Name: 同基因小鼠黑色素瘤细胞注射，以确定其在肺转移潜能 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: 学习使用B16-BL6黑色素瘤细胞通过尾静脉注射建立小鼠肺转移模型。该方法可确定最佳细胞密度为每毫升25万个细胞，用于研究免疫治疗对肺部免疫反应的影响及评估抗癌转移药物效果。

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部分由美国国家癌症研究所资助项目 1R03CA172923 支持。

伦理声明：在研究中使用小鼠仅在可能促进人类对基础生物学的理解或最终疾病治疗的情况下才是可接受的。
1. 订购
<ol>
	<li>购买6至8周龄的雌性C57BL/6小鼠，每组5只。让小鼠适应数天。</li>
</ol>
2. B16-BL6 细胞的制备
<ol>
	<li>从37摄氏度培养箱中取出细胞培养板，放入无菌操作台。此时培养板中的B16-BL6小鼠黑色素瘤细胞融合度应约为70%。过高的融合度可能改变细胞的转移潜能。</li>
	<li>每块培养板加入1 ml 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，静置1分钟，然后吸除胰蛋白酶-培养基混合液。</li>
	<li>每块培养板再加入1 ml胰蛋白酶溶液，并将培养板放回培养箱中孵育10分钟。</li>
	<li>将培养板从培养箱转移至无菌操作台后，向每块培养板中加入4 ml无血清的罗斯韦尔公园纪念研究所培养基（RPMI）。</li>
	<li>使用无菌电动移液器收集细胞。将移液器枪头以轻微倾斜的角度紧贴培养板底部反复吹打，使细胞充分解离。重复多次，以确保细胞团块充分分散，避免堵塞后续注射针头。重新收集细胞悬液并转移至50 ml锥形管中。</li>
	<li>使用血细胞计数板测定细胞密度。在保持B16-BL6细胞总数不变的前提下，计算所需无血清RPMI培养基的体积，以配制终浓度分别为0、0.065、0.015、0.25和0.5×10⁶个细胞/ml的细胞悬液。</li>
	<li>将50 ml锥形管中的细胞悬液等量分装至15 ml锥形管中。在2,250 × g离心5分钟。弃去上清液。加入适量无血清RPMI培养基，通过血细胞计数板确认目标细胞密度。根据需要，通过添加额外RPMI或离心后重悬于较小体积中，调整细胞密度。</li>
	<li>将每种细胞悬液各500 µl分装至预先标记并置于冰上的1.8 ml离心管中。</li>
</ol>
3. 尾静脉注射
<ol>
	<li>取一只小鼠，抓住其尾巴，将其尾部朝向引导进入小鼠固定器中。将躯干置于固定器主腔内，尾巴留在外侧，将小鼠拉向固定器末端。插入固定器推杆，持续推动直至小鼠被牢固固定。</li>
	<li>将小鼠旋转&#160;90度，使一侧尾侧静脉朝上。使用酒精棉片用力擦拭小鼠尾巴侧面，特别是尾静脉最清晰可见的区域。 
	注意：良好的照明对于在B57BL/6J小鼠上有效观察尾静脉至关重要。加热灯或加热手术垫虽非必需，但可通过扩张尾静脉体积而提供帮助。</li>
	<li>在无菌培养罩内，从浓度为2百万细胞/毫升的试管中吸取300 µl细胞培养基。翻转针头，轻弹侧面并推动推杆，以排出注射器内的气泡。排出部分培养-RPMI，使最终体积为250 µl。</li>
	<li>用非惯用手伸直小鼠尾巴。用非惯用手的食指托起尾巴近端，拇指压住远端，使尾巴保持伸展状态。 
	注意：通过此方式，尾静脉可保持在侧向位置，与固定器表面平行，便于在尾巴更远端的位置进行一致的穿刺进入。</li>
	<li>将针头以微小的向下角度刺入尾静脉，起始时朝向远端，随着进一步插入，调整针头方向以匹配尾静脉的走向（相对于针头降低注射器推杆端）。</li>
	<li>将针头插入尾静脉约1 cm。插入后开始推动推杆，同时保持针头稳定。 
	注意：若针头位于尾静脉内且针尖未受阻，培养基应顺畅流入静脉，无任何阻碍。&#160;有效注射的特征是静脉内血液被迅速冲走。若感到阻力，或注射部位开始形成气泡，应立即拔出针头，并在尾静脉更近端的位置重新尝试。&#160;</li>
	<li>拔出针头并丢弃。用纱布按压穿刺部位以止血。</li>
	<li>取出固定器的推杆，将小鼠放入受体笼中。</li>
	<li>对所有其他浓度重复上述操作。 
	注意：肺部病灶的形成大约需要2至3周，具体时间因细胞系及所需病灶大小而异。9&#160;在此期间，应持续监测小鼠是否出现需提前实施安乐死的症状，例如过度喘息。&#160;</li>
</ol>
4. 计数肺部病灶
<ol>
	<li>将小鼠放入 CO2 安乐死舱，以每分钟 10-30% 舱体体积的速度通入 100% CO2，持续 5 分钟，随后进行颈椎脱臼。&#160;</li>
	<li>将小鼠仰面固定于泡沫板上，使用手术剪沿胸骨做手术切口。</li>
	<li>从胸骨切口顶端向小鼠双肩方向分别做两个附加切口，暴露肋骨 cage。</li>
	<li>沿胸骨两侧各做一剪切，移除肋骨 cage，暴露肺和心脏。</li>
	<li>用手术镊夹住心脏，剪断食管和气管，将心脏和肺从小鼠体内分离。将组织置于解剖显微镜下，在 10 倍放大倍数下观察，以获得更清晰的视野。</li>
	<li>将心脏从肺组织中分离，并移除胸腺，仅保留两片肺。</li>
	<li>在解剖显微镜下观察肺组织，开始计数肺部病灶。每个病灶应表现为肺表面圆形的棕褐色突起。
	<ol>
		<li>为保证小鼠间计数的一致性，先计数肺叶表面的病灶数量，然后翻转该肺叶。依次单独处理四个肺叶，有助于更准确地计数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如需进行免疫组化（IHC），则保存并固定肺组织；否则，丢弃剩余组织。</li>
</ol>

<ol><li>Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+cancer+cell+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A perspective on cancer cell metastasis.</a> Science. 331, 1559-1564 (2011).</li>
<li>Kalluri, R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basics+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">The basics of epithelial-mesenchymal transition.</a> J Clin Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).</li>
<li>Stetler-Stevenson, W. G., Aznavoorian, S., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+interactions+with+the+extracellular+matrix+during+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor cell interactions with the extracellular matrix during invasion and metastasis.</a> Annu Rev Cell Biol. 9, 541-573 (1993).</li>
<li>Allard, W. J., Matera, J., Miller, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cells+circulate+in+the+peripheral+blood+of+all+major+carcinomas+but+not+in+healthy+subjects+or+patients+with+nonmalignant+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant disease.</a> Clin Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).</li>
<li>Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunoediting%3A+from+iimmunosurveillance+to+tumor+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cancer immunoediting: from iimmunosurveillance to tumor escape.</a> Nat Immunol. 3, 991-998 (2002).</li>
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<li>Hodi, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+survival+with+Ipilimumab+in+patients+with+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22NEJM%22%5BJournal%5D)">Improved survival with Ipilimumab in patients with metastatic melanoma.</a> NEJM. 363 (13), 711-723 (2002).</li>
<li>Ekwueme, D. U., Guy, G. P., Li, C., Rim, S. H., Parelkar, P., Chen, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+health+burden+and+economic+costs+of+cutaneous+melanoma+motality+by+race%2Fethnicity-United+States%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Acad.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">The health burden and economic costs of cutaneous melanoma motality by race/ethnicity-United States.</a> J. Am. Acad. Dermatol. 65, 5 Supple 1 133-143 (2011).</li>
<li>Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis+review%3A+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Tumor.+Bio.Volume%22%5BJournal%5D)">Metastasis review: from bench to bedside.</a> Tumor. Bio.Volume. 35, 8483-8523 (2014).</li>
<li>Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+metastasis+predetermined%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Is metastasis predetermined.</a> Mol. Oncol. 1 (3), 263-264 (2007).</li>
<li>Ishiguro, T., Nakajima, M., Naito, M., Muto, T., Tsuruo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+differentially+expressed+in+B16+murine+melanoma+sublines+with+different+metastatic+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of genes differentially expressed in B16 murine melanoma sublines with different metastatic potentials.</a> Cancer Res. 56 (4), 875-879 (1996).</li>
<li>Clark, E. A., Todd, R. G., Lander, E. S., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+metastasis+reveals+an+essential+role+for+RhoC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC.</a> Nature. 406, 532-535 (2000).</li>
<li>Terranova, V. P., Hic, S., Diflorio, R. M., Lyall, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Oncol.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Tumor cell metastasis.</a> Crit. Rev. Oncol. Hematol. 5 (2), 87-114 (1986).</li>
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<li>Hagedorn, H. G., Bachmeier, B. E., Nerlich, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+degradation+of+basement+membranes+and+extracellular+matrix+and+their+regulation+by+TGF-beta+in+invasive+carcinomas+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Synthesis and degradation of basement membranes and extracellular matrix and their regulation by TGF-beta in invasive carcinomas (Review).</a> Int. J. Oncol. 18 (4), 669-681 (2001).</li>
<li>Hart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+selection+and+characterization+of+an+invasive+variant+of+the+B16+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">The selection and characterization of an invasive variant of the B16 melanoma.</a> Am J Pathol. 97 (3), 587-600 (1979).</li>
<li>Overwijk, W. W., Restifo, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N.P.+B16+as+a+Mouse+Model+for+Human+Melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">N.P. B16 as a Mouse Model for Human Melanoma.</a> Curr Protoc Immunol. 20 (1), (2001).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

通过尾静脉注射的循环肿瘤细胞代表了那些逃避原发灶生长部位，并通过血液或淋巴系统等途径迁移的转移细胞，偶尔会在远端位置的毛细血管床中定植。14 上述方案可作为继发性转移的模型。在注射适量B16-BL6细胞的情况下，实验人员可评估给药药物或免疫细胞群体在中和处理后对癌细胞转移的相对影响。
该方案存在局限性。循环肿瘤细胞因其具有转移能力而被筛选出来，因此不具备免疫原性，其主要组织相容性复合体I类分子水平较低12。此外，大量转移灶突然且成簇地出现，与患者体内典型的转移过程不同，在后者中，少量转移性肿瘤细胞会从原发肿瘤部位在较长时间内逐渐播散。另外，通过静脉注射引入的肿瘤细胞来源于组织培养，而非原发性肿瘤。因此，这些细胞与因细胞黏附、迁移、免疫识别及在受体器官定植等过程发生改变而形成的继发性转移灶存在差异15,16。
另一种方案是皮下注射B16/BL6细胞以生成原发性肿瘤，并分析由此产生的&#34;自发性&#34;肺转移灶。研究发现，这些&#34;自发性&#34;转移灶比&#34;实验性&#34;转移灶具有更高的异质性，更接近人类患者的转移特征。该方案在评估实验化合物对转移影响方面存在局限性。通过侧尾静脉注射，可使用血细胞计数板估算注入血液中的黑色素瘤细胞数量；然而，在&#34;自发性&#34;转移模型中，肿瘤之间的异质性更大，导致最终肺部病灶数量增加了额外的变异性。16
综上所述，尾静脉注射B16-BL6小鼠黑色素瘤模型是一种用于评估治疗或免疫疗法对转移影响的简单模型。通过静脉注射循环肿瘤细胞，研究人员可在一定程度上模拟患者在肿瘤转移后的状态。鉴于转移性肿瘤细胞对癌症患者具有破坏性作用，该模型是研究转移多步骤过程的有力工具。

转移是恶性肿瘤患者死亡的主要原因。癌细胞的转移扩散过程尚不完全清楚，但似乎涉及多个步骤，包括侵入邻近组织、进入淋巴系统和血管系统、在循环系统中存活并迁移、从转移部位的血管中渗出、适应新位点的微环境，以及通过增殖形成继发性肿瘤1。这些生物学事件均涉及转移性肿瘤细胞的转化、播散和存活。例如，肿瘤细胞从上皮表型向间充质表型转化，并与细胞外基质成功相互作用，使其能够侵入邻近组织并扩散至身体其他部位2,3。此外，这些转移性细胞必须在循环血液中存活，并逃避免疫系统的监视4,5。最后，当肿瘤细胞植入体内远端部位时，必须适应其微环境，才能增殖并形成继发性肿瘤6,7。因此，尽管转移在癌症患者中是一种常见现象，但转移性肿瘤细胞存在多个可被治疗干预的脆弱环节。
鉴于黑色素瘤具有免疫原性，以及近年来对免疫疗法的关注，黑色素瘤模型正变得越来越有价值。8 仅在美国，黑色素瘤每年估计导致约9,000人死亡。9 黑色素瘤常见的转移部位包括骨骼、脑、肝脏和肺。大多数远处转移通过血液传播发生。循环中的肿瘤细胞必须逃避免疫清除，到达远端器官的毛细血管床，并穿过血管内皮细胞，才能成功定植。4-7,10, 11
为了模拟常见的高致病性转移现象，研究人员建立了小鼠B16-BL6细胞系。B16-BL6是亲代C57BL/6黑色素瘤细胞系B16-F0的衍生细胞系，经过连续10次通过尾静脉注射筛选肺转移能力（获得B16-F10），再经过连续6次筛选膀胱膜穿透能力而最终获得12。因此，该细胞系是建立小鼠转移灶的可靠黑色素瘤细胞系，尤其适用于尾静脉注射13。
将足量的B16-BL6细胞注射到B57BL/6小鼠尾静脉后，经过两周或更长时间以允许B16/BL6细胞植入并生长，肺部将形成转移灶。在实施安乐死后，通过解剖显微镜观察，可对存在的单个转移灶数量进行定量。由此可建立剂量-转移效应关系，因为注射的B16-BL6细胞数量与肺表面形成的转移灶数量相关。该模型被称为&#34;实验性转移&#34;，即将已知具有转移能力的细胞直接引入血液循环，从而促进其在肺、肝或其他研究器官中快速且可预测地扩散和定植。这与&#34;自发性转移&#34;相对，后者通常将肿瘤细胞植入皮下，转移灶则起源于自然脱落的癌细胞。14,15
向小鼠尾静脉注射适量的 B16/BL6 细胞至关重要。注射细胞过多，肺部将布满转移灶，相邻病灶之间将难以区分；注射过少，则由于不同注射操作之间固有的差异，治疗剂的作用效果将无法被察觉。为了在 C57BL/6 小鼠肺部获得数量理想的病灶，有必要将注射的细胞数量与肺表面形成的转移性病灶数量相关联，同时考虑各个病灶的可分辨性。本方案将演示一种用于 C57BL/6 小鼠的转移性小鼠黑色素瘤模型。

<table><tbody><tr><td>胰蛋白酶</td><td>Corning</td><td>MT25052CV</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Corning</td><td>MT15040CM</td><td></td></tr><tr><td>相差血细胞计数板</td><td>Hausser</td><td>02-671-54</td><td></td></tr><tr><td>微型精细胰岛素注射器（IV型）</td><td>BD</td><td>14-829-1D</td><td></td></tr><tr><td>无菌酒精消毒片</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>小鼠固定器</td><td>Braintree Scientific</td><td>NC9999969</td><td>固定器的选择取决于小鼠的年龄/体型</td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Harry Schein</td><td>NC0012697</td><td>可选</td></tr></tbody></table>

注射同源小鼠黑色素瘤细胞以评估其在肺部的转移潜能

Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

大约90%的人类癌症死亡与转移有关。尽管癌症转移普遍存在且危害严重，但目前仍缺乏有效的治疗或预防手段。本文报道了一种在小鼠中建立肺转移的方法，可用于研究这一现象。将B16-BL6细胞通过尾静脉注射到C57BL/6J小鼠体内，是黑色素瘤转移研究中最常用模型之一。部分循环肿瘤细胞会在小鼠肺部定植，形成“实验性”转移灶。利用该模型可评估治疗药物对癌症转移发展的相对影响。通过比较经治疗与未治疗小鼠肺部转移灶数量的差异，可判断抑制转移的效果。然而，在开展药物干预研究之前，必须首先确定用于定量分析转移灶的B16-BL6细胞最佳接种数量。注射过多细胞可能导致转移灶过度增多，影响准确定量，并掩盖抗癌疗法的作用效果；而注射过少细胞则会妨碍治疗组与对照组之间的有效比较。

通过肉眼观察，表面病灶的差异显而易见。在解剖显微镜下计数肿瘤数量，应能获得注射肿瘤细胞数与形成且可计数的病灶数之间的线性关系。使用最佳数量的可注射细胞时，应达到肺部既不被完全覆盖（如图1A中500,000个细胞/ml的情况），也不过于稀疏（如62,500个细胞/ml和125,000个细胞/ml的情况）。这一结果也可通过线性相关性进行量化（图1B）。
<img alt="显示细胞注射效应的肺部黑色素瘤边界示意图；实验性肿瘤生长比较。" src="/files/ftp_upload/54039/54039fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 尾静脉注射B16/BL6细胞后小鼠肺部病灶结果。(A) 在C57BL/6小鼠肺表面可观察到呈褐色圆形团块的肺部病灶（箭头下方为典型病灶示例）。随着注射细胞培养物密度（每张图像上方）的增加，相应出现的肺部病灶数量（每张图像下方）也随之增多。注射细胞密度最高的小鼠，其肺部病灶的肉眼可见覆盖范围最大。比例尺表示20 mm。(B) 肺部病灶数量与细胞培养密度的关系。根据血细胞计数板测定，当细胞密度高于125,000 个/ml时，二者之间呈近似线性关系。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54039/54039fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

转移在癌症的致病性中起着至关重要的作用，据估计导致约90%的癌症死亡。我们报道了一种用于小鼠的转移性黑色素瘤模型方案，该模型可用于评估治疗药物针对这一临床现象的有效性。

约90%的人类癌症死亡与转移有关。尽管癌症转移发生率高且危害严重，但目前仍缺乏针对转移的治疗药物或……

本实验的总体目标是展示一种在黑六小鼠体内生成转移性肿瘤的方法。该方法有助于回答免疫治疗领域中的一些关键问题，例如研究性药物如何影响肺部的免疫反应。该技术的主要优势在于其实验性转移特性。因此，结果是可靠且相对一致的。首先，将处于约70%汇合度的B16-BL6黑色素瘤细胞培养物放入无菌操作台中。接着，向每皿中加入1毫升0.5%胰蛋白酶EDTA溶液，静置细胞1分钟。吸出该溶液后，向每块培养板中加入一毫升胰蛋白酶，然后将细胞放回培养箱。10分钟后，将细胞转移至无菌操作台，向每块培养板中加入四毫升无血清RPMI培养基。随后用无菌电动移液器收集细胞。为打散可能堵塞喷射针头的细胞团块，将移液器尖端抵住培养皿底部并排出细胞。重复此操作数次后，重新收集细胞并转移至15毫升锥形管中。随后取出少量细胞悬液，加入血细胞计数板，测定细胞密度。将细胞悬液等量分装至四个15毫升离心管中。随后离心，弃去上清液。接着为每根离心管标记不同的细胞密度：0、0.063、0.125、0.25 或 0.5 × 10⁶ 个细胞/毫升。然后向每个锥形管中加入适量的无血清RPMI培养基，以达到所需的终浓度。使用血细胞计数板确认目标细胞密度。接着，将每种细胞悬液各500微升分装至预先标记并置于冰上的1.8毫升离心管中。在制备好所有 B16-BL6 细胞悬液后，选择一只小鼠。抓住其尾巴，将小鼠尾部朝前引导进入固定器中。当小鼠躯干进入主腔室且尾巴位于装置外时，继续将动物向固定器末端拉出。接下来，插入固定器推杆并继续推动推杆，直至小鼠被牢固固定。动物固定到位后，将小鼠旋转90度，使其中一条侧尾静脉朝上。然后使用酒精棉片用力擦拭小鼠尾部静脉最清晰可见的一侧。注射前准备：首先，用注射器吸取300微升浓度为每毫升50万个细胞的悬浮液。随后，将注射器倒置，轻弹管壁并推动活塞，以排出其中的气泡。待气泡完全排出后，推出部分细胞悬液，使注射器内最终体积为250微升。用非优势手拉伸小鼠尾巴，以食指抬起尾巴近端，拇指下压远端部分。用优势手将针头以微小的向下角度插入尾静脉，方向朝向尾巴远端。然后将针头进一步插入，调整角度使其与尾静脉的走向一致。当针头进入尾静脉约1厘米后，在保持注射器稳定的同时开始推动活塞。操作完成后，用纱布按压穿刺部位以止血。细胞悬液注射完毕后，将针头从静脉中取出并丢弃。接着，从固定器中取出推杆，将小鼠放入接收笼中。本方案旨在确定注射B16-BL6细胞的最佳数量，以建立一种有效的转移性黑色素瘤模型。图中箭头所示为注射五种不同细胞密度后 2 至 3 周在肺部形成的实验性病灶。当注射浓度为每毫升 500,000 个细胞时，病灶完全覆盖肺组织。本示例中计数到 102 个病灶。相比之下，当每毫升注射 62,500 个细胞或 125,000 个细胞时，肺部仅有少量病灶分布。相应地，这些密度导致肺部病灶数量分别为 1 个和 17 个。通过该方法确定，最佳注射细胞浓度为每毫升 250,000 个细胞。该密度可使肺组织出现约65个病灶，此数量下器官既不会被病灶完全覆盖，也不会过于稀疏。将上述数据进一步计数并作图后表明，当细胞培养密度高于每毫升125,000个细胞时，肺部病灶数量与细胞密度之间呈现出近似线性的关系，如图所示。一旦掌握该技术，操作时间可控制在一小时以内，具体时长取决于小鼠数量及操作是否规范。在进行操作时，重要的是要尽量保证每只小鼠注射的细胞数量相等。完成该操作后，可进一步实施其他方法，例如药物递送，以回答潜在治疗方法如何影响所形成病灶数量等问题。该技术建立后，为癌症研究者探索黑色素瘤在C57BL/6小鼠中转移性癌症的组成成分提供了重要途径。观看本视频后，您应充分了解如何收集和制备 B16-BL6 细胞、固定小鼠、准备注射针头，并向每只小鼠尾静脉注射等量的细胞。请务必注意，操作哺乳动物细胞培养物和针头具有极高的危险性，必须始终采取预防措施，例如避免针刺伤以及佩戴防护装备。

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同基因小鼠黑色素瘤细胞注射，以确定其在肺转移潜能

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实验性转移检测

本视频介绍了一种通过尾静脉注射将标记的癌细胞注入小鼠模型的技术。我们进一步利用实时成像监测乳腺癌转移灶的形成与生长过程 体内...

尾静脉注射：小鼠模型中用于转移性研究的癌细胞接种方法

在本视频中，通过尾静脉将黑色素瘤细胞静脉注射到小鼠模型体内。这些黑色素瘤细胞随后经循环系统迁移，适应远端微环境，并在肺等器官中引发转移。...

实验性黑色素瘤转移小鼠模型：研究黑色素瘤细胞肺转移潜能的平台

本文介绍了研究肺泡巨噬细胞在癌症转移中功能的模型和方法。为了阐明这些细胞在转移过程中的作用，采用了同源性乳腺癌（4T1）模型，并结合使用氯膦酸盐脂质体耗竭肺泡巨噬细胞。...

研究肺泡巨噬细胞在乳腺癌转移中的作用

本文介绍一种简单、微创且易于操作的方法，将乳腺癌细胞植入小鼠乳腺脂肪垫中。该小鼠原位乳腺癌模型具有适当的乳腺脂肪垫微环境，可用于研究癌症的多个方面。...

将乳腺癌细胞原位注射至小鼠乳腺脂肪垫

静脉注射癌细胞常用于转移性研究，但转移性肿瘤负荷的分析往往较为困难。本文中，我们展示了一种通过尾静脉注射建立转移模型的方法，并介绍了一种分析由此产生的肺转移性肿瘤负荷的新方法。...

肿瘤细胞侧尾静脉注射后肺转移的病理学分析

本文描述了一套用于检测黑色素瘤转移新型候选介质及其作用机制的技术流程。...

一种用于鉴定黑色素瘤转移新介质的可靠发现平台

该论文描述了一种方法，用于建立原位注射乳腺肿瘤后自发性肺转移模型，并对转移级联各阶段进行纵向生长监测，适用于干预转移过程的各个阶段。...

体内成像检测原位注射乳腺肿瘤细胞的自发性肺转移

本方案介绍了一种利用表达Flt3L的B16-F10黑色素瘤细胞进行细胞型肿瘤疫苗接种的癌症免疫治疗模型。该方案演示了包括培养肿瘤细胞的制备、肿瘤植入、细胞辐照、肿瘤生长测量、瘤内免疫细胞的分离以及流式细胞术分析在内的各项操作步骤。...

利用造血细胞因子进行肿瘤疫苗接种的实验性黑色素瘤免疫治疗模型

本文描述了在动物模型中将携带RNA寡核苷酸的磁性氧化铁纳米颗粒递送至转移性乳腺癌的体内给药方案，为癌性核酸的治疗性沉默提供了一种具有临床可行性的方法。...

监测纳米药物在小鼠乳腺癌转移灶中的蓄积

肺癌新疗法研发面临的主要挑战之一在于，当局部疾病进展为转移性疾病时，如何对肿瘤微环境进行有效建模。本文介绍一种建立肺癌同系正位模型的简便方法，该方法能够实现 体内...

一种建立同基因型小鼠肺肿瘤原位模型的微创方法

学习使用B16-BL6黑色素瘤细胞通过尾静脉注射建立小鼠肺转移模型。该方法可确定最佳细胞密度为每毫升25万个细胞，用于研究免疫治疗对肺部免疫反应的影响及评估抗癌转移药物效果。

注射同源小鼠黑色素瘤细胞以评估其在肺部的转移潜能

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