分离和剖析人力胆汁含外来体的MicroRNA-

该方法的总体目标是从人胆汁中分离外泌体，用于进一步分析，包括 microRNA 分析。这种方法可以帮助回答肝脏疾病领域的关键问题，例如检测胆管癌或其他胆道疾病的特定胆汁标志物。这种技术的主要优点是稳健且可重复。

要进行内窥镜逆行胰胆管造影术 （ERCP），首先将患者置于仰卧位。插管并通过患者的口腔将十二指肠镜插入后，将其插入十二指肠的第二部分并确定主要。通过插入预装有 0.35 英寸或 0.9 毫米亲水导丝的三腔括约肌管，选择性地插管胆总管。

在透视引导下，将导丝推进到左肝管，然后将括约肌推进到胆管中 5 厘米以获得稳定的位置。取下导丝后，通过下锁将 10 毫米注射器连接到导丝端口，并使用 10 毫升负压吸出胆汁。取出装有胆汁的注射器，重新插入导丝后，通过注射口注射造影剂以混浊胆道树。

然后，将收集的胆汁转移到冰上的 15 毫升试管中，如果稍后储存，请将样品以 500 倍 g 和 4 摄氏度离心 10 分钟，然后在零下 80 摄氏度下冷冻。要立即进行外泌体分离，请将 400 微升胆汁转移到微量离心管中，并以 300 倍 g 和 4 摄氏度离心 10 分钟，以收集细胞和细胞碎片。为了进一步澄清上清液，将溶液转移到新鲜的微量离心管中，并将样品在 16、500 倍 g 和 4 摄氏度下离心 20 分钟。

然后在生物安全柜中，将上清液收集到注射器中，并通过 0.2 微米聚醚砜膜过滤器过滤，以去除任何大于 200 纳米的残留颗粒。将过滤后的上清液转移到超速离心管中，并使用 PBS 使试管至少装满三分之二，以防止试管在离心过程中塌陷。通过在 120， 000 倍 g 和 4 摄氏度下超速离心 70 分钟使外泌体沉淀。

一个小的黄色颗粒将包含外泌体。小心倾析丢弃上清液，并加入漂白剂至每体积体积的最终浓度为 10% 对废物进行消毒。然后静置 20 分钟。

对于下游实验，可以在少量适当的溶液中处理沉淀，或者将它们重新悬浮在 50 至 100 微升的 PBS 中，并在零下 80 摄氏度下储存以备将来使用。在根据文本协议准备对比染色的细胞外囊泡或 EV 网格后，使用电子显微镜使用 80 千伏的加速电压获取图像，从 20， 000 X 的放大倍率开始，并增加到 100， 000 X，当确定颗粒的大小时。外泌体太小，无法通过常规显微镜或流式细胞术检测到;然而，该图显示了外泌体的典型纳米颗粒跟踪分析 （NTA） 的结果，该分析测量浓度和尺寸分布，在该分离的人类胆汁样本中平均为 97 纳米。

电子显微镜也可用于确认人胆汁中分离颗粒的大小，该图显示了典型的透射 EM 结果。探测这些蛋白质印迹中富含外泌体的蛋白质，例如跨膜四蛋白 CD63 和 Tsg101。该实时扩增图显示了从人胆汁外泌体中提取的各种 microRNA 种类。

由于外泌体缺乏可靠的标准品，如 18S 或 28S 核糖体 RNA 或管家基因，因此合成 microRNA 的加标对于正常化很重要。如果作得当，exos 分离技术可以在三个小时内完成。看完这个视频，你应该对如何从患者或动物那里获取和处理胆汁以分离和分析细胞外囊泡有一个很好的了解。

在执行此程序时，如果无法进行超速离心，请务必记住将样品在 500 G 和 4 度下离心，然后在零下 80 度冷冻。按照此程序，可以执行其他方法，如 microRNA 研究，以回答 microRNA 谱等其他问题。不要忘记，使用胆汁可能非常危险，因为它可能含有肝炎，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如戴手套和安全眼镜。

开发后，该技术为胆管癌研究领域的研究铺平了道路，以探索细胞外囊泡作为胆道问题（如 PSA 阻塞）患者胆汁中的潜在生物标志物。