Name: 器官空调，媒体和应用的产生对乳腺癌转移行为研究器官特异性的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 学习利用小鼠淋巴结、骨骼、肺和脑制备器官条件培养基，研究器官特异性可溶性因子对乳腺癌细胞转移行为的影响。该方法为肿瘤转移研究提供了有效的体外实验平台。

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本研究得到了加拿大乳腺癌基金会安大略地区分部、加拿大创新基金会（编号：13199）以及伦敦健康科学基金会通过约翰和唐娜·布里斯托尔捐赠的资金支持（资助对象：A.L.A.）。研究生奖学金和博士后资助由安大略省研究生奖学金项目（安大略省政府，资助对象：G.M.P. 和 J.E.C.）、加拿大研究生奖学金-硕士项目（资助对象：M.M.P.）、加拿大卫生研究院（CIHR）战略培训项目（资助对象：M.M.P.、G.M.P. 和 J.E.C.）以及伦敦地区癌症项目帕梅拉·格林韦-科尔梅尔转化乳腺癌研究组（资助对象：M.M.P.、G.M.P.、J.E.C. 和 Y.X.）提供。A.L.A. 获得加拿大卫生研究院新研究者奖以及安大略省研究与创新部早期研究者奖的支持。

所有动物实验均按照加拿大动物护理委员会的建议进行，并经西安大略大学动物使用小组委员会批准的方案许可。
1. 器官分离（肺、脑、骨、淋巴结）
<ol>
	<li>准备四个无菌的50 ml锥形管（每个待分离器官各用一个），每管中加入约30 ml无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。使用电子天平预先称量每管PBS的重量。</li>
	<li>通过 CO₂ 处死 6–12 周龄小鼠2 吸入。小鼠应留在CO中2 约1-2分钟&#160;或直至小鼠停止活动和呼吸。可通过手指手动检查是否无心跳来进一步确认安乐死是否成功。应避免采用颈椎脱位法，因为该方法可能导致颈部血管破裂，从而增加腋下淋巴结的摘除难度。 
	注意：先前的研究专门使用了健康的雌性裸鼠，Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu13.</li>
	<li>在无菌组织培养罩内，将小鼠仰卧置于聚苯乙烯泡沫垫上，展开四肢并用图钉固定。</li>
	<li>使用无菌镊子和剪刀，在生殖器处沿腹中线剪开腹部皮肤，并向上剪至口部。轻轻将腹部皮肤从腹肌上剥离，并用大头针固定在聚苯乙烯泡沫板上。</li>
	<li>定位腋窝、肱部和腹股沟淋巴结。 
	注意：淋巴结通常被脂肪组织包围。腹股沟淋巴结位于腹部皮肤回缩后两支血管交汇处的浅表位置，最容易定位。腋窝和臂部淋巴结则位于组织较深处，需要轻柔地移动组织进行定位。
	<ol>
		<li>找到淋巴结后，使用剪刀轻柔而仔细地将淋巴结从皮肤、脂肪和血管组织上分离，并将其从小鼠体内取出。为确认解剖操作正确，可用镊子轻轻滚动已取出的组织。若在滚动过程中感觉到坚硬的结节，则表明淋巴结很可能已成功摘除。</li>
		<li>将切除的淋巴结置于冰冻的PBS中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用镊子和剪刀，沿腹壁向上朝胸部方向剪开暴露的腹壁，以打开腹腔。小心剪开胸骨，暴露胸腔。</li>
	<li>在肺下方找到膈肌并将其切开。由于张力作用，膈肌应向肋骨方向牵拉。</li>
	<li>从下方托起肺部，剪开通向气管的下方组织，使肺叶可自由地从胸腔中取出。移除心脏和肺 整块 并置于冰冷的PBS中。心脏可在本步骤中或在第2步称重前从肺部取出。</li>
	<li>移除固定针，保持小鼠在聚苯乙烯泡沫垫上的位置不变。将小鼠翻转，沿下背部从一侧 flank 到另一侧 flank 横向剪开皮肤。</li>
	<li>使用无菌纱布固定小鼠躯干，将小鼠背部皮肤向腿部和足部方向剥离。</li>
	<li>使用同一块无菌纱布固定小鼠腿部，小心折断小鼠足部踝关节，然后将关节处的皮肤自近端向膝关节方向剥离。</li>
	<li>用剪刀将胫骨从膝关节处分离，并置于冰冷的PBS中。</li>
	<li>重复步骤 1.11）至 1.12），对侧肢体进行相同操作。</li>
	<li>用镊子固定股骨，用剪刀剪除周围肌肉组织，取出股骨并置于冰上预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中。</li>
	<li>用对侧肢体重复步骤 1.14）。</li>
	<li>使用一块新的无菌纱布固定小鼠头部。用镊子和剪刀轻轻去除皮肤以暴露颅骨。用剪刀从颅骨顶部中央开始，沿直线向下小心剪开枕骨，以暴露后脑。</li>
	<li>用镊子从脑组织下方前端开始分离，完整取出整个脑组织。将脑组织置于预冷的PBS中。</li>
	<li>对至少四只小鼠重复步骤 1.1）至 1.17）。</li>
</ol>
2. 器官称重
<ol>
	<li>器官分离后，使用电子天平称量每个含有肺和脑组织的 PBS 管。</li>
	<li>通过从 PBS 管加器官（肺和脑）的重量中减去分离前的重量（仅 PBS）来计算重量差。</li>
	<li>根据计算出的重量差确定用于重悬组织碎片所需的培养基体积。 
	注意：肺和脑组织通过以 4:1 的培养基与组织比例（体积/重量）重悬进行重量归一化。</li>
</ol>
3. 肺和脑条件培养基的制备
<ol>
	<li>在无菌组织培养罩内，将含有肺或脑组织的 PBS 管倒置 3 次，以去除器官中的残留血液，并吸除含血的 PBS。用新鲜的冷 PBS 重复此步骤，直至溶液澄清，无血液痕迹。</li>
	<li>将肺和脑组织分别置于两个 60 mm2 玻璃培养皿中。使用两把无菌手术刀片，通过反复切割将肺或脑组织切碎，直至组织碎片大小约为 ~1 mm3。</li>
	<li>将组织碎片重悬于适当体积（根据步骤 2.3 事先确定）的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）:F12 培养液中，该培养液添加了 1x&#160;浓度的有丝分裂原补充剂以及青霉素（50 µg/ml）/链霉素（50 µg/ml）。</li>
	<li>将重悬的肺或脑组织碎片加入 6 孔板中的一个孔内。</li>
	<li>将组织碎片在培养基中于 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 24 小时。孵育结束后，收集每种组织的条件培养基，并在 50 ml 锥形管中加入三倍体积的新鲜培养基进行稀释。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 1,000 × g 离心各器官的稀释后条件培养基 15 分钟，以去除大块组织碎片。收集上清液，并通过 0.22 µm 注射器滤器过滤。</li>
	<li>为消除个体小鼠间的差异，将来自多只小鼠的同种器官的条件培养基合并（i.e.，肺与肺合并，脑与脑合并）。分装后于 -80 °C 保存，直至使用。</li>
</ol>
4. 骨髓条件培养基的制备
<ol>
	<li>在无菌组织培养罩中，用剪刀修剪骨骼上多余的组织，并去除骨骺（骨的末端部分）。</li>
	<li>使用27½ G针头，将1 ml PBS从每根骨骼的中心推过，以冲洗骨髓腔。此操作可使骨髓基质细胞（BMSC）被收集到含有PBS的新离心管中。</li>
	<li>在4 °C条件下以1,000 × g离心5分钟，并用PBS洗涤BMSC两次。将骨髓基质细胞重悬于20 ml骨基质细胞生长培养基中（DMEM:F12培养基，添加1×浓缩有丝分裂原补充剂、青霉素（50 µg/ml）/链霉素（50 µg/ml）和10%胎牛血清（FBS））。</li>
	<li>将10 ml重悬的骨髓基质细胞接种至一个T75培养瓶中。 
	注意：将每两只小鼠的细胞合并后接种至每个T75培养瓶中；对于四只小鼠，需要两个T75培养瓶（约1 × 107 个细胞/瓶）。</li>
	<li>将骨髓基质细胞在骨基质细胞生长培养基中于37 °C、5% CO2条件下培养24小时。培养结束后，收集两个T75培养瓶中的培养基，转移至新的T75培养瓶中，并将该培养瓶标记为&#34;Floater Flask&#34;。向原来的两个培养瓶中加入新鲜的骨基质细胞生长培养基，并将全部三个培养瓶继续在37 °C、5% CO2条件下培养。</li>
	<li>当细胞融合度达到约70%时（约5–7天），进行传代。操作时，移除培养基，并用PBS洗涤细胞两次（每次3 ml）。吸除PBS后，加入3 ml胰蛋白酶/EDTA溶液，确保溶液覆盖整个培养瓶表面。待细胞从瓶壁脱落（约2–3分钟）后，加入3 ml骨基质细胞生长培养基以终止消化反应。在4 °C条件下以900 × g离心5分钟，弃去上清液，将细胞重悬于10 ml新鲜骨基质细胞生长培养基中。</li>
	<li>合并所有培养瓶中的细胞，按1:5比例传代至三个新的T75培养瓶中，并在37 °C、5% CO2条件下培养。当细胞再次达到70%融合度时，重复步骤4.6，对所有贴壁细胞进行第二次合并与传代。将全部细胞重新接种至四个T75培养瓶中，并在37 °C、5% CO2条件下继续培养。所有步骤均应使用骨基质细胞生长培养基。</li>
	<li>让细胞生长至完全融合，用PBS洗涤细胞三次，加入骨基质细胞收集培养基（DMEM:F12培养基 + 1×浓缩有丝分裂原补充剂 + 青霉素（50 µg/ml）/链霉素（50 µg/ml）；每T75培养瓶10 ml），确保该培养基不含FBS。72小时后收集骨髓条件培养基，经0.22 µm滤膜过滤，合并、分装后储存于-80 °C备用。</li>
	<li>如需验证，可使用抗小鼠Sca-1、CD105、CD29、CD73和CD44抗体，通过标准流式细胞术方法对分离的骨髓基质细胞（BMSC）表型进行鉴定，具体操作如先前文献13所述。</li>
</ol>
5. 淋巴结条件培养基的制备
<ol>
	<li>在无菌细胞培养操作台中，将含有淋巴结的 PBS 管倒置三次，以去除淋巴结中的残留血液，并吸除带血的 PBS。用新鲜的冷 PBS 重复此步骤，直至溶液澄清，无血液痕迹。</li>
	<li>将淋巴结置于 60 mm2 玻璃培养皿中。使用两把无菌手术刀片，反复切割淋巴结，直至组织碎片大小约为 1 mm3。</li>
	<li>在锥形管中，将组织碎片重悬于 10 ml 含青霉素（50 µg/ml）/链霉素（50 µg/ml）、5 × 10-5 M 无菌 β-巯基乙醇（1.75 µl/500 ml 培养基）和 10% 胎牛血清（FBS）的 RPMI1640 培养基中。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 900 × g 离心 5 分钟，弃上清，将所有细胞重悬于 30 ml 培养基中。向 6 孔板中每孔加入 5 ml 培养基，于 37 °C、5% CO2 条件下培养 7 天。</li>
	<li>培养 7 天后，弃去培养基，用 5 ml 温热 PBS 洗涤贴壁细胞，每孔加入 5 ml 新鲜培养基。继续培养细胞至融合（约 5–7 天），胰酶消化后收集所有细胞，按步骤 4.6 所述方法传代，并重新接种至 6 孔板中。重复此步骤三次。</li>
	<li>经过三次传代后，让细胞生长至融合，用 PBS 洗涤孔板三次，每孔加入 2 ml DMEM:F12 培养基，其中含 1× 有丝分裂原添加剂及青霉素（50 µg/ml）/链霉素（50 µg/ml），确保该培养基不含 FBS。72 小时后收集淋巴结条件培养基，合并、分装后于 -80 °C 保存备用。</li>
	<li>如需验证，可使用抗小鼠 CD45 和 gp38 抗体，通过标准流式细胞术方法对分离的淋巴结基质细胞（LNSC）表型进行鉴定，具体方法如前所述13。</li>
</ol>
6. 利用器官条件培养基进行与癌细胞转移行为相关的下游实验
<ol>
	<li>一旦按照步骤1-5制备得到器官条件培养基，即可利用该培养基开展多种下游细胞与分子生物学实验，以评估可溶性器官来源因子对癌细胞转移行为的影响。常见的标准实验方法（文献中已有描述）包括蛋白质芯片13细胞增殖实验13细胞迁移实验13肿瘤球形成14，以及 RT-PCR15用于生成器官条件培养基的原始基础培养基（即未添加任何诱导成分的DMEM:F12培养基，补充1倍浓度的有丝分裂原添加剂以及青霉素（50 µg/ml）/链霉素（50 µg/ml），应作为阴性对照使用。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

转移是一个复杂的过程，一系列细胞事件最终导致组织侵袭和远处肿瘤的形成4,30,31。本文介绍的ex vivo模型系统可用于研究转移进展中的两个重要方面：癌细胞向特定器官的归巢或迁移（&#34;到达该部位&#34;）以及在该器官中的生长（&#34;在该部位增殖&#34;）。以往许多研究主要集中在识别与癌细胞自身相关的关键分子特征，这些特征有助于转移过程。例如，Joan Massagué 研究组的工作已鉴定出与肺特异性、骨特异性和脑特异性扩散模式相关的不同基因表达谱10-12,32。尽管这些研究为癌细胞在该过程中的作用提供了重要的见解，但关于继发性微环境所提供的器官特异性因子的作用，目前了解仍较少，且这一领域相对难以研究13。
这 离体 模型系统先前已通过证明乳腺癌细胞系在器官条件培养基（organ-CM）中的特异性迁移和生长行为与其细胞系在继发器官微环境中的表现一致，从而被验证为继发器官微环境的准确表征。 体内 转移扩散模式。Chu 及其同事的一项研究使用了四种具有...

乳腺癌是女性中最常被诊断出的癌症，也是癌症相关死亡的第二大原因1。乳腺癌的高死亡率主要归因于传统疗法无法有效控制和消除转移性疾病；约90%的癌症相关死亡由转移引起2。深入理解转移级联过程中潜在的分子机制，对于开发在乳腺癌早期和晚期均有效的治疗手段至关重要。
既往研究已帮助阐明了乳腺癌转移的多步骤特性，人们推测癌症进展和转移的结果在很大程度上依赖于癌细胞与宿主环境之间的相互作用3。临床观察表明，许多癌症表现出器官趋向性，i.e.，即倾向于优先转移到特定器官。以乳腺癌为例，患者的疾病通常会扩散或转移至5个主要部位，包括骨骼、肺、淋巴结、肝脏和脑4-6。为解释这一过程已提出多种理论，但仅有少数经受住了时间的考验。Ewing在20世纪20年代提出的转移理论假设转移分布完全由机械因素决定；即肿瘤细胞通过机体正常的生理性血流模式被携带至全身，并简单地在所遇到的第一个毛细血管床中滞留7。相比之下，Stephen Paget于1889年提出的&#34;种子与土壤&#34;假说则认为，转移灶的存活与生长还依赖于额外的分子相互作用，即癌细胞（&#34;种子&#34;）仅能在可产生适当分子因子的器官微环境（&#34;土壤&#34;）中定植并增殖8。近一个世纪后，Leonard Weiss对既往发表的尸检数据进行了荟萃分析，证实了Ewing的预测：在尸检时发现的许多转移性肿瘤，其分布比例与仅由血流模式决定转移器官趋向性时所预期的比例相符。然而，在许多情况下，某些部位形成的转移灶数量少于或多于Ewing所提出的机械因素所能解释的预期值9。这些研究结果和理论表明，特定器官的微环境在包括乳腺癌在内的多种癌症的播散模式及其后续的生长与存活中起着关键作用。
既往的研究主要集中在肿瘤细胞衍生因子及其对乳腺癌转移过程中所观察到的器官趋向性的贡献10-12，然而，关于来源于器官微环境的因子是否可能为乳腺癌转移灶的定植提供有利的微环境，相关研究仍十分有限。这在很大程度上归因于在体外研究器官微环境组分所面临的技术挑战in vitro。
本文介绍了一种全面的ex vivo模型系统，用于研究淋巴结、骨、肺和脑组织中可溶性成分对人乳腺癌细胞转移行为的影响。先前的研究已验证了该模型系统的有效性，表明不同的乳腺癌细胞系在响应器官条件培养基时表现出细胞系特异性和器官特异性的恶性行为，这与其in vivo转移潜能相一致13。该模型系统可用于鉴定和评估可能在乳腺癌及其他类型癌症细胞的转移行为中发挥作用的特定器官来源的可溶性因子，包括其对细胞增殖、迁移、类干细胞行为和基因表达的影响，同时也有助于发现潜在的新的癌症治疗靶点。这是首个可用于详细研究器官特异性转移行为并评估器官来源可溶性因子在驱动癌症转移过程中作用的ex vivo模型系统。

<table><tbody><tr><td>50 ml 锥形管</td><td>Thermo Scientific (Nunc)</td><td>339652</td><td>保持无菌</td></tr><tr><td>1× 磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010-023</td><td>保持无菌</td></tr><tr><td>裸鼠</td><td>Harlan Laboratories</td><td>Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu</td><td>使用 6 至 12 周龄小鼠</td></tr><tr><td>聚苯乙烯泡沫垫</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>可使用废弃的聚苯乙烯泡沫运输箱盖板（约 4 × 8 英寸或更大）代替。用乙醇擦拭进行消毒。</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td>保持无菌</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td>保持无菌</td></tr><tr><td>纱布垫</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-246069</td><td>保持无菌</td></tr><tr><td>60 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 玻璃培养皿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS7016560</td><td>保持无菌</td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Fisher Scientific</td><td>S95937A</td><td>保持无菌</td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Life Technologies</td><td>21331-020</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热，保持无菌&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1× Mito + Serum Extender</td><td>BD Biosciences</td><td>355006</td><td>在文稿中称为 &quot;浓缩有丝分裂原补充剂&quot;，保持无菌</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/ml）</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td>保持无菌</td></tr><tr><td>Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热，保持无菌&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1051-500ML</td><td>保持无菌</td></tr><tr><td>胰蛋白酶/EDTA 溶液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R-001-100</td><td>使用前在 37 &amp;deg;C 水浴中预热，保持无菌&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>6 孔组织培养板</td><td>Thermo Scientific (Nunc)</td><td>140675</td><td>保持无菌</td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m 注射器滤器</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359904</td><td>保持无菌</td></tr><tr><td>T75 组织培养瓶</td><td>Thermo Scientific (Nunc)</td><td>178905</td><td>保持无菌</td></tr><tr><td>Transwell 小室</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3464</td><td>保持无菌，用于迁移实验</td></tr><tr><td>抗小鼠 Sca-1 抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>FAB1226P</td><td>使用浓度为 10 &amp;micro;l/10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; 个细胞</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD105 抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>FAB1320P</td><td>使用浓度为 10 &amp;micro;l/10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; 个细胞</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD29 抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>FAB2405P-025</td><td>使用浓度为 10 &amp;micro;l/10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; 个细胞</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD73 抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>FAB4488P</td><td>使用浓度为 10 &amp;micro;l/10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; 个细胞</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD44 抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB6127-SP</td><td>使用浓度为 0.25 &amp;micro;g/10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; 个细胞</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD45 抗体</td><td>eBioscience</td><td>11-0451-81</td><td>使用浓度为 5 &amp;micro;l/10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; 个细胞</td></tr><tr><td>抗小鼠 gp38 抗体</td><td>eBioscience</td><td>12-5381-80</td><td>使用浓度为 10 &amp;micro;l/10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; 个细胞</td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250&amp;nbsp;</td><td>保持无菌</td></tr><tr><td>蛋白芯片</td><td>RayBiotech Inc.</td><td>AAM-BLM-1-2</td><td>每种培养基条件（包括阴性对照）使用 1 个芯片，设三个重复</td></tr></tbody></table>

器官条件培养基的制备及其在研究器官特异性对乳腺癌转移行为影响中的应用

Generation of Organ-conditioned Media and Applications for Studying Organ-specific Influences on Breast Cancer Metastatic Behavior

乳腺癌在乳腺癌患者中倾向于转移至淋巴结、骨骼、肺、脑和肝脏。以往的研究主要集中在识别乳腺癌细胞自身固有的因素，这些因素被认为是导致这种特定转移模式（称为器官趋向性）的原因；然而，对于特定器官内部存在的、可能促进这一过程的因素，目前了解甚少。部分原因在于缺乏能够准确模拟器官微环境的体外（in vitro）模型系统。为解决这一问题，已建立一种离体（ex vivo）模型系统，可用于研究不同器官微环境中存在的可溶性因子。该模型通过采集正常无胸腺裸鼠分离出的器官（淋巴结、骨骼、肺和脑）所生成的条件培养基来实现。该模型系统已通过实验证实：不同的乳腺癌细胞系在响应不同器官来源的条件培养基时，表现出细胞系特异性和器官特异性的恶性行为，且该行为与其体内（in vivo）转移潜能相一致。该模型系统可用于鉴定和评估可能影响乳腺癌及其他类型癌细胞转移行为的特定器官来源的可溶性因子，包括对细胞增殖、迁移、类干细胞行为、基因表达等方面的影响，并有助于发现潜在的新型癌症治疗靶点。这是首个可用于深入研究器官特异性转移行为，并评估特定器官来源可溶性因子在驱动癌症转移过程中作用的离体（ex vivo）模型系统。

器官条件培养基的制备
器官分离及制备条件培养基的流程示意图见图1，该操作的代表性照片见图2。需要注意的是，在本方案最初开发阶段，肝脏曾被纳入分析，因为肝脏是乳腺癌转移的常见部位。然而，由于肝脏会产生并分泌大量蛋白酶，很难使其在体外维持足够长的活性以制备高质量的条件培养基。此外，肝脏条件培养基在分离后也不稳定，往往会出现大量蛋白质沉淀，原因可能相同。因此，后续分析中未再包含肝脏。
为特异性制备淋巴结和骨组织条件培养基，可通过显微镜观察分离的基质细胞（LNSCs 和 BMSCs）的细胞形态，并结合标准流式细胞术进行免疫表型分析，以确认其表型。基质细胞在培养中应具有贴壁生长特性，其中 LNSCs 呈细长的成纤维细胞样形态（...

本文描述了一种 离体 由小鼠淋巴结、骨、肺和脑组织来源的条件培养基组成的模型系统。该模型系统可用于鉴定和研究器官来源的可溶性因子及其对癌细胞器官趋向性和转移行为的影响.

乳腺癌在乳腺癌患者中倾向于转移至淋巴结、骨骼、肺、脑和肝脏。以往的研究主要集中在……

本实验的总体目标是利用小鼠的淋巴结、骨骼、肺和脑组织制备条件培养基，以鉴定和研究器官来源的可溶性因子及其对癌细胞转移行为的影响。该方法有助于回答转移领域中的关键科学问题，例如：器官特异性因子如何影响癌细胞的增殖、迁移和基因表达？该技术提供了一个简单直接的离体平台，可真实反映体内器官特异性可溶性因子对癌细胞表型和行为的影响。为了分离淋巴结，首先将一只6至12周龄的小鼠置于无菌组织培养罩内的聚苯乙烯泡沫垫上，并将其四肢固定于伸展位置。接着，使用镊子和剪刀从外生殖器至口腔处沿腹侧中线切开皮肤。然后，轻轻将皮肤从腹肌上剥离，并用大头针固定于解剖垫上。使用剪刀小心地将淋巴结从皮肤、脂肪和血管中分离，并在获取后立即放入 30 毫升预冷的 PBS 中。当所有淋巴结收集完毕后，用镊子和剪刀小心地从暴露的腹壁向上沿胸骨剪开，以暴露胸腔。剪开膈肌。从下方托起肺组织，向气管方向剪断其下方的组织。随后将肺组织转移至盛有冰冻 PBS 的新容器中。此步骤中或器官称重前可将心脏从肺组织上移除。为获取腿部骨骼，将小鼠置于俯卧位，沿下背部从一侧腰部至另一侧腰部切开皮肤。接着，用一块无菌纱布抓住躯干以及覆盖在腿部和足部的皮肤。用同一块纱布固定住一条后肢的下段，在小心折断一只足部的踝关节后，将关节处的皮肤向近端（朝向膝关节方向）剥离。然后，使用剪刀从膝关节处分离胫骨，并将腿骨置于冰上预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中。在获取第二根胫骨后，用镊子固定股骨，用剪刀去除周围的肌肉组织。随后，将腿骨放入冰上预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中。为获取脑组织，使用一块新的无菌纱布抓住头部，用剪刀和镊子轻轻去除皮肤以暴露颅骨。接着，用剪刀从颅骨顶部中央沿直线向下小心剪开枕骨，以暴露后脑部分。然后，从组织下方朝颅骨前部 scoop（撬起），将整个脑组织转移至冰上预冷的 PBS 中。为制备肺组织条件培养基，将肺组织管倒置三次，以去除器官中残留的血液。随后，用新鲜的冷 PBS 取代洗涤液，并重复此步骤直至盐水溶液中无血。接下来，将肺组织转移至每只小鼠一个 60 平方毫米的玻璃培养皿中，并使用两把无菌手术刀片通过反复前后切割将组织切碎。当组织碎片大小约为1立方毫米时，将组织碎片重新悬浮于适量添加了抗生素的DMEM:F12培养基中，并将组织置于6孔板的1个孔中，每只小鼠一孔，在37摄氏度、5% CO2条件下孵育。24小时后，将每个孔中的全部内容物转移至各自的50毫升锥形管中，并用每管三倍体积的新鲜DMEM:F12培养基稀释条件培养基。离心处理各管，以去除任何较大的组织碎片。然后，使用0.22微米注射器滤器将条件培养基汇集至一个50毫升锥形管中。为制备骨髓条件培养基，将骨骼转移至无菌细胞培养超净台中，并切除骨骼上的多余组织。用剪刀切除骨骺端。然后，使用27½号针头将1毫升PBS冲洗通过每根骨骼的髓腔，收集至含有新鲜PBS的离心管中。当所有骨髓基质细胞收集完毕后，用PBS洗涤细胞三次。最后一次洗涤后，将细胞沉淀重悬于20毫升骨基质细胞生长培养基中，该培养基需添加10%胎牛血清，按每T75培养瓶接种10毫升细胞。当细胞生长至约70%融合度时，用三毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞培养物两次。随后，加入三毫升0.025%胰蛋白酶/EDTA溶液使细胞脱离，注意确保胰蛋白酶溶液覆盖整个培养瓶表面。消化两到三分钟后，加入三毫升骨基质细胞生长培养基以终止酶反应，并将细胞收集至50毫升离心管中。离心收集细胞，然后将沉淀重悬于10毫升新鲜培养基中。随后，按1:5的比例将细胞传代至3个新的T75培养瓶中，培养至细胞融合度达到70%。然后，用 PBS 按照刚刚演示的方法洗涤细胞三次，并加入无血清的骨基质细胞培养基，该培养基需补充有丝分裂原和抗生素，继续培养 72 小时。培养至第三天后，将培养基通过 0.22 微米滤器收集。基质细胞在培养中应呈贴壁生长，其中淋巴结基质细胞培养物中可见细长、成纤维细胞样的形态，而骨髓基质细胞培养物则呈现较小且更圆润的形态。流式细胞术分析证实，淋巴结基质细胞大多为CD45阴性且gp38阳性。骨髓基质细胞应表达CD-44和CD-29，弱表达CD-105和Sca-1，不表达CD-73。具有不同遗传背景的人乳腺癌细胞在趋向特定器官环境时表现出差异性的迁移和生长模式。例如，在本项代表性实验中，嗜骨性的231-BoM细胞亚系相较于脑和肺条件培养基，更倾向于迁移至骨髓条件培养基。类似地，嗜肺性的231-LM2细胞亚系相较于骨髓和脑条件培养基，更倾向于迁移至肺条件培养基。此外，RT-qPCR分析表明，亲代MDA-MB-231乳腺癌细胞在暴露于骨或肺条件培养基后，会诱导与乳腺癌细胞在体内发生骨或肺特异性转移相关的基因表达上调。一旦掌握，若操作得当，组织收获和条件培养基的制备可在两到三小时内完成。后续几天的传代培养步骤每天需 15 至 30 分钟。进行这些操作时，重要的是始终注意保持所有操作无菌。在制备条件培养基后，可进一步采用蛋白芯片、细胞增殖与迁移实验、肿瘤球形成实验以及逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）等方法，以探究器官特异性因子对癌细胞行为的影响。该技术建立后，为乳腺癌研究领域的科研人员提供了在体外模型系统中研究器官特异性转移行为的新途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何利用小鼠的骨骼、肺和脑组织制备条件培养基。请注意，使用锋利的解剖工具可能存在危险，因此在进行此操作时，应始终采取预防措施，例如采用精确而谨慎的解剖技术。

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