同基因小鼠黑色素瘤细胞注射，以确定其在肺转移潜能

该程序的总体目标是展示一种在黑色 6 只小鼠中产生转移性肿瘤的方法。这种方法可以帮助回答免疫治疗领域的关键问题，例如研究药物如何影响肺部的免疫反应。这种技术的主要优点是它是实验转移。

所以结果是可靠的，而且相对一致。首先，将 B16-BL6 黑色素瘤细胞的培养物（应达到约 70% 汇合度）置于无菌罩中。接下来，向每个培养皿中加入 1 毫升 05% 胰蛋白酶 EDTA，并将细胞放置 1 分钟。

吸出该溶液后，继续向每个板中加入 1 mL 胰蛋白酶，然后将细胞放回培养箱中。10 分钟后，将细胞移至无菌罩中，并向每个板中加入 4 mL 无血清 RPMI 培养基。然后用无菌电动移液器收集细胞。

要打碎可能堵塞弹出针的团块，请将移液器的尖端压在板的底部并排出细胞。重复此过程几次后，回收细胞并将其转移到 15 毫米锥形管中。然后取出细胞悬液样品，将其引入血细胞计数器，并确定细胞密度。

EqualLy 将细胞悬液分配到四个 15 mL 试管中。然后离心试管，然后倒出上清液。继续用不同的细胞密度标记每个试管 - 0、0.063、0.125、0.25 或 50 万个细胞/毫升。

然后向每个锥体中加入适当体积的无血清 RPMI 以产生这些最终浓度。使用血细胞计数器确认所需的细胞密度。接下来，将每种悬浮液的 500 微升分配到放置在冰上的标记 1.8 毫升试管中。

准备好所有 B16-BL6 细胞悬液后，选择一只小鼠。抓住它的尾巴，先将动物的后部引导到约束装置中。当老鼠的躯干在主腔室中，尾巴在设备外时，继续将动物拉向约束装置的末端。

接下来，插入限制器柱塞并继续推动柱塞，直到鼠标固定。动物就位后，将鼠标旋转 90 度，使其中一个侧尾静脉朝上。然后使用酒精垫大力清洁小鼠尾巴静脉最明显的一侧。

为了准备注射，首先将每毫升 050 万个细胞的 300 微升悬浮液收集到注射器中。然后，通过倒置注射器、轻弹其侧面并推动柱塞从注射器中弹出气泡。去除气泡后，弹出细胞培养物，在注射器中产生 250 μL 的最终体积。

继续用非惯用手伸展鼠标尾巴。握住它，使食指抬高尾巴的近端，拇指压低远端。用惯用手，将针头以微小的向下角度插入尾巴远端的静脉中。

然后进一步插入针头，调整它以使其与尾静脉的角度相匹配。将针头插入尾静脉约 1 厘米后，开始推动柱塞，同时保持注射器稳定。将纱布抵住入口部位以止血。

细胞悬液弹出后，从静脉中取出针头并丢弃。接下来，从限制器上取下柱塞，并将鼠标放入接收器笼中。该协议旨在确定要注射的 B16-BL6 细胞的最佳数量，以创建有用的转移性黑色素瘤模型。

这里显示的是实验病灶，由注射 5 种不同细胞密度后 2 到 3 周在肺部形成的箭头表示。当每毫升注射 500， 000 个细胞时，病灶完全覆盖了肺部。在此处显示的示例中，计数了 102 个病灶。

相比之下，当注射每毫升 62， 500 个细胞或每毫升 125， 000 个细胞时，肺部仅稀疏地被病灶覆盖。这些密度分别导致肺病灶计数为 1 和 17。使用这种方法，确定要注射的细胞的最佳浓度为每毫升 250， 000 个细胞。

这种密度导致肺大约有 65 个病灶，在这个数字上，器官既没有被病灶完全覆盖，也没有被病灶太稀疏地覆盖。绘制时对这些数据的进一步列举表明，肺病灶与每毫升 125， 000 个细胞以上的细胞培养密度之间存在近似线性关系，如图所示。一旦掌握，这项技术可以在一小时内完成，如果执行得当，取决于小鼠的数量。

在尝试手术时，重要的是要记住尝试为每只小鼠注射相同数量的细胞。在此程序之后，可以执行其他方法，例如药物输送，以回答潜在疗法如何影响许多结果病灶等问题。开发后，这项技术为癌症研究人员探索黑色六只小鼠黑色素瘤中转移性癌症的成分铺平了道路。

看完这个视频，你应该对如何收集和制备 B16-BL6 细胞、抑制小鼠、准备针头以及将等量数量的细胞注射到每个尾静脉中有了很好的了解。不要忘记，使用哺乳动物培养物和针头可能非常危险，应始终采取预防措施，例如避免针刺和佩戴防护装备。