Name: 分离和剖析人力胆汁含外来体的MicroRNA- (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: 学习从人体胆汁中分离外泌体并进行microRNA分析的方法。该技术通过ERCP获取胆汁样本，经多步离心和超高速离心纯化外泌体，为胆管癌等胆道疾病的生物标志物研究提供可靠工具。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH；资助号：DK090154-01）授予 F.M.S. 的 K08 奖项资助。

通过内镜逆行胰胆管造影术（ERCP）从患者获取胆汁需要获得机构审查委员会批准的人类受试者研究方案。本文所述所有工作均经约翰斯·霍普金斯大学机构审查委员会批准。
1. 从胆汁中分离外泌体
<ol>
	<li>行内镜逆行性胰胆管造影术（ERCP）。将患者置于仰卧位并进行插管。
	<ol>
		<li>经患者口腔插入十二指肠镜，进入十二指肠第二段，辨认主乳头。</li>
		<li>通过插入一根预先装载了0.035英寸（0.9 mm）亲水性导丝的三腔乳头切开刀，选择性地插管胆总管。</li>
		<li>在荧光透视引导下将导丝推进至左肝管，因为有时难以区分胆囊管与右肝管，随后将括约肌切开刀沿导丝推进至胆管内5 cm处，以获得稳定位置。</li>
		<li>移除导丝，通过鲁尔锁将10 ml注射器连接至导丝端口，利用10 ml负压抽吸胆汁。</li>
		<li>取出含有胆汁的注射器，重新插入导丝，并通过注射端口注入造影剂以显影胆管系统，继续进行内镜逆行胰胆管造影术（ERCP）。</li>
		<li>将收集的胆汁转移至预冷的15 ml离心管中，置于冰上保存，直至准备进行离心步骤。 
		注意：佩戴手套以保护自身和样本！将胆汁视为潜在感染源，因其可能含有甲型肝炎病毒颗粒！</li>
		<li>将样品置于冰上。可直接进行步骤1.2，或在4 °C下以500 × g离心10分钟，随后于-80 °C保存，待后续使用。 
		注意：以这种方式储存数年的样本通常已被使用并取得了良好效果19.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将400 µl胆汁转移至微量离心管中，在4 °C下以300 x g离心10分钟，收集细胞及细胞碎片。</li>
	<li>用移液器吸除上清液，转移至新的微量离心管中，在 4 °C 条件下以 16,500 x g 离心 20 分钟，以进一步清除上清液中的残留碎片。将废弃管置于生物危害废物容器中。或者，也可使用超速离心机进行离心。</li>
	<li>收集上清液，并在生物安全柜中使用注射器通过孔径为0.2 µm的聚醚砜（PES）膜滤器过滤，该滤器具有良好的流速和低蛋白结合特性，以去除残留的粒径大于200 nm的颗粒。</li>
	<li>将过滤后的上清液用移液器转移至超速离心管中，并加入磷酸盐缓冲液（PBS），使液体体积超过管容量的2/3。若管内液体量少于该体积，离心过程中管子可能发生塌陷！超速离心管可清洗、高压灭菌后重复使用多次。</li>
	<li>通过超速离心在 120,000 x g 条件下于 4 °C 离心 70 分钟，使外泌体沉淀。离心结束后，观察超速离心管底部，有时可见微小的黄色沉淀物，即为外泌体。</li>
	<li>小心倾倒去除上清液，并通过加入漂白剂至终浓度10% v/v对废液进行消毒，静置20分钟。</li>
	<li>对于后续实验，可将沉淀物在少量适当的溶液中进行处理（即， 用于蛋白质分离的放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液、用于miR分离的RNA裂解缓冲液，或将其重悬于50–150 µl磷酸盐缓冲液（PBS）中，可于-80 °C保存以备后续使用（定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）或蛋白质提取） 等等。）或用于通过透射电子显微镜（TEM）或纳米颗粒光学分析对外泌体样本进行表征。</li>
</ol>
2. 通过透射电子显微镜（TEM）或冷冻电镜（CryoEM）鉴定外泌体
<ol>
	<li>用移液器将细胞外囊泡重悬于100 µl PBS中。理想情况下，应使用未在-20 °C或-80 °C储存过的外泌体，尤其是在首次进行分离操作时。</li>
	<li>取20 µl等分试样（约2 µg），吸附至400目碳支持膜覆盖的Parlodion铜网上，持续2分钟，并在室温下自然干燥。</li>
	<li>将干燥后的样品小心滴加1%（v/v）EM级戊二醛溶液，在室温下固定5分钟。</li>
	<li>用去离子水洗涤铜网两次，每次5分钟，随后用1%磷钨酸（PTA）染色30秒以增强对比度。</li>
	<li>使用加速电压为80千伏的透射电子显微镜，从20,000倍放大开始，逐步增加至100,000倍，以确定颗粒大小。 
	注：也可采用其他制样方法，例如将样品铺在200目Formvar碳支持膜覆盖的铜网或镍网上，并使用1%或2%醋酸铀酰溶液染色10–15分钟进行对比增强。</li>
	<li>对于冷冻电镜（CryoEM）分析，将20 µl等分试样（约2 µg）与60 µl Protein G金标（10 nm，1:3比例）混合，有助于测定外泌体直径。</li>
	<li>将样品转移至经辉光放电处理的C-flat多孔碳膜载网上，通过滤纸吸除多余液体，然后迅速浸入液态乙烷中冷冻固定。</li>
	<li>在液氮环境中将载网装入冷冻样品台。</li>
	<li>在200 kV加速电压下，以20,000倍和100,000倍放大倍数采集图像。</li>
</ol>
3. 基于多参数纳米颗粒光学分析的外泌体鉴定
<ol>
	<li>用移液器将分离得到的外泌体在 100 µl PBS 中重悬。</li>
	<li>将外泌体以不同比例（如 1:50、1:100、1:300、1:600 和 1:1,200）稀释于 600 µl PBS 中。</li>
	<li>根据制造商的操作说明，使用适当的仪器和软件通过激光散射实时观察外泌体20。</li>
	<li>在捕获模式下提高相机增益，直至颗粒可见，然后调节焦距使颗粒呈现平滑外观。</li>
	<li>切换至标准模式后，将相机调至仍能观察到颗粒的最低水平，必要时调整相机快门速度和增益以达到最佳效果。</li>
	<li>目视检查屏幕上是否可见 20–100 个颗粒，若不符合要求，则冲洗仪器并调整 PBS 中的稀释比例。</li>
	<li>随后将捕获时长调整为 30–60 秒。视频采集完成后，调整处理参数，确保屏幕上所有颗粒均被识别，并对视频文件进行分析处理。</li>
</ol>
4. 通过蛋白质印迹法表征外泌体
<ol>
	<li>在冰上预冷的100 µl放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液中加入蛋白酶抑制剂，通过反复吹打彻底重悬来自2-5 ml胆汁的外泌体沉淀，并剧烈混匀30秒&#160;在涡旋振荡器上充分混匀以有效溶解蛋白质。</li>
	<li>大多数情况下无需此步骤，但为确保充分裂解，可在冰上对样品进行脉冲式超声处理，每次10秒，共2次。</li>
	<li>在4 °C条件下，以15,000 × g离心5分钟，沉淀不溶物，将上清液转移至洁净离心管中。</li>
	<li>使用选定的方法测定蛋白质浓度（即，二辛可宁酸（BCA），考马斯亮蓝，改良Lowry法，660 nm蛋白质定量法 等等。按照制造商的说明书进行操作。只要始终采用相同的方法，所获得的实验结果具有可比性，方法本身的重要性相对较低。</li>
	<li>将样品在95 °C加热5 min后，每孔上样50 µg蛋白（溶于Laemmli缓冲液中），进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。</li>
	<li>在PAGE凝胶上电泳样品1.5小时，然后将分离的蛋白质转移至尼龙膜上。</li>
	<li>用含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液（Tris缓冲盐溶液加0.1% Tween 20）封闭膜1小时，随后加入外泌体特异性抗体（如抗CD63和抗TSG-101抗体），按1:500稀释比例孵育，建议在4 °C下过夜孵育。</li>
	<li>用 TBS-T 缓冲液洗涤膜 3 次，每次 10 分钟，然后在室温下用含 5% 脱脂奶粉的 TBS-T 缓冲液稀释的相应 HRP 标记二抗孵育 1–2 小时。</li>
	<li>用TBS-T缓冲液洗涤膜3次，每次5分钟，然后根据制造商说明书，使用化学发光试剂检测特异性蛋白。</li>
	<li>根据制造商的说明书，使用胶片或数字成像系统对膜进行成像。</li>
</ol>
5. 从分离的外泌体中提取microRNA
注意：胆汁外泌体中miRNA的分离采用基于商用试剂盒的改良miRNA提取方法，但也可使用或调整其他任何RNA提取方法。
<ol>
	<li>向外泌体沉淀（从 400 µl 胆汁中分离）中加入 300 µl 裂解/裂解缓冲液，涡旋振荡，用移液器吹打或通过针头/注射器反复抽吸，彻底裂解外泌体以获得均一的裂解液。</li>
	<li>加入 1/10 体积（30 µl）的 miRNA 匀浆添加剂，通过涡旋振荡或反复倒置离心管充分混匀。</li>
	<li>将混合物置于冰上孵育 10 分钟。</li>
	<li>加入与初始匀浆液体积相等的酸性酚:氯仿溶液（300 µl）。</li>
	<li>加入 5 µl 浓度为 5 fmol/µl 的 cel-miR-39，涡旋振荡 30–60 秒。</li>
	<li>在室温下以 10,000 × g 离心 5 分钟，以分离水相（上层）和有机相（下层）。</li>
	<li>小心用移液器吸取上层水相并转移至新的离心管中，记录转移体积。将有机相弃入适当的有机废液容器中。</li>
	<li>为富集小分子 RNA，向回收的水相中加入 1/3 体积的 100% 乙醇，并通过充分涡旋振荡或反复倒置离心管混匀。</li>
	<li>将裂解液/乙醇混合物转移至过滤柱中，每次不超过 700 µl。</li>
	<li>以最高 10,000 × g 离心 15 秒，或使用真空装置使混合物通过滤膜。</li>
	<li>收集滤过液；若裂解液/乙醇混合物体积超过 700 µl，将滤过液转移至新管并重复操作，以收集全部滤过液。此滤过液中含有不含小分子 RNA 的 RNA 组分，可用于回收较大分子量的 RNA。</li>
	<li>向总滤过液中加入 2/3 体积的室温 100% 乙醇，并通过涡旋振荡充分混匀。</li>
	<li>将滤过液/乙醇混合物转移至第二个过滤柱中。同前，每次最大上样体积为 700 µl。</li>
	<li>以 10,000 × g 离心 15 秒，或按步骤 5.10 所述使用真空装置。</li>
	<li>弃去滤过液，重复操作直至全部滤过液/乙醇混合物均通过过滤柱。</li>
	<li>向过滤柱中加入 700 µl miRNA 洗涤液 1，离心 5–10 秒或使用真空装置，弃去滤过液。</li>
	<li>用 500 µl 洗涤液 2/3 按步骤 5.16 的方法洗涤滤膜。</li>
	<li>再次用 500 µl 洗涤液 2/3 按步骤 5.16 的方法进行第二次洗涤，弃去滤过液，并将滤柱放回收集管中。</li>
	<li>以 10,000 × g 离心 1 分钟，彻底去除滤膜中残留液体。</li>
	<li>将滤柱转移至新的收集管中，并在滤膜中心加入 100 µl 预热至 95 °C 的无核酸酶水。</li>
	<li>以最大转速离心 20–30 秒，以回收 RNA。</li>
	<li>收集洗脱液，立即使用或于 -80 °C 保存。</li>
</ol>

<ol><li>Admyre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+with+immune+modulatory+features+are+present+in+human+breast+milk%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk.</a> J. Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).</li>
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</ol>

所有作者均无竞争性经济利益。

为了可靠地利用从胆汁中分离的外泌体，必须采用一致的高质量分离方法，以获得高质量的样本。本文所定义的方法是一种成熟的技术，可用于从人胆汁中分离外泌体和miRNA。该方法强调了对外泌体进行表征时的若干关键步骤，至少应包括电子显微镜或纳米颗粒光学分析以及蛋白质印迹（Western blot）。
在分离外泌体的过程中，至少就miRNA稳定性而言，最关键的步骤是尽快处理新鲜胆汁。全胆汁在室温下长期储存，甚至经历一次冻融循环，都会显著降低miRNA含量；相比之下，分离后的外泌体即使在室温储存或经历多次冻融循环，仍具有很高的稳定性。只要待处理的样本一直保存在-80 °C条件下，即可高度可重复地从胆汁中成功分离外泌体和miRNA，从而鉴定样本中的miRNA特征。建议初始阶段使用新鲜胆汁，以确保miRNA的完整性。在需要长期积累胆汁样本（如患者样本）的情况下，这一点尤为重要。该方法使得在数月甚至数年内收集的样本能够集中于同一时间进行处理和分析。
这极大地提高了胆汁在诊断中的应用价值，可用于检测miRNA特征，以确认癌症等疾病状态的存在或疾病对治...

与其他生物流体类似，即 母乳、血浆或尿液、胆汁中含有富含脂质的囊泡——外泌体1-4外泌体可诱导或改变受体细胞的生物学功能5, 6一种细胞间通讯形式，可能是其正常功能的一部分4, 7-9外泌体可包含微小RNA（miRNA）种类，这些miRNA可为疾病诊断提供有价值的生物标志物来源10近年来，miRNA谱作为多种疾病的诊断和预后标志物已受到广泛关注11-14.
miRNA 本身可存在于生物体液中，可能由死亡细胞释放，而脱落细胞的数量会受到潜在疾病的重大影响。外泌体中的 miRNA 谱并不一定反映来源细胞的 miRNA 谱6, 10, 15-17，但外泌体可能携带具有亲代细胞特征性的 miRNA 标志，例如肿瘤细胞。在肺腺癌、前列腺癌及其他肿瘤患者的血浆中已鉴定出肿瘤来源的外泌体8, 16, 18。
本方法旨在从人胆汁样本中可靠且稳健地分离外泌体，且在很大程度上不受样本前期处理步骤的影响。该方法的开发目的是利用胆汁作为microRNA的可靠来源，用于胆管疾病（如胆管癌）的潜在诊断19。该方法包括多个逐步提高离心速度的离心步骤以分离外泌体，且可能适用于其他生物体液。

<table><tbody><tr><td>0.2 &amp;micro;m 聚醚砜（PES）膜过滤器</td><td>Corning</td><td>431229</td><td></td></tr><tr><td>薄壁聚烯烃超速离心管&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>331374</td><td></td></tr><tr><td>SW40Ti 转子</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LM10-HS&amp;nbsp;</td><td>Nanosight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>纳米颗粒追踪分析（NTA）软件&amp;nbsp;</td><td>Nanosight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mirVANA</td><td>Life Technologies</td><td>AM1560</td><td></td></tr><tr><td>完全蛋白酶抑制剂</td><td>Roche distributed by Sigma-Aldrich</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon PSQ</td><td>Millipore, Bedford MA</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD63 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab59479</td><td></td></tr><tr><td>抗 Tsg101 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab30871</td><td></td></tr></tbody></table>

从人胆汁中分离和分析含微小rna的外泌体

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

过去三年中，外泌体研究极大地拓展了生物标志物的鉴定与表征及其治疗应用的范围。
外泌体最近被发现含有微小RNA（miRs）。miRs本身已成为有价值的诊断生物标志物。由于临床和医院的样本采集方式差异较大，从全胆汁中分离miRNA的结果也存在显著差异。为了以简单的方式从收集的胆汁样本中获得稳定、准确且可重复的miRNA谱，亟需建立一种高质量的外泌体分离与表征方案。该方法包括多次离心、过滤步骤，以及最终通过超速离心沉淀分离得到的外泌体。透射电子显微镜、Western印迹、流式细胞术以及多参数纳米颗粒光学分析（如具备条件）是验证外泌体质量的关键表征步骤。从这些外泌体中提取miRNA时，需在裂解液中加入来自某一物种的非特异性合成miRNA作为内参 spike-in 秀丽隐杆线虫, 即，cel-miR-39，对于校正RNA提取效率具有重要意义。采用本方法从胆汁液体中分离外泌体，可实现对在-80 °C下保存数年的胆汁样本进行成功的miRNA表达谱分析。

由于外泌体体积过小，无法通过常规显微镜或流式细胞术检测，因此必须采用电子显微镜或纳米颗粒光学分析。与电子显微镜相比，纳米颗粒光学分析具有可定量的优点，并能提供粒径分布和浓度信息。该仪器通过玻璃棱镜将高度聚焦的激光束引入样品中，利用EMCCD高灵敏度相机捕获分离囊泡的布朗运动，并逐帧进行追踪。纳米颗粒追踪分析（NTA）软件通过逐帧测量这种布朗运动，计算胆汁外泌体样品的粒径、众数及分布情况。图1展示了从人胆汁样本中分离的外泌体进行典型NTA分析的结果。
或者，可采用透射电子显微镜来确认分离颗粒的大小，但无法进行定量分析。图2A展示了从人胆汁中分离的外泌体的典型透射电子显微镜结果。
为进一步验证所分离颗粒的外泌体特性，可通过 Western blot 检测 Tsg101 ...

胆汁是细胞外囊泡/外泌体的宝贵来源，其中可能含有重要的生物标志物。本方案提供了一种可靠的方法，用于从人胆汁中分离外泌体，以便进行后续分析，包括miRNA谱型分析。

从人胆汁中分离和分析含微小RNA的外泌体

近三年来，外泌体研究极大地拓展了生物标志物的鉴定与表征及其治疗应用的范围……

本方法的总体目标是从人胆汁中分离外泌体，用于后续分析，包括微小RNA谱型分析。该方法有助于解答肝病领域的一些关键问题，例如胆管癌或其他胆道疾病中特定胆汁标志物的检测。该技术的主要优势在于其具有良好的稳健性和可重复性。进行内镜逆行胰胆管造影术（ERCP）时，首先将患者置于仰卧位。经气管插管后，将十二指肠镜经患者口腔插入，并送至十二指肠第二部分，找到主乳头。使用预先置入直径0.35英寸或0.9毫米亲水性导丝的三腔切开刀，选择性地插入胆总管进行插管。在荧光透视引导下，将导丝推进至左肝管，随后将切开刀沿胆管推进约5厘米以获得稳定位置。取出导丝后，通过下端锁扣将10毫升注射器连接至导丝端口，利用10毫升负压抽吸胆汁。移除含有胆汁的注射器，重新插入导丝后，经注射端口注入造影剂以显影胆管树。然后，将收集的胆汁转移至预冷的15毫升离心管中，并置于冰上。若需保存以备后续使用，则在4°C条件下以500 × g离心10分钟，随后于-80°C冷冻保存。如需立即进行外泌体分离，取400 µL胆汁加入微量离心管中，在4°C条件下以300 × g离心10分钟，以收集细胞及细胞碎片。为进一步清除上清液中的杂质，将上清液转移至新的微量离心管中，在4°C条件下以16,500 × g离心20分钟。然后在生物安全柜中，将上清液收集到注射器中，并通过0.2微米的聚醚砜膜滤器过滤，以去除任何大于200纳米的残留颗粒。将过滤后的上清液转移至超速离心管中，并使用PBS将管内液体补充至至少三分之二满，以防止离心过程中管子塌陷。在4°C条件下，以120,000 × g离心70分钟，沉淀外泌体。少量黄色沉淀物将包含外泌体。小心倾倒弃去上清液，并通过加入漂白剂使终浓度达到10%（体积比）来对废液进行消毒，然后静置20分钟。对于后续实验，可将沉淀物在少量适当的溶液中直接处理，或将其重悬于 50 至 100 微升的 PBS 中，于 -80 摄氏度保存以备后续使用。根据文本方案制备经染色对比的细胞外囊泡（EVs）载网后，使用电子显微镜以 80 千伏的加速电压获取图像，初始放大倍数为 20,000 X，测定颗粒大小时逐步增加至 100,000 X。外泌体体积过小，无法通过常规显微镜或流式细胞术检测；然而，本图展示了一次典型的外泌体纳米颗粒追踪分析（NTA）结果，该分析测量了外泌体的浓度和粒径分布，在此分离自人胆汁的样本中，平均粒径为 97 纳米。电子显微镜也可用于确认人胆汁中分离颗粒的大小，本图展示了一张典型的透射电镜结果。这些蛋白质印迹检测了在外泌体中富集的蛋白质，例如四跨膜蛋白CD63和Tsg101。该实时扩增曲线图显示了从人胆汁外泌体中提取的多种microRNA物种。由于外泌体缺乏诸如18S或28S核糖体RNA或看家基因等可靠的标准化指标，加入合成的微小RNA进行标准化校正显得尤为重要。如果操作得当，外泌体分离技术可在三小时内完成。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从患者或动物体内获取并处理胆汁，以分离和分析细胞外囊泡。在重复此操作步骤时，若无法立即进行超速离心，务必记住在零下80摄氏度冷冻前，先将样本在500 × g、4摄氏度条件下离心。完成此步骤后，可进一步开展其他方法，例如微小RNA（microRNA）研究，以回答更多科学问题，如microRNA表达谱分析。请注意，胆汁操作可能具有极高危险性，因其可能含有肝炎病毒，因此在执行该操作时，必须始终采取预防措施，例如佩戴手套和护目镜。该技术建立后，为胆管癌研究领域开辟了道路，推动了对细胞外囊泡作为胆汁中潜在生物标志物的研究，特别是在患有胆道问题（如PSA梗阻）的患者中。

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分离和剖析人力胆汁含外来体的MicroRNA-

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从人胆汁中分离和分析含微小RNA的外泌体

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