Name: 该离体文化与模式识别小鼠肠道组织体受体刺激 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 了解小鼠小肠类器官培养与病原体刺激实验方法，掌握PAMPs和单核细胞增生李斯特菌处理技术，学习基因表达分析及蛋白定量标准化技术，为肠道免疫与宿主病原体相互作用研究提供可靠方案。

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作者感谢 Sheryl Coutermarsh-Ott 博士、Dylan McDaniel 和 Bettina Heid 提供的技术讨论。作者感谢 Nanda Nanthakumar 博士提供 Caco-2 细胞。作者还感谢弗吉尼亚理工学院的多元文化学术机会计划（Multicultural Academic Opportunities Program, MAOP）。本研究由美国国家糖尿病、消化与肾脏疾病研究所资助项目 K01DK092355（授予 I.C.A.）。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

所有研究均经弗吉尼亚理工大学动物护理与使用委员会（IACUC）批准，并在其指导下进行
1. 从 HEK293T-Rspo1 细胞系制备 R-Spondin1 条件培养基
<ol>
	<li>HEK293T-Rspondin1 细胞的制备方法此前已有描述10。将分泌 Rspondin1 的 HEK293T-Rspondin1 细胞以 5–10% 的汇合度（约 8 × 105–1.7 × 106 个细胞）接种于含 40 ml 1× Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）+ 10% 胎牛血清（FBS）的 T-175 培养瓶中作为生长培养基，并在 37 °C、5% CO2 条件下培养。&#160; 
	注意：分泌 Rspondin1 的 HEK293T-Rspondin1 细胞所用生长培养基即为含 R-spondin1 的条件培养基。R-spondin1 也可购自商业来源的重组生长因子，使用终浓度为 500 ng/ml。</li>
	<li>将 HEK293T-Rspondin1 细胞培养七天，或直至通过明场显微镜观察达到 95% 汇合度。收集 40 ml 条件培养基并转移至 50 ml 锥形管中。弃去 T-175 培养瓶中的 HEK293T-Rspondin1 分泌细胞。</li>
	<li>将含有条件培养基的管在 4 °C 下以 300 × g 离心 10 分钟，以沉淀细胞碎片。收集上清液（称为含 R-spondin1 的条件培养基），分装至 15 ml 离心管中。分装后可于 -20 °C 短期保存，或于 -80 °C 长期保存。 
	注意：解冻后的 R-spondin1 条件培养基可在 4 °C 下保存最多 1 周。</li>
</ol>
2. 小肠隐窝收获用类器官生长培养基和试剂的制备 &#160;
<ol>
	<li>收获前一日，将冷冻的蛋白基质置于冰上，并在 4 °C 过夜解冻。对将用于隐窝收获的解剖剪、镊子和载玻片进行高压灭菌。</li>
	<li>次日，开始准备含有补充剂和生长因子的 40 ml 类器官生长培养基：将储备液加入 40 ml 的 1x DMEM/F-12 中。培养基补充剂包括：10 mM2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸 (HEPES) - 400 μl，1x 谷氨酰胺补充剂 - 400 μl，1x 不含维生素 A 的 B27 - 400 μl，1x N2 - 200 μl，1 mM N-乙酰半胱氨酸 - 40 μl，100 ng/ml 小鼠 Noggin - 40 μl，50 ng/ml 小鼠 EGF - 4 μl，加入后置于 37 oC 水浴中备用。将一份 15 ml 的 R-spondin1 分装液在水浴中温育至 37 °C。</li>
	<li>将三个无菌的 24 孔板放入培养箱中，在 37 °C 下预热至少 30 分钟。每只小鼠准备 50 ml 含 2 mM 乙二胺四乙酸 (EDTA) 的 1x 磷酸盐缓冲液 (PBS)，并冷却至 4 °C。每只小鼠另准备 100 ml 含 10% 胎牛血清 (FBS) 的 1x PBS，并冷却至 4 °C。</li>
</ol>
3. 培养类器官用小鼠（Mus musculus）小肠隐窝的收获1
<ol>
	<li>处死一只6至12周龄、以标准啮齿类动物饲料喂养并可自由获取饮水的雄性C57B6/J小鼠 随意摄取 根据机构指南，通过CO2 窒息后颈椎脱位。 
	注意：在组织取材前将尸体保持在冰上，并在生物安全柜中进行组织取材，以最大限度降低污染风险。 
	注意：可使用雄性或雌性小鼠来生成类器官。</li>
	<li>（可选）在将小鼠浸入70%乙醇前，剃除其体表毛发。将小鼠浸入70%乙醇中2分钟，随后将其四肢固定于解剖板上，使小鼠背部紧贴板面。</li>
	<li>使用预先灭菌的解剖剪和镊子，在小鼠腹侧沿中线做一纵向切口，切口从外生殖器开始，向头侧延伸至颈部基部。用镊子将皮肤切口向两侧打开，并用大头针将皮肤固定在解剖板上，以暴露腹膜。</li>
	<li>使用解剖剪在腹部腹膜上做一正中切口，用镊子将腹膜向两侧翻开，并用大头针固定于解剖板上，以暴露腹腔器官。 
	注意：操作时需小心避免损伤腹部器官。</li>
	<li>用解剖镊和剪刀切断与胃相连的小肠近端连接处以及与盲肠相连的小肠远端连接处，将小肠从腹腔中取出。将小肠置于含有10 ml冰上预冷的1×PBS的无菌培养皿中。</li>
	<li>使用1 ml移液器，用预冷的1×PBS冲洗小肠肠腔内的内容物。重复此步骤，直至清除小肠肠腔内的碎片。</li>
	<li>用解剖剪将小肠切成3-4段长度大致相等的肠段，纵向平铺于新的无菌培养皿中。对每一段肠组织，将解剖剪的刃口插入小肠肠腔内，沿肠段全长切开。用镊子将切口向侧方展开，以充分暴露小肠肠腔。</li>
	<li>使用无菌玻璃载玻片轻轻刮取小肠腔面的绒毛。用解剖剪将小肠切成1-2 cm长的条状片段，并转移至含有10 ml冰冷1x PBS的50 ml锥形管中。</li>
	<li>轻轻倒置50 ml锥形管以混匀内容物，使组织沉降到50 ml锥形管底部。吸除1×PBS，并用10 ml预冷的1×PBS洗涤组织，重复此步骤三次。最后一次洗涤时，将含有10 ml 1×PBS和小肠组织段的锥形管置于冰上静置10分钟。</li>
	<li>吸去1×PBS，加入25 ml含2 mM EDTA的1×PBS，置于4℃摇床中孵育。 &#176;C 或置于冰桶中孵育 45 分钟。在组织孵育期间，标记六个 15 ml 锥形管 &#34;组分 #1-6&#34;</li>
	<li>孵育后，让组织内容物沉降至管底，吸除 1× PBS + 2 mM EDTA。加入 10 ml 1× PBS + 10% FBS，手动剧烈振摇试管 10 次。</li>
	<li>让组织内容物沉降到管底。移除上清液并转移至已标记的15 ml锥形管中 &#34;组分1&#34;重复使用1×PBS + 10% FBS振荡步骤（3.11）五次，并将上清液依次转移至相应标记的组分管中。</li>
	<li>以 125 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，将沉淀重悬于 5 ml 预热的不含生长因子的 1× DMEM/F-12 中。</li>
	<li>78 × g 离心 2 分钟。吸除 4 ml 上清液，并将每份沉淀重悬于 1 ml 剩余培养基中。</li>
	<li>从每份组分中取出 20 ml 并加至载玻片上。在光学显微镜下观察隐窝和碎片，确定应合并哪些组分，并相应地进行混合收集，以获得最高的隐窝与碎片比例。 
	注意：第2至第6组分可获得最高比例的可用于铺板的隐窝。通常合并的组分为第3与第4组分，以及第5与第6组分。</li>
	<li>以 125 × g 离心 5 分钟，使待铺板的组分沉淀。吸除上清液，保留 50–100 &#956;留在沉淀物上方的液体部分。</li>
	<li>将离心管置于冰上，向合并的组分中加入1 ml蛋白纯化介质。缓慢吹打混匀，避免产生气泡。</li>
	<li>从37℃取出预热的24孔板 &#176;C 培养箱，并加入 50 &#956;每孔中央加入 l 蛋白基质/隐窝悬浮液。将接种后的培养板转移至 37 &#176;在C型培养箱中孵育10分钟，使蛋白质基质液滴凝固。</li>
	<li>加入450 &#956;预先准备的类器官生长培养基 + 50 μL &#956;每孔加入 l R-spondin1 条件培养基。将培养板置于 37 &#176;C + 5% CO2 过夜。</li>
	<li>加入50-100 &#956;每天每孔加入 l R-spondin1 条件培养基。每 3rd 第450天，用新配制的类器官生长培养基完全更换原有培养基 &#956;每孔加入量详见步骤 2.2。此外，加入 50–100 &#956;每孔加入 l 的 R-spondin1 条件培养基。 
	注意：蛋白基质液滴可保持完整性一周，但7天后应进行类器官传代。</li>
</ol>
4. 每7天传代类器官th 天
<ol>
	<li>传代前一天将蛋白基质在冰上于4 °C过夜解冻。将一个无菌的24孔板预热至37 °C，至少30分钟。准备步骤2.2中所述的类器官生长培养基，并保持在37 °C直至使用。</li>
	<li>从培养箱中取出类器官培养板，立即在冰上开始传代操作。使用10 ml移液器从3–4个孔中吸除培养基。 
	注意：将吸出的培养基保留在10 ml移液器中，下一步将用于松动蛋白基质液滴。</li>
	<li>在已吸除培养基的孔中，反复吹打以使蛋白基质液滴脱离孔底。使用10 ml移液器的枪头轻轻刮擦有助于松动蛋白基质液滴。将内容物转移至15 ml锥形离心管中。</li>
	<li>将15 ml锥形离心管置于冰上孵育10分钟，随后在4 °C以125 × g离心5分钟。可见管底出现白色沉淀。小心吸除并弃去类器官沉淀上方大部分上清液/旧类器官生长培养基，保留沉淀上方100–200 μl液体。</li>
	<li>使用连接1 ml注射器的23号针头机械性吹打以破碎类器官隐窝结构。反复吸排10–15次以充分解离隐窝。避免过度吹打产生过多气泡。</li>
	<li>将类器官重悬于500 μl蛋白基质中，每孔加入50 μl至新的预热24孔板中。每孔再加入450 μl预先配制的类器官生长培养基及50 μl R-spondin1条件培养基。将培养板置于37 °C培养过夜。</li>
</ol>
5. 第14天接种类器官，用于通过PAMPs和单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）刺激模式识别受体以进行基因表达分析
<ol>
	<li>挑战前两天，进行划线接种 单核细胞增生李斯特菌 在BHI琼脂平板上。</li>
	<li>第二天挑选一个 L. monocytogenes 菌落并在 10 ml BHI 肉汤中于 37 ℃培养 &#176;C，200 rpm 条件下振荡培养过夜。</li>
	<li>在冰上于 4 ℃ 过夜解冻蛋白基质 &#176;C 前一天进行类器官挑战。将一个无菌的24孔板置于37℃预热 &#176;在 37°C 下孵育至少 30 分钟。配制步骤 2.2 中所述的类器官生长培养基，并保持在 37°C &#176;直至使用前均存放于 C。</li>
	<li>从培养箱中取出类器官培养物，开始类器官传代。</li>
	<li>从3-4个孔中吸出培养基，并将吸出的培养基保留在10 ml移液管中，用于悬浮蛋白基质液滴。通过反复吹打使蛋白基质液滴从孔板上脱离。使用10 ml移液管的管尖轻轻刮拭有助于松动蛋白基质液滴。将内容物转移至15 ml锥形离心管中。</li>
	<li>将15 ml锥形管置于冰上孵育10分钟。在4℃下以125 × g离心10分钟。 &#176;C. 观察锥形管底部的白色沉淀。轻轻吸除上清液，保留约 100 &#956;残留上清液。</li>
	<li>将类器官沉淀重悬于5 ml预冷的1×PBS中，并取10 &#956;l 用于计数的等分试样。加入 10 &#956;将少量样品滴加至无盖玻片的血细胞计数板中央，轻轻将玻璃盖玻片覆盖于液滴上方。 
	注意：如果未先移除玻璃盖片，类器官会堵塞血细胞计数板。</li>
	<li>通过血细胞计数板的小方格或整个计数室，在光学显微镜下计数类器官的总数，并确定类器官浓度：每10个方格中计数的类器官总数 &#956;l.</li>
	<li>从15 ml离心管中取出适量体积，确保能够接种足够数量的类器官用于检测，然后以125 × g离心10分钟。 
	注意：每孔 24 孔板中 40–100 个类器官足以用于 RNA 分析。典型的类器官大小范围可从 300 &#956;米到1,000 &#956;毫米直径。</li>
	<li>吸弃上清液，将沉淀物重悬于500 ml蛋白基质中，避免产生气泡。每孔加入50 ml类器官/蛋白基质悬液至24孔板中。 &#160; 
	注意：用于重悬类器官的蛋白基质的用量将根据处理条件的数量和技术重复次数而变化。</li>
	<li>加入500 &#956;l 器官oid生长培养基（不含N-乙酰半胱氨酸）加入每个孔中，并在37℃下孵育 &#176;C + 5% CO2 1小时。</li>
	<li>制备PAMPs的2倍浓度溶液（即 鞭毛蛋白，脂多糖）和活体 单核细胞增生李斯特菌. 测定活菌的OD值 单核细胞增生李斯特菌 并在BHI平板上划线以计数。用1 x 10处理类器官6 菌落形成单位（CFU）/ml 
	注意：OD 与 CFU 的换算关系因细菌种类而异，应在类器官刺激前进行评估。例如，OD 值为 0.6 时 &#8776; 1 × 109 CFU/ml 对于 单核细胞增生李斯特菌， 但应在实验前独立进行评估。</li>
	<li>从处理用原液中进行系列稀释划线 L. monocytogenes 以准确测定治疗后的CFU/ml。作者发现，1 × 108 100 倍稀释 &#956;在BHI琼脂平板上，足以通过计数菌落来确定准确的CFU/ml。</li>
	<li>制备热灭活溶液 L. monocytogenes 通过取1 ml活菌样品 单核细胞增生李斯特菌 溶液在5,000 × g离心10分钟。吸除上清液，用1 ml 1× PBS洗涤菌体沉淀。
	<ol>
		<li>离心 单核细胞增生李斯特菌 在 5,000 × g 离心 10 分钟，将沉淀重悬于 1 ml 1×PBS 中。进行加热灭活 L. monocytogenes 在1.7 ml聚丙烯管中于80–90℃加热 &#176;C 培养 1 小时。培养 100 &#956;热灭活后的一份等量样品 L. monocytogenes 在BHI琼脂平板上培养以确认无活菌残留。</li>
		<li>加入500 &#956;适量的2x PAMP和/或微生物处理液加入至500 &#956;由用户指定孔中的贴壁培养基。在37℃孵育 &#176;C + 5% CO₂2 24 小时 
		注意：添加500 &#956;将 2 倍浓度的 PAMP/微生物处理液分装一份至 500 &#956;1 毫升的培养基将使处理浓度在总体积为 1 毫升时达到 1 倍。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第二天，手动计数 单核细胞增生李斯特菌 为准确测定处理后的菌落形成单位（CFU/ml），吸取去除培养板中类器官的培养基，并用1×PBS洗涤孔板三次。</li>
	<li>通过苯酚/氯仿法进行RNA提取11 或根据制造商说明书使用RNA提取试剂盒。采用标准qRT-PCR方法检测基因表达12.</li>
</ol>
第14天接种类器官以进行PAMP和单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）刺激，并分析上清液中的蛋白质
<ol>
	<li>挑战前两天，开始培养Caco-2细胞，接种密度 &#8776;1 × 106 T-75 培养瓶中的细胞加入 1× DMEM + 20% FBS，将 Caco-2 细胞在 37 ℃ 培养 &#176;C + 5% CO2开始细菌培养 单核细胞增生李斯特菌 在BHI平板上接种，并将平板置于37℃细菌培养箱中培养 &#176;C.</li>
	<li>第二天挑选一个 单核细胞增生李斯特菌 菌落并在 37°C 下于 10 ml BHI 肉汤中培养 &#176;C，于冰上过夜解冻蛋白质基质 &#176;C 值在类器官挑战前一天测定。</li>
	<li>次日，将一个无菌的96孔黑色壁板加热至37 &#176;C 至少 30 分钟。按照步骤 2.2 中的描述配制不含 N-乙酰半胱氨酸的类器官生长培养基，并置于 37&#176;直至使用前均置于 C 保存。将类器官培养物从培养箱中取出，开始类器官传代。 
	注意：类器官的典型大小范围为300 &#956;米到1,000 &#956;毫米直径。</li>
	<li>从3-4个孔中吸出培养基，并将吸出的培养基保留在10 ml移液管中，用于冲下蛋白基质液滴。用移液管吹打重悬，以使蛋白基质液滴脱离培养板。使用10 ml移液管轻轻刮取有助于松动蛋白基质液滴。将内容物转移至15 ml锥形离心管中。</li>
	<li>将15 ml锥形管置于冰上孵育10分钟。在4℃下以125 × g离心10分钟。 &#176;C. 观察锥形管底部的白色沉淀物。轻轻吸除上清液，保留约 100 &#956;残留上清液。</li>
	<li>将类器官沉淀重悬于5 ml预冷的1×PBS中，并取10 μL样 &#956;l 用于计数。加入 10 &#956;取适量样品加入血细胞计数板中央，轻轻盖上盖玻片。 
	注意：如果未先移除玻璃盖片，类器官会堵塞血细胞计数板。</li>
	<li>通过血细胞计数板/计数室的每个方格，使用光学显微镜计数类器官总数，并确定类器官浓度：每10 ml中所计数的类器官总数。</li>
	<li>从15 ml锥形管中取出适量体积的悬液，确保含有足够数量的类器官用于接种实验，然后将该悬液在125 × g下离心10分钟。 
	注意：用于重悬类器官的蛋白基质的用量，需根据处理条件的数量和技术重复的次数进行调整。作者发现，40–100 个类器官足以用于分泌蛋白分析。</li>
	<li>吸弃上清液，将沉淀重悬于 500 &#956;蛋白基质每孔加入 l，避免产生气泡。 
	注意：用于重悬类器官的蛋白基质的用量将根据处理条件的数量和技术重复的次数而变化。</li>
	<li>在96孔黑色壁组织培养板上至少留出两列为空，这些孔将用于接种Caco-2细胞以生成标准曲线。加入50 &#956;每孔加入含蛋白基质和类器官悬液的混合物，置于预热的96孔黑色壁组织培养板中。将培养板置于37℃保存 &#176;在 4°C 下孵育 10 分钟，使蛋白质基质凝固。</li>
	<li>加入100 &#956;l 器官oid生长培养基（不含N-乙酰半胱氨酸）加入每个孔中，并在37℃下孵育 &#176;C + 5% CO₂2 1小时。</li>
	<li>制备PAMPs和活体的2倍浓度溶液 单核细胞增生李斯特菌 每孔加入 100 ml 相应处理条件的溶液，孵育 24 hr。</li>
	<li>次日，将Caco-2细胞接种至标准曲线孔中。首先将无菌1x PBS、0.25%胰蛋白酶和1x DMEM + 20% FBS预热至37 &#176;C.</li>
	<li>移除含有 Caco-2 细胞的 T-75 培养瓶，吸除细胞培养基。用 10 ml 1x PBS 洗涤细胞，吸除 1x PBS，加入 2 ml 0.25% 胰蛋白酶，并将 T-75 培养瓶置于 37 &#176;C 培养箱中孵育 15 分钟。</li>
	<li>在显微镜下观察培养瓶，确认细胞已脱落，然后向脱落的 Caco-2 细胞中加入 8 ml 1x DMEM + 20% FBS，转移至 15 ml 离心管中。取出 10 &#956;取等份样品，使用血细胞计数板在光学显微镜下计数细胞。 
	注意：每孔细胞数上限为 60,000 个时效果良好，可进行梯度稀释以生成标准曲线，最低稀释至每孔 2,500 个细胞。</li>
	<li>将Caco-2细胞重悬于蛋白基质中，并加入50 &#956;每孔加入适量蛋白基质至相应孔中。于37℃孵育，使蛋白基质凝固。 &#176;C 代表 Caco-2 细胞。 
	注意：Caco-2 细胞的生长培养基在蛋白基质凝固后无需添加。</li>
	<li>在类器官实验处理24小时后，吸出并保存类器官细胞的上清液，置于冰上。用1×PBS洗涤孔板三次。加入100 &#181;向每个孔（包括Caco-2标准曲线孔）加入100%甲醇100 μl，在4℃孵育 &#176;4°C 或冰上固定类器官 20–30 分钟。 
	注意：Caco-2 标准曲线孔无需用 1× PBS 洗涤，可直接加入甲醇。</li>
	<li>甲醇孵育后，用预冷的1×PBS洗涤孔板三次。将板置于4℃保存 &#176;4°C 下最多可保存 1-2 周。</li>
	<li>加入浓度为1的核染色染料 &#181;每孔 g/ml，用铝箔覆盖培养板，于 4 ℃ 孵育 &#176;C 过夜。</li>
	<li>使用96孔板读板仪检测细胞核染色染料的激发/发射波长（分别为350 nm/461 nm），并将每个类器官孔的数据根据Caco-2细胞的标准曲线进行归一化处理。</li>
	<li>进行下游实验，例如 ELISA12，以细胞数量归一化的细胞培养上清液。</li>
</ol>

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

肠道类器官的培养与维持是一种任何具备适当组织培养技术的人员均可掌握的操作。与传统的单层细胞培养相比，在传代过程中存在一些细微差别，但这些差异并不难克服。该方法的关键步骤在于能够将类器官培养至足够高的密度，以实现最佳的接种效果。由于细胞系常能达到较大的接种密度，而这对类器官而言并不现实，因此实验需根据类器官的特点进行规模调整。当存在多个处理组时，这一点尤为明显。
本方案旨在提供一种逐步研究肠上皮与多种不同细菌之间宿主-病原体相互作用的方法， 病毒和真菌病原体，并解决在此系统中进行标准化时所遇到的困难。已有研究报告描述了肠道类器官与细菌病原体之间的相互作用 沙门氏菌 但未涉及在检测分泌型细胞因子时的标准化方法13.
在通过不同方法对类器官培养物进行标准化时会遇到一些困难。通过二辛可宁酸法对分泌蛋白进行标准化 （BCA）是一种可选方法；然而，类器官培养所需的生长组分（N2 和/或维生素 B27）会干扰 BCA 检测 (数据未...

已有关于小肠、结肠、胰腺、肝脏和脑类器官的分离与培养技术的报道，这些进展对于理解更接近生理状态的组织生物学现象具有重要意义1-5首次描述小肠类器官培养与维持方法的研究由 Sato 报道 等 来自汉斯·克利弗斯实验室1在本方法出现之前，原代肠上皮细胞的分离与培养在维持上皮细胞生长方面一直存在局限性且效果不佳。传统方法包括通过胶原酶和分散酶等酶类孵育组织进行消化，但最终往往导致原代成纤维细胞混杂生长。6这些条件在维持上皮细胞培养方面也存在时间限制。由于缺乏适当的生长因子或细胞接触完整性丧失（称为失巢凋亡），上皮细胞将进入凋亡，因而几乎无法形成上皮细胞生态位。73D类器官培养系统的出现为长期培养包含多种肠道细胞类型的原代肠道细胞提供了一种方法1这些上皮类器官相较于细胞系具有优势，因其由多种分化的细胞组成，能够更真实地模拟其来源器官的结构与功能。 体内8最终的过程 &#34;在培养皿中培育迷你肠道&#34; 已被证明是评估肠道上皮在不同刺激下反应的有力工具。研究原代肠道细胞与微生物病原体相关分子模式（PAMPs）的相互作用在免疫学领域具有重要意义，因为这些分子模式能够调控宿主与微生物双方的多种反应。9研究人员如今不仅能够利用小鼠类器官研究这些相互作用，还可以培养人类来源的类器官。2这项技术有望彻底改变个性化医疗，人们不禁推测该技术在不久的将来可能带来的诸多进展。
本方法的总体目标是提供一种用于肠道类器官的培养、扩增及多种刺激物处理的操作方案。这些刺激物最终可包括疫苗、细菌病原体相关分子模式（PAMPs）、活体病原体、胃肠道（GI）药物以及抗癌治疗药物。小鼠肠道类器官的分离与培养方法源自 Sato et al.，尽管本方案在某些步骤上与原始方法略有不同，但按照本流程操作仍可成功获得类器官培养物。本方法重点阐述在处理非均质细胞结构时进行适当归一化的有效技术，这对于基于细胞数量开展的检测实验尤为重要。

<table><tbody><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11050</td><td>（第1、3、6节）或同等品牌</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR 离心机</td><td>Thermo</td><td></td><td>（第1、3节）</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GE Healthcare</td><td>Sh30243.01</td><td>（第1、6节）用于Caco-2和HEK293 Rspondin1细胞</td></tr><tr><td>HEK293T-Rspondin1分泌细胞系</td><td></td><td></td><td>（第1节）根据Kim, K.A. 等人描述并改进：慢病毒颗粒包含克隆至pReceiver-Lv105骨架的RSPO1(NM_138683) ORF cDNA，由GeneCopoeia定制订购并购买。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>50 ml 锥形管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>（第1节）或同等品牌</td></tr><tr><td>T-175 培养瓶</td><td>Corning</td><td>431079</td><td>（第1节）或同等品牌&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>蛋白基质</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>（第2、3、4、5、6节）生长因子减少型Matrigel&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HyClone杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30264.01</td><td>（第2、3节）</td></tr><tr><td>DMEM/F12&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td>（第2、3节）高级DMEM/F12</td></tr><tr><td>Corning 24孔组织培养板</td><td>Corning</td><td>3524</td><td>（第2节）</td></tr><tr><td>N2添加剂（100倍浓缩）&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>（第2节）</td></tr><tr><td>B27添加剂（不含维生素A，50倍浓缩）&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010&amp;nbsp;</td><td>（第2节）</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>（第2节）</td></tr><tr><td>谷氨酰胺添加剂（Glutamax）</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td>（第2节）可与高级DMEM/F12混合使用</td></tr><tr><td>HEPES（1 M）</td><td>Life Technologies</td><td>15630-080</td><td>（第2节）可与高级DMEM/F12混合使用&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>10 ml 移液管</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td>（第2节）或同等品牌</td></tr><tr><td>小鼠Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>（第2节）储存液浓度 = 100 mg/ml</td></tr><tr><td>N-乙酰-L-半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>（第2节）储存液浓度 = 1 M</td></tr><tr><td>重组小鼠EGF</td><td>Biolegend</td><td>585608</td><td>（第2节）储存液浓度 = 500 mg/ml</td></tr><tr><td>Rocker Variable</td><td>Bioexpres</td><td></td><td>（第3节）</td></tr><tr><td>解剖剪刀</td><td></td><td></td><td>（第3节）</td></tr><tr><td>镊子</td><td></td><td></td><td>（第3节）</td></tr><tr><td>载玻片</td><td></td><td></td><td>（第3节）</td></tr><tr><td>解剖镊</td><td></td><td></td><td>（第3节）</td></tr><tr><td>25 ml 移液管</td><td>Falcon</td><td></td><td>（第3节）</td></tr><tr><td>EDTA&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBB9821</td><td>（第3节）0.5 M 或其他组织培养级EDTA</td></tr><tr><td>无菌培养皿（100 mm × 15 mm）</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>（第3节）或同等尺寸组织培养皿</td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td>（第4节）</td></tr><tr><td>Precision Glide 针头</td><td>Becton Dickinson</td><td>305120</td><td>（第4节）23G × 1 1/4（0.6 mm × 30 mm）</td></tr><tr><td>枯草芽孢杆菌鞭毛蛋白</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-bsfla&amp;nbsp;</td><td>（第5、6节）</td></tr><tr><td>单核细胞增生李斯特菌</td><td>ATCC</td><td>19115</td><td>（第5、6节）&amp;nbsp;（Murray&amp;nbsp;等&amp;nbsp;）&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629-1EA</td><td>（第5、6节）或同等品牌</td></tr><tr><td>BBL 脑心浸液琼脂</td><td>Becton Dickinson</td><td>211065</td><td>（第5节）</td></tr><tr><td>Bacto 脑心浸液</td><td>Becton Dickinson</td><td>237500</td><td>（第5节）</td></tr><tr><td>Caco-2</td><td>ATCC</td><td>HTB-37</td><td>（第6节）</td></tr><tr><td>胰蛋白酶&amp;nbsp;</td><td>gibco</td><td>25200056</td><td>（第6节）</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td>（第6节）</td></tr><tr><td>SpectraMax M5</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>（第6节）</td></tr><tr><td>96孔检测板</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>（第6节）黑色板，透明底部，经组织培养处理</td></tr><tr><td>核染色染料</td><td>Life Technologies</td><td>H1399</td><td>（第6节）Hoechst 33342</td></tr><tr><td>T-75 培养瓶</td><td>Corning</td><td>430641</td><td>（第6节）或同等品牌</td></tr><tr><td>15 ml 锥形管</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td>（第1、3节）或同等品牌</td></tr><tr><td>1.7 ml 聚丙烯管</td><td>Bioexpress</td><td>C-3262-1</td><td>或同等品牌</td></tr><tr><td>Quick-RNA MiniPrep</td><td>Zymo Research</td><td>R1054</td><td>或同等品牌</td></tr><tr><td>TNF-alpha&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm 00443260_g1</td><td>Taqman基因表达检测试剂盒</td></tr><tr><td>IL-6&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm 00446190_m1</td><td>Taqman基因表达检测试剂盒</td></tr><tr><td>IL-1beta</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm 00434228_m1</td><td>Taqman基因表达检测试剂盒</td></tr><tr><td>IL-18</td><td>Applied Biosystems</td><td>Mm 00434225_m1</td><td>Taqman基因表达检测试剂盒</td></tr><tr><td>18s</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs 99999901_s1</td><td>Taqman基因表达检测试剂盒</td></tr><tr><td>7500 Fast 实时PCR系统</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nexus梯度Mastercycler</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Universal PCR Master Mix</td><td>Life Technologies</td><td>4352042</td><td></td></tr><tr><td>High Capacity cDNA 反转录试剂盒</td><td>Life Technologies/Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Fast Optical 96孔反应板，0.1 mL</td><td>Life Technologies/Applied Biosystems</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠R-Spondin 1蛋白</td><td>R&amp;D Systems</td><td>3474-RS-050</td><td>500 ng/ml</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7559</td><td></td></tr></tbody></table>

该 离体 小鼠肠道类器官的培养与模式识别受体刺激

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

原代肠道类器官是一种有价值的研究模型系统，有望对黏膜免疫学领域产生重大影响。然而，类器官的生长特性较为复杂，研究者需注意其中存在的诸多局限性。具体而言，每个类器官的生长模式高度可变，导致培养物中上皮细胞群体具有异质性。由于细胞结构的复杂性，常规的组织培养方法无法直接适用于类器官系统。仅基于细胞数量进行计数和接种——这种方法常用于单个分离的细胞（如细胞系）——对于类器官而言并不可靠，除非应用某种标准化技术。由于类器官中存在固有的蛋白质基质，以总蛋白含量作为标准化方法也变得复杂。在评估类器官群体分泌产物时，必须充分考虑细胞数量、形态和细胞类型等方面的特性。本实验方案旨在概述一种简单的方法，用于培养小肠类器官并以微生物病原体或病原体相关分子模式（PAMPs）对其进行处理。同时，本方案也强调了在进行此类刺激后开展蛋白质分析时应采用的标准化技术。

按照本方案培养肠道类器官时，收获后可见典型的球形类器官。每天添加R-spondin1条件培养基可启动类器官的生长和出芽。类器官的生长情况如图1A-F所示，分别代表培养第1、2、4、5、6和第14天的肠道类器官典型形态。图1F显示了第14天类器官生长的非均一性特征。
当类器官扩增至足够数量后，可将其重新接种，并用各种病原体相关分子模式（PAMP）和/或微生物进行刺激。可通过标准技术进行表达分析。如图2A-C所示，展示了类器官经热灭活单核细胞增生李斯特菌 L. monocytogenes和PAMP鞭毛蛋白刺激24小时后，炎症性细胞因子IL-18、IL-6和TNFα的mRNA表达水平。选择分析IL-18、IL-6和TNFα细胞因子mRNA表达的原因在于，这些因子是上皮细胞在应对病原体刺激时可能被调控的良好候...

本文描述了一种从小鼠小肠类器官中收获、维持并用病原体相关分子模式（PAMPs）和单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）进行处理的实验方案，同时重点介绍了基因表达分析及蛋白质数据标准化的正确方法。

原代肠道类器官是一种极具价值的模型系统，有望对黏膜免疫学领域产生重大影响。然而，该……

本实验的总体目标是通过标准化总细胞数的方法，评估病原体攻击对小肠类器官的影响。该方法有助于解答先天免疫及黏膜免疫领域中的关键问题，为体外研究细菌与肠上皮细胞之间的宿主-病原体相互作用提供手段。本实验的关键在于对总细胞数进行标准化的方法，这是通过ELISA等技术测定类器官分泌蛋白时所必需的步骤。为获取用于类器官培养的小鼠小肠隐窝，首先使用无菌载玻片轻轻刮除小肠腔面的绒毛。接着，用解剖剪将组织剪成1-2厘米长的条状，并将这些条状组织放入含有10毫升冰浴PBS的50毫升锥形管中。通过轻柔倒置混匀内容物，静置使组织沉降至管底。然后吸除PBS，并用10毫升新鲜PBS再清洗三次，每次操作方式相同。最后一次清洗结束后，将锥形管置于冰上静置10分钟。随后，将PBS替换为25毫升含2毫摩尔EDTA的PBS，置于冰桶中的摇床上孵育45分钟。孵育结束后，让组织条自然沉降至管底，弃去PBS-EDTA溶液，加入10毫升含10%FBS的PBS。手动剧烈震荡试管10次，然后静置使组织沉降，将上清液转移至标记为“组分1”的15毫升锥形管中。再用PBS-FBS溶液对组织进行5次震荡洗涤，每次震荡后均将上清液转移至新的组分管中。最后一次震荡后，离心所有样品，并将沉淀重悬于5毫升预温的不含额外生长因子的DMEM/F12培养基中。再次离心样品后，从每管中吸除4毫升上清液。将沉淀重悬于剩余的1毫升培养基中，并从每个组分中取20微升等分试样，在载玻片上观察隐窝及碎片情况。根据隐窝与碎片比例最高的组分进行合并后，离心合并的组分，弃去上清液，仅保留最后50-100微升。保持试管处于冰上状态，向合并的组分中加入1毫升蛋白基质，缓慢吹打混匀以避免引入气泡。然后，将50微升蛋白基质/隐窝悬液加入每个孔的中央位置，置于37

the-ex-vivo-culture-pattern-recognition-receptor-stimulation-mouse

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

该<em&gt;离体</em&gt;文化与模式识别小鼠肠道组织体受体刺激

来源：Van Lidth de Jeude, J. F., 等. 肠类器官慢病毒转导及下游分析方案. J. Vis. Exp.

用于免疫组织化学分析的慢病毒转导小鼠肠道类器官的处理

本文描述了一种建立原代小鼠结肠肿瘤类器官的简单方法。该方法利用了结肠肿瘤细胞能够在含有有限生长因子的培养基中存活并生长成类器官，而正常结肠上皮细胞则不能的特性。...

体外 原代小鼠结肠肿瘤类器官培养

改进的成像技术使得在器官发育过程中进行三维成像成为可能。本文介绍了一种完整的器官培养系统，可实现对胎鼠肠道中发育中的绒毛进行活体成像。...

小鼠胎儿全肠培养系统 离体 信号通路调控与绒毛发育的三维活体成像

实时分析代谢谱 离体 小鼠肠道隐窝类器官培养

在本视频方案中，我们将逐步讲解如何对原代肠上皮类器官进行慢病毒转导，并介绍这些培养物的后续处理及定量RT-PCR、RNA微阵列和免疫组织化学分析方法。...

一种用于肠道类器官慢病毒转导及下游分析的实验方案

的 离体 器官培养可在完整组织结构的背景下研究生物学过程。本文介绍一种方法 离体 小鼠结肠的培养，可用于研究肠道内的固有免疫和抗菌宿主防御。...

Ex Vivo 结肠类器官培养及其在抗菌宿主防御研究中的应用

本文介绍了一种利用新型肠道器官培养系统分析宿主-微生物组相互作用的独特方法 离体 实验。...

一种用于分析宿主-微生物群相互作用的肠道类器官培养系统

本方案提供了建立小鼠小肠类器官、从小鼠小肠固有层中分离1型固有淋巴细胞，以及在两种细胞类型之间建立三维（3D）共培养体系的详细操作步骤，用于研究肠上皮细胞与1型固有淋巴细胞之间的双向相互作用。...

小鼠小肠上皮类器官与固有淋巴细胞的共培养

本实验方案描述了建立小鼠结肠类器官系统，用于研究在claudin-7基因敲除模型中结肠干细胞的活性与功能。...

小鼠结肠隐窝的三维培养用于研究肠道干细胞功能 离体

我们描述了一种分离小鼠小肠隐窝并从隐窝培养肠道三维类器官的方案。此外，我们还介绍了一种在无上皮下细胞微环境的条件下，由单个肠干细胞生成类器官的方法。...

从小鼠肠隐窝及单个干细胞进行类器官的三维培养用于类器官研究

了解小鼠小肠类器官培养与病原体刺激实验方法，掌握PAMPs和单核细胞增生李斯特菌处理技术，学习基因表达分析及蛋白定量标准化技术，为肠道免疫与宿主病原体相互作用研究提供可靠方案。

该离体小鼠肠道类器官的培养与模式识别受体刺激

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