS-G（pH 8.0）中的锥虫数/ml，操作同上文步骤1.1。 
	注意：此时可将剩余血液与8%甘油、20%热灭活胎牛血清（hi-FCS）和72%感染血混合，制备稳定化冻存液。使用慢速冷冻容器在-80 °C缓慢冷冻，使降温速率达到-1 °C/min，随后转移至液氮中保存。</li>
</ol>
2. 实验小鼠的感染
<ol>
	<li>将 CD1 雌性小鼠（约 21–25 g）放入加热箱中，轻柔加温以扩张静脉。将已加温的小鼠置于塑料固定装置中，使用 25 G 针头经尾静脉注射 0.2 ml 稀释后的接种物，相当于每只小鼠接种 4,000 个锥虫。注射后对注射部位施加压力以止血。 
	注意：腹腔感染是一种有效的感染途径，已在先前的研究中使用10，但我们发现其可重复性低于静脉注射途径。</li>
	<li>将感染的小鼠随机分组，并以每笼 3 只的方式饲养于 SPF 通风笼具中。作为对照，向 CD1 雌性小鼠注射野生型非生物发光寄生虫 T. b. brucei GVR35（n = 3）。</li>
	<li>通过血涂片显微镜检查监测感染情况
	<ol>
		<li>从穿刺或切开的静脉取 5 µl 血液滴加于玻片上，制备血涂片（用另一张玻片轻轻推动血滴，使其在玻片上均匀展开形成薄层）。让玻片自然风干。</li>
		<li>用 100% 甲醇固定血涂片，吉姆萨染色 10 分钟，随后用 dH2O 冲洗并自然风干。在 100 倍物镜下计数 10 个视野（f.o.v.）中的锥虫数量。 
		注意：血涂片检查可与活体非侵入性成像同时进行，最早可在感染后第 1 天开始。在处理多只动物时，该锥虫定量方法优于血细胞计数板计数，因为样本可在室温下保存，后续再进行计数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 利用生物发光成像追踪感染
注意：为了监测感染情况，可采用全动物非侵入性成像技术。
<ol>
	<li>在杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中配制D-荧光素（萤火虫荧光素酶底物）的储存液，浓度为30 mg/ml。过滤除菌后分装，于-20 °C保存。 
	注意：D-荧光素对光敏感，因此需用铝箔包裹分装管以避光。避免反复冻融荧光素，以免影响其活性11。</li>
	<li>将一份D-荧光素解冻至室温。将每只小鼠（包括感染非生物发光野生型寄生虫株的对照小鼠）从笼中取出，使用25 G针头经腹腔注射150 mg/kg的预温D-荧光素（用DPBS稀释）。将小鼠放入异氟烷麻醉舱中，以2.5 L/min流速通入2%异氟烷/O2混合气体，麻醉约5分钟。 
	注意：小鼠在麻醉状态下会失去活动能力。本实验所用成像仪一次可处理3只小鼠。若小鼠麻醉时间超过30分钟，可涂抹眼用人工泪膏以防止角膜干燥。</li>
	<li>对于本实验所用的成像仪，请打开软件并按照制造商说明初始化设备。待相机和加热板达到设定温度后开始采集图像。 
	注意：该仪器通常保持开机状态，以便夜间自动执行背景校准。若必须重启，则需先运行校准检测程序。</li>
	<li>将麻醉后的小鼠放入成像仪中（见步骤3.5）。在小鼠之间使用大型黑色隔板，以最大限度减少强生物发光信号的串扰。采用一系列曝光时间（1、3、10、30、60和180秒），中等binning模式，光圈f/stop为1，滤光片设为开放，视野设为E（12.5 x 12.5 cm2）进行成像。 
	注意：感染非生物发光野生型GVR35寄生虫的对照小鼠可提供背景生物发光值。根据本模型的荧光素动力学实验（图6），生物发光信号在给药后10分钟达到峰值，3只小鼠的成像过程约需5分钟。在麻醉和成像过程中应考虑此时间尺度。</li>
	<li>为确保对小鼠进行全面成像，需旋转小鼠以获取腹侧、背侧和侧位图像。在连续动物成像时，应保持一致的体位顺序。</li>
	<li>成像完成后，在观察下让小鼠从麻醉中恢复，然后放回SPF级饲养笼中。</li>
	<li>自感染后第7天起，每隔7天进行一次成像，直至第21天。在整个动物体表应观察到生物发光信号持续增强。</li>
	<li>在第21天（D21），按上述方法进行成像和血涂片检查，并以40 mg/kg剂量经腹腔注射二脒腙乙酸盐。该药物可清除外周血中的寄生虫，但无法穿透血脑屏障，因此有助于更清晰地观察中枢神经系统（CNS）感染情况。 
	注意：二脒腙乙酸盐是一种广泛使用的药物，用于治疗动物早期锥虫病。</li>
	<li>继续在第28天（D28）和第35天（D35）进行成像和监测。</li>
</ol>
4. 确认中枢神经系统感染
<ol>
	<li>在第35天（D35），按照上述步骤（3.1–3.4）对小鼠进行成像。</li>
	<li>成像后，让小鼠从麻醉中恢复，并按照步骤1.6–1.8所述进行放血，收集血液用于进一步分析。</li>
	<li>心脏穿刺后，通过心脏灌注20 ml PBS（可选：在灌注液中加入3 mg/ml荧光素酶底物），以清除器官中的血液，并重新引入可能在步骤4.1的时间间隔内从脑区清除的荧光素酶标记物。</li>
	<li>使用弯头剪刀从颅底开始沿颅骨周缘剪开，取下颅骨顶部，再用弯头镊子轻柔地将脑组织取出。</li>
	<li>将切除的脑组织置于一段黑色塑料片上，在成像前滴加50 µl浓度为15 mg/ml的荧光素酶底物，确保向切除的脑组织中添加了足量的底物。使用上述设置进行成像，以显示感染在脑半球的定位。 
	注意：可采用qPCR方法对切除脑组织中的寄生虫血症进行后续定量分析8。其他可能的后续应用还包括组织学或免疫组织化学检测，用于在固定脑组织后鉴定脑组织中的寄生虫。</li>
</ol>
5. 生物发光成像的定量分析
注意：可使用成像软件中的感兴趣区域（ROI）对生物发光进行定量，并校正背景生物发光。
<ol>
	<li>使用 ROI 工具创建一个矩形 ROI，用于全动物定量，并将其放置在小鼠图像上，覆盖从鼻尖到尾基部的区域。对每只动物和每个时间点均使用相同尺寸的矩形。观察脑部 ROI 时，以相同方式使用圆形 ROI，将其定位在图像中小鼠头部区域。</li>
	<li>如有需要，可调整图像以在同一光谱范围内显示，以便直观呈现感染情况。 
	注意：此处使用的软件会自动为每幅图像生成颜色图，其最小值和最大值根据光子计数进行调整。为了实现一系列图像之间的视觉比较，必须将所有图像的颜色标尺设置为相同的数值。
	<ol>
		<li>选择生物发光信号最强的图像，利用工具面板上的“图像调整”选项卡，选择对数标尺以及合适的颜色标尺最小值和最大值（需通过实验确定）。将此标尺应用于整个实验中的所有图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Brun, R., Blum, J., Chappuis, F., Burri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis.</a> Lancet. 375 (9709), 148-159 (2010).</li>
<li>Rodgers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosomiasis+and+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Trypanosomiasis and the brain.</a> Parasitology. 137 (14), 1995-2006 (2010).</li>
<li>Barrett, M. P., Boykin, D. W., Brun, R., Tidwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis%3A+pharmacological+re-engagement+with+a+neglected+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis: pharmacological re-engagement with a neglected disease.</a> Br. J. Pharmacol. 152 (8), 1155-1171 (2007).</li>
<li>Barrett, M. P., Vincent, I. M., Burchmore, R. J. S., Kazibwe, A. J. N., Matovu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+resistance+in+human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Drug resistance in human African trypanosomiasis.</a> Future Microbiol. 6 (9), 1037-1047 (2011).</li>
<li>Jennings, F. W., Whitelaw, D. D., Urquhart, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+duration+of+infection+with+Trypanosoma+brucei+in+mice+and+the+efficacy+of+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">The relationship between duration of infection with Trypanosoma brucei in mice and the efficacy of chemotherapy.</a> Parasitology. 75 (2), 143-153 (1977).</li>
<li>Andreu, N., Zelmer, A., Wiles, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+biophotonic+imaging+for+studies+of+infectious+disease%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Noninvasive biophotonic imaging for studies of infectious disease.</a> FEMS Microbiol. Rev. 35 (2), 360-394 (2011).</li>
<li>Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Am.+Thorac.+Soc%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging.</a> Proc. Am. Thorac. Soc. 2 (6), 537-540 (2005).</li>
<li>Burrell-Saward, H., Rodgers, J., Bradley, B., Croft, S. L., Ward, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+and+reproducible+in+vivo+imaging+mouse+model+for+evaluation+of+drugs+against+late-stage+human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">A sensitive and reproducible in vivo imaging mouse model for evaluation of drugs against late-stage human African trypanosomiasis.</a> J. Antimicrob. Chemother. 70 (2), 510-517 (2015).</li>
<li>McLatchie, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+in+vivo+imaging+of+Trypanosoma+brucei+expressing+%27red-shifted%27+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl.+Trop.+Dis%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing 'red-shifted' luciferase.</a> PLoS Negl. Trop. Dis. 7 (11), e2571(2013).</li>
<li>Jennings, F. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+African+trypanosomiasis%3A+potential+therapeutic+benefits+of+an+alternative+suramin+and+melarsoprol+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Int%22%5BJournal%5D)">Human African trypanosomiasis: potential therapeutic benefits of an alternative suramin and melarsoprol regimen.</a> Parasitol. Int. 51 (4), 381-388 (2002).</li>
<li>Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+monitoring+of+in+vivo+colonization+and+clearance+dynamics+by+light-emitting+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria.</a> Methods Mol. Biol. 574, 137-153 (2009).</li>
<li>Rodgers, J., Bradley, B., Kennedy, P. G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+chemotherapy+with+a+substance+P+receptor+antagonist+%28aprepitant%29+and+melarsoprol+in+a+mouse+model+of+human+African+trypanosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol.+Int%22%5BJournal%5D)">Combination chemotherapy with a substance P receptor antagonist (aprepitant) and melarsoprol in a mouse model of human African trypanosomiasis.</a> Parasitol. Int. 56 (4), 321-324 (2007).</li>
<li>Kamerkar, S., Davis, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+on+the+brain%3A+understanding+host-pathogen+interactions+in+chronic+CNS+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol.+Res%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma on the brain: understanding host-pathogen interactions in chronic CNS infection.</a> J. Parasitol. Res. 2012, 589295(2012).</li>
<li>Franke-Fayard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+malaria+parasite+sequestration%3A+CD36+is+the+major+receptor%2C+but+cerebral+pathology+is+unlinked+to+sequestration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (32), 11468-11473 (2005).</li>
<li>Hitziger, N., Dellacasa, I., Albiger, B., Barragan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+of+Toxoplasma+gondii+to+immunoprivileged+organs+and+role+of+Toll%2Finterleukin-1+receptor+signalling+for+host+resistance+assessed+by+in+vivo+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dissemination of Toxoplasma gondii to immunoprivileged organs and role of Toll/interleukin-1 receptor signalling for host resistance assessed by in vivo bioluminescence imaging.</a> Cell. Microbiol. 7 (6), 837-848 (2005).</li>
<li>Lewis, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+of+chronic+Trypanosoma+cruzi+infections+reveals+tissue-specific+parasite+dynamics+and+heart+disease+in+the+absence+of+locally+persistent+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging of chronic Trypanosoma cruzi infections reveals tissue-specific parasite dynamics and heart disease in the absence of locally persistent infection.</a> Cell. Microbiol. 16 (9), 1285-1300 (2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

生物发光型 T. b. brucei GVR35 菌株的建立使得从早期到晚期全程可视化锥虫感染成为可能。以往的感染模型无法实时检测晚期阶段（即寄生虫已进入脑部）的感染情况，必须通过处死感染小鼠并取出脑组织来确定寄生虫负荷12。生物发光技术降低了个体小鼠间的差异，因为可对同一只小鼠在整个感染过程中进行连续追踪，并在任何阶段快速进行定性评估。生物发光成像具有高度敏感性，能够比血涂片显微镜检查更早地发现低水平感染，成像技术可检测到低至100个锥虫，而显微镜检查的检测下限为每毫升5 × 103个锥虫9。此外，通过全程追踪同一批动物，无需为每个时间点设置独立的动物组，从而显著减少了实验动物的使用量。
此处所述的成像方案可根据科学需求进行调整，由于其具有非侵入性，因此可以在获得适当动物伦理批准的前提下，进行更多次和更频繁的成像；但针对脑部感染的评估，第21天（D21）是最小时间点。此时，早期阶段药物已无法有效清除晚期阶段的寄生虫。同时，必须确保小鼠在每个时间点均在相同条件下进行成像。例如，应使用相同的曝光时间以...

人类非洲锥虫病（HAT），又称昏睡病，是由通过媒介传播的Trypanosoma brucei种属原生动物寄生虫引起的1。目前每年估计病例数少于7000例，但非洲大陆约有7000万人面临感染该寄生虫的风险。该疾病若未经治疗，通常具有致命性，其病程包括早期血液淋巴系统阶段，此时寄生虫存在于血液中；随后进展至晚期阶段，寄生虫侵入中枢神经系统（CNS），此时对早期阶段使用的抗锥虫药物不再敏感2。目前针对晚期HAT的药物治疗方案复杂且疗程漫长，同时伴随严重不良反应，并已有耐药性报道，因此开发新型药物疗法的研究至关重要3,4。
在传统小鼠模型中研究晚期人类非洲锥虫病（HAT）耗时且复杂，需切除脑组织以监测寄生虫负荷5。动物感染株 T. b. brucei 被用作锥虫病的研究模型，其晚期阶段出现在感染后21天（dpi）。为了监测小鼠模型中野生型非生物发光寄生虫的感染情况，仅能通过外周血涂片或定量PCR来确定寄生虫负荷。对于脑内的寄生虫负荷，必须处死小鼠、取出脑组织，并对组织进行qPCR检测，这使得无法在晚期感染过程中多个时间点连续追踪寄生虫。因此，难以实现在中枢神经系统（CNS）内对感染过程的实时动态观察。
体内 生物发光成像（BLI）可在小鼠模型中高度灵敏、无创地检测寄生虫扩散和疾病进展过程，并可在单个动物体内对整个实验周期进行连续追踪6生物发光成像基于荧光素酶催化反应产生的可见光光谱中的光发射。所发射的光子随后由电荷耦合器件（CCD）相机检测。7为此，需对病原体进行基因改造以表达荧光素酶蛋白，并通过注射在感兴趣的时间点引入底物荧光素。该方法的主要优势在于能够开展纵向研究，同一动物可多次成像且不良影响极小。所获得的生物发光信号可被定量，从而反映病原体负荷量。
红移生物发光的优化与验证 T. b. brucei 使得通过非侵入性手段研究晚期感染成为可能，相较于血涂片显微镜检测能更早发现寄生虫，显著缩短研究时间、降低成本，并减少晚期锥虫病中枢神经系统感染研究和药物筛选所需的实验动物数量8,9在本方案中，我们演示了用生物发光的锥虫感染小鼠的方法，以及随后如何对寄生虫进行成像观察 体内 用于量化疾病进展和中枢神经系统穿透性。

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Sigma，英国</td><td>P4417</td><td>pH 7.4 的片剂</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma，英国</td><td>G8270</td><td>99.5%（分子级）</td></tr><tr><td>氯化铵</td><td>Sigma，英国</td><td>A9434</td><td>99.5%（分子级）</td></tr><tr><td>肝素（锂盐）</td><td>Sigma，英国</td><td>H0878</td><td></td></tr><tr><td>Hi-FCS</td><td>Gibco，Life Technologies，英国</td><td>10500-064</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Sigma，英国</td><td>D4031</td><td>无菌过滤</td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Nalgene，英国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>吉姆萨染液</td><td>Sigma，英国</td><td>G5637</td><td></td></tr><tr><td>D-荧光素</td><td>Perkin Elmer，英国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma，英国</td><td>115144-35-9</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二脒那嗪乙酸盐</td><td>Sigma，英国</td><td>D7770</td><td>分析纯</td></tr><tr><td>IVIS Lumina II</td><td>Perkin Elmer，英国</td><td></td><td>其他生物成像仪也可使用 &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Bruker、Kodak 的产品</td></tr><tr><td>Living Image v. 4.2</td><td>Perkin Elmer，英国</td><td></td><td>Perkin Elmer IVIS 仪器的专有软件；其他仪器可能配备各自的软件</td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>Fisher Scientific，英国</td><td>10142104</td><td></td></tr><tr><td>20 ml 注射器</td><td>Fisher Scientific，英国</td><td>10743785</td><td></td></tr><tr><td>25 G 针头</td><td>Greiner Bio-one</td><td>N2516</td><td></td></tr><tr><td>21 G 针头</td><td>Greiner Bio-one</td><td>N2138</td><td></td></tr><tr><td>双面磨砂载玻片</td><td>VWR，英国</td><td>631-0117</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>StarLab，英国</td><td>I1415-1000</td><td></td></tr><tr><td>7 ml Bijou 管</td><td>StarLab，英国</td><td>E1412-0710</td><td></td></tr><tr><td>小鼠固定器</td><td>Sigma，英国</td><td>Z756903</td><td>我们的固定器为自制，此为类似型号</td></tr></tbody></table>

利用生物发光成像检测非洲锥虫病晚期感染

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

人类非洲锥虫病（HAT）是一种多阶段疾病，表现为两个阶段：早期血液阶段和晚期阶段，后者指寄生虫侵入中枢神经系统（CNS）的阶段。In vivo 对晚期阶段的研究受到限制，因为传统方法需要切除脑组织以确定寄生虫的存在。
生物发光成像是一种非侵入性、高灵敏度的光学成像技术，可实现对转染荧光素酶的病原体进行实时可视化观察。通过使用一种经转染且能够在小鼠体内引发晚期疾病阶段的锥虫株，我们能够在单个动物体内全程研究中枢神经系统感染的动力学过程，同时观察系统性感染中病原体的移动与播散情况。
本文介绍了一种利用非洲锥虫病生物发光模型研究中枢神经系统感染的可靠方案，可实现无创实时观察，并可结合可选的后续分析方法进行进一步研究。

本方案展示了如何通过感染小鼠T. b. brucei（人非洲锥虫病的动物模型）后追踪疾病进展。图1展示了实验方案的时间线，说明了治疗和成像步骤的时间安排。图2展示了一个典型的固定后吉姆萨染色血涂片视野，用于定量外周血中的寄生虫血症，其中可见锥虫和红细胞。可通过检测生物发光信号来追踪动物体内感染的发展情况，如图3所示，该图展示了同一实验过程中同一批动物在各个时间点的成像结果。在感染过程中，前21天内所有动物的生物发光信号均逐渐增强且分布更广，在脾脏区域出现高强度的BLI信号（热图尺度中以红色表示）。在第21天（D21），根据图1所述方案，在成像后给予二脒腙乙酸盐治疗，至第28天（D28）时可见生物发光信号下降，表明外周感染已被清除，仅在小鼠头部区域残留低水平信号。至第35天（D35），信号仍持续存在于头部区域且强度增加，提示可能存在脑部感染。随后取出脑组织以确认生物发光信号确实存在于脑组织内，并可通过qPCR进行定量分析。...

本文描述了利用一种生物发光的非洲锥虫株系来追踪晚期感染，并展示了如何 体内 活体成像可用于实时观察中枢神经系统内的感染过程。

人类非洲锥虫病（HAT）是一种多阶段疾病，表现为两个阶段：早期血液阶段和晚期阶段，后者指寄生虫侵入中枢神经系统时的阶段。

本方案的总体目标是利用活体实时成像技术，追踪小鼠体内锥虫感染的实时动态过程，直观呈现从早期血液感染到晚期脑部感染的各个阶段，模拟临床昏睡病的进展过程。该方法有助于解答锥虫生物学领域的关键问题，识别潜在的新型治疗手段，并评估其抗感染疗效。该技术的主要优势在于，药物评价周期可缩短至90天，而此前的传统模型则需要180天。该方案可用于研究人类非洲锥虫病，同时也适用于其他传染病模型，例如结核病或恰加斯病。首先将体重为21至25克的雌性CD1小鼠放入加热箱中，以扩张尾静脉。然后将加热后的小鼠单独放入塑料固定装置中，使用25号针头将0.2毫升稀释后的布氏锥虫GVR35VSL2接种液经尾静脉注射，注射后立即对注射部位施加压力以止血。通过血涂片显微镜检查监测感染时，取5 µL血液点样于载玻片上。用另一张载玻片轻轻将血滴在第一张载玻片上推开，形成一层薄血膜。让载玻片自然风干，随后用100%甲醇固定血液，再置于吉姆萨染液中染色10分钟。孵育结束后，用蒸馏水冲洗载玻片并使其自然晾干。然后，在100倍物镜下观察10个视野，计数每个视野中的锥虫数量。为通过生物发光成像追踪感染情况，将D-荧光素的一份 aliquot 恢复至室温。然后，使用25号针头为每只动物腹腔注射150毫克/千克的预热荧光素。接下来，根据制造商的说明，使用成像软件启动仪器。当相机和加热板达到适当温度后，在麻醉的动物之间放置较大的黑色隔板，以最大限度减少强生物发光信号的串扰。使用中等 binning 模式、一档光圈、滤光片打开以及 12.5 厘米 × 12.5 厘米的视野 E，对小鼠进行一系列不同曝光时间的成像。为确保对小鼠进行全面成像，旋转动物以获取腹侧、背侧和侧面视图。在第 21 天，按照示范进行小鼠成像和血涂片检查。然后，以40毫克/千克剂量通过腹腔注射给予动物二脒嗪乙酸盐，以清除外周血寄生虫血症。在第35天对动物进行成像后，将切除的脑组织置于一片黑色塑料片上，并用移液器滴加50微升浓度为15毫克/毫升的荧光素酶底物溶液至组织表面。随后，使用与整体动物成像相同的参数设置对脑组织进行成像。为了定量特定感兴趣区域（ROI）内的生物发光程度，需在成像软件中选择 ROI 工具，并为整只动物定量创建一个矩形 ROI。将 ROI 从鼠鼻尖至尾根部覆盖小鼠图像，并对每只动物及每个时间点使用相同尺寸的矩形框，测量总通量（total flux）。若仅评估脑部 ROI，则创建一个圆形 ROI 并将其置于动物头部区域。对每只动物重复上述操作并测量总通量。然后，在工具面板的“图像调整”选项卡中，选择生物发光信号最强的图像，设置对数尺度以及适合该图像的色彩标尺的最小值和最大值，并将此标尺统一应用于实验中的所有图像。通过在实验过程中连续测量生物发光信号，可对活体动物体内感染的发展情况进行动态追踪，以确定感染程度的变化。随着感染的进展，在最

bioluminescence-imaging-to-detect-late-stage-infection-african

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

生物发光成像检测到非洲锥虫病的晚期感染

一个 体内 成像系统用于对利什曼原虫（Trypanosomatid原生动物）感染小鼠的感染情况进行定量测量 利什曼原虫这是一种非侵入性且非致死性的方法，可用于在慢性感染过程中检测多种组织内表达荧光素酶的寄生虫。 利什曼原虫...

in vivo 活体成像转基因Leishmania 寄生虫在活体宿主中的分布

本文介绍了将携带lux标记的细菌给予小鼠，并随后使用IVIS生物发光成像进行活体分析的方法。...

活体生物发光细菌成像 In Vivo

利用荧光素酶和活体成像系统（IVIS）作为一种新方法，在临床症状出现前识别疾病终点。IVIS使我们能够实时观察脑炎病毒在多天内的侵袭过程，从而为未来研究提供更为精确的疾病模型。该技术还使我们能够比当前常用的动物模型更快地评估抗病毒药物和疫苗的潜在保护作用。通过在多个时间点对同一动物进行连续监测，可减少实验动物使用数量、降低成本，并降低动物的整体发病率，确保疾病研究过程更加人道且更具科学性。...

体内成像系统（IVIS）检测神经侵袭性脑炎病毒

来源：de Vries, C. R., et al., 一种迟发接种的慢性Pseudomonas aeruginosa伤口感染模型。J. Vis. Exp. (2020)。本视频展示了一种生物发光成像技术，用于监测活体小鼠模型中细菌感染的进展。携带 luxABCDE...

小鼠细菌感染的生物发光成像

利用电子显微镜和荧光显微镜等传统细胞生物学技术研究非洲锥虫中糖酵体的动态变化较为困难。为了观察细胞器的动态行为，已有研究结合使用荧光细胞器报告系统与流式细胞术，对活体寄生虫中糖酵体的实时动态进行监测。...

利用荧光蛋白监测非洲锥虫中糖酵体的动态变化

本方案描述了建立荷瘤小鼠模型，通过双荧光素酶成像实时监测肿瘤进展和血管生成的方法。...

双生物发光成像监测肿瘤进展与血管生成

本方案详细描述了在Trypanosoma...

揭示用于药物疗效研究的恰加斯病小鼠模型体内生物发光成像

本文通过生物发光成像和PCR技术，对经腹腔（IP）或牙龈内（IG）途径感染L. infantum-Luc的金黄地鼠进行纵向评估。在感染后第1天（1 dpi）、感染后第1周（8 dpi）和感染后第3周（22 dpi）对动物进行评估，并于感染后第50天（50th...

体内成像通过牙龈接种表达荧光素酶的无鞭毛体感染利什曼原虫婴儿株的仓鼠

在南非，针对艾滋病/艾滋病病毒的抗逆转录病毒治疗正在大规模开展监测。通过流式细胞术，结合血液学（CD45）、免疫学（CD4）以及与病毒载量相关的CD38检测方法进行综合分析。这些现代化技术在约翰内斯堡的南非国家卫生实验室服务署（NHLS-SA）实验室中实施，具有成本效益高、本地内部质量控制严格的优势，为资源有限地区的诊断体系提供了可借鉴的典范。...

全面且经济高效的艾滋病实验室监测：非洲的典范模式

NADPH 氧化酶是吞噬细胞中活性氧（ROS）的主要来源。由于 ROS 具有短暂存在的特性，因此在活体动物中测量和监测 ROS 水平十分困难。本文描述了一种在活体小鼠中连续定量检测 ROS...

不同动物模型中NADPH氧化酶活性的生物发光成像

了解如何使用生物发光成像技术在小鼠体内实时追踪非洲锥虫感染，从血液阶段到晚期脑部感染。该方法将药物评估时间从180天缩短至90天，为开发新型治疗策略提供重要依据。

利用生物发光成像检测非洲锥虫病晚期感染

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