Name: Estendida Time-lapse Imagem intravital do Real-time multicelular Dynamics no microambiente tumoral (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Aprenda a usar microscopia intravital multiphóton para visualizar dinâmicas celulares em tempo real no microambiente tumoral. Esta técnica permite medir a permeabilidade vascular e interações multicelulares com resolução de célula única.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esta pesquisa foi apoiada pela mama Departamento de Defesa Cancer Research Program sob o número prêmio (ASH, W81XWH-13-1-0010), NIH CA100324, CA100324 PPG, e do Programa Integrado Imaging.

Todos os procedimentos descritos devem ser realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos para o uso de animais vertebrados, incluindo a aprovação prévia do Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care e do Comitê Use. 1. Geração de fluorescência Tumores marcados e macrófagos associados a tumores <ol><li> Gerar células tumorais com marcação fluorescente, atravessando o autóctone rato geneticamente modelo espontânea, mamária câncer de onde o mouse mamária vírus do tumor repetição terminal longa impulsiona o antígeno polioma meio T (MMTV-PyMT) com camundongos transgênicos com repórteres fluorescentes [isto é, reforçada verde fluorescente proteínas (EGFP), reforçada proteína ciano fluorescente (ECFP) ou Dendra2] 8,9. </li><li> Macrófagos etiqueta fluorescente em animais PyMT com fluorescente etiquetado células tumorais através do cruzamento modelos de ratos geneticamente modificadas com repórteres fluorescentes específicos myeloid- e macrófago [ie, MacGreen 15 ou ratos MacBlue Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16]. </li><li> Alternativamente, geram fluorescente etiquetado tumores através de transplante ortotópico de células tumorais com marcação fluorescente PyMT (singï¿½icos), linhas celulares de cancro da mama humano ou tumores paciente humano derivados primários (xenoenxertos) 11,17. <ol><li> Implante marcado por fluorescência de células tumorais em ratinhos singeneicos PyMT com células mielóides marcado com proteínas fluorescentes para gerar animais com células tumorais marcado por fluorescência e as células mielóides 13. </li></ol></li><li> Injectar 100 ul de 10 mg / kg fluorescente 70 kDa dextrano por via intravenosa (iv) na veia da cauda em ratinhos imunodeficiência combinada grave (SCID) com tumores de xenoenxerto de linhas de células humanas ou tumores primários derivados de paciente para macrófagos etiqueta fluorescente 2 h antes do início de imagens intravital. </li></ol> 2. Setup microscópio e Imagem Preparação Nota: Este procedimento descreve o set-uppara geração de imagens intravital em um microscópio multiphoton 8. <ol><li> Ligue todos os componentes do microscópio e laser, incluindo lasers de dois fótons e os detectores. </li><li> Ligue a caixa de aquecimento a 30 ° C, para pré-aquecer o estágio. Este passo é essencial para manter a temperatura fisiológica do animal. </li><li> Para uso em um local microscópio invertido a inserção estágio feito por encomenda no palco microscópio. O acessório personalizado é uma folha de 1/8 &quot;de espessura de alumínio usinado para caber no espaço fase de inserção e com um diâmetro 1&quot; através de buracos no centro para a imagem latente. <ol><li> Limpe a platina do microscópio e inserção fase com 70% de etanol e seca ao ar. </li><li> Coloque uma grande queda de água no 20X, 1,05 NA objetivo microscópio para manter contato óptico com a tampa de vidro. </li><li> tampa de vidro Place (# 1.5 espessura) sobre o porto de imagem na inserção palco microscópio. Fixe no lugar com fita laboratório. </li><li> Use um furador para perfurar de 2 cm x 2 cm, buraconuma almofada de borracha flexível e colocar a almofada de borracha sobre a platina do microscópio, com o furo no bloco alinhado com o orifício na inserção fase costume. </li></ol></li></ol> 3. Preparação de cauda veia cateter e Reagentes para injecção durante o exame <ol><li> Cortar um comprimento de 30 cm de tubagem de polietileno (PE). </li><li> Utilizando uma pinça, mover a agulha de metal de uma agulha G 31 e para trás até que ele quebra da montagem de plástico. </li><li> Usando pinças, inserir a extremidade cega da agulha individual para o tubo de PE. </li><li> Inserir uma agulha G 31 na outra extremidade do tubo de PE. </li><li> Encha uma seringa de 1 cc com fosfato de solução salina estéril tamponada (PBS) e inseri-lo na agulha G 31 e liberar todo o ar para fora do tubo e agulha com PBS. PBS é utilizado para manter a hidratação e a osmolaridade do sangue 9,18, também pode ser usado solução salina isotónica no entanto. </li><li> Encha uma seringa de 1 cc com 200 ul de 3 mg / kg 155 kDa dextrano-tetrametilrodamina (TMR) Ou pontos quânticos para a rotulagem vascular. </li><li> Preparar todas as outras proteínas de injectáveis, tal como uma isoforma de 165 amino ácido de crescimento endotelial vascular, factor de A (VEGFA 165) numa seringa de 1 cc e colocar em gelo. Injectar 0,2 mg / kg 165 19 VEGFA a uma concentração de 0,05 mg / ml. </li></ol> 4. Inserção da cauda Indwelling Vein Cateter <ol><li> Colocar o animal sob anestesia utilizando uma câmara de indução com 5% de isoflurano com O2 como gás de transporte. </li><li> Transferir o mouse para a plataforma cirúrgica, uma vez que está totalmente anestesiado e não responde a uma pitada dedo do pé. </li><li> Abrir linha anestesia com isoflurano para a plataforma cirúrgica, fechar a linha de anestesia para a câmara de indução e colocar o cone do nariz ao longo do focinho do animal. Reduzir o isoflurano de 5% a 2,5%. </li><li> Aplicar pomada oftálmica para os olhos do mouse para prevenir o ressecamento durante a anestesia. </li><li> Aqueça o animal sob a lâmpada de aquecimentodurante mais 2 min para aumentar a circulação na cauda como a circulação diminui com anestesia profunda. </li><li> Esterilizar a veia da cauda do rato com etanol a 70%. </li><li> Inserir a ponta da agulha de 31 G a partir do cateter construído na secção 3 para dentro da veia lateral da cauda do animal e empurrar a agulha em 2-3 mm. </li><li> Puxar para trás sobre a seringa para ver sangue, assegurando o cateter é colocado na veia da cauda. </li><li> Usar um comprimento de 1 cm de fita de laboratório colocada sobre a agulha para manter a agulha no lugar paralelo à veia ao longo do comprimento da cauda. </li></ol> 5. Pele Flap Procedimento cirúrgico para expor o tumor mamário <ol><li> Com o animal na plataforma cirúrgica pincelar o tumor e a superfície ventral, com 70% de etanol. Nota: Como descrito, este procedimento não é realizado completamente assepticamente. Para as sessões de imagem longas onde a infecção pode se tornar um fator de confusão, é recomendado o uso de uma técnica asséptica adequada. </li><li> usando Sterile fórceps, levantar a pele ventral com tesouras e estéreis fazer uma incisão subcutânea ao longo da linha média ventral, aproximadamente 1 cm de comprimento. Evitar a perfuração do peritoneu durante a incisão. </li><li> Suavemente cortar o tecido conjuntivo fixação da glândula mamaria e do tumor para longe do peritoneu para expor o tumor mamário. </li><li> Usando fórceps e tesouras, remover suavemente e cortar a fáscia e gordura a partir da superfície exposta do tumor enquanto se mantém a integridade da vasculatura do tumor e minimizar o sangramento. Este passo é crítico na manutenção da arquitectura do tumor e vasculatura fornecimento do tumor. </li></ol> 6. Preparação animal de Microscopia <ol><li> Transferir o animal para o estágio de imagem pré-aquecido com o tumor exposto colocado sobre a lamela na fase de inserção através da objectiva de microscópio para imagiologia. Tomar cuidado para transferir o cateter na veia da cauda suavemente com o animal, de modo a não deslocar a agulha. </li><li> º lugare anestesia nariz cone sobre o focinho do animal para manter o conjunto de anestesia para 3% isoflurano. </li><li> Posicione o animal para que o tumor repousa no buraco da almofada de borracha e faz contato com a lamela de vidro. </li><li> Use duas almofadas de borracha para segurar delicadamente o tumor no lugar e corrigi-los para o palco microscópio com fita laboratório para reduzir o movimento durante a aquisição de imagem. </li><li> Encha a câmara da almofada de borracha com PBS para manter o tecido hidratado e manter contato óptico com a lamela. </li><li> Começar a monitorar os sinais vitais do animal com uma sonda de oxímetro de pulso. Anexar um sensor de clipe para a coxa do animal. Alternativamente, um colar que é configurado para se ajustar em torno do pescoço pode ser utilizado. </li><li> Coloque a caixa de aquecimento sobre o animal para manter 30 ° C 20. </li><li> Lentamente reduzir o nível de isoflurano para 0,5-1% para manutenção da anestesia e manter o fluxo de sangue. </li></ol> 7. Aquisição de Imagem e injeção de fluoresent Corantes e Proteínas injectáveis <ol><li> Utilizando o microscópio de focagem ocular sobre as células tumorais fluorescentes sobre a superfície do tumor. </li><li> Selecione uma área de interesse por encontrar áreas com fluxo vasos sanguíneos. A selecção de uma área de interesse, com fluxo vasos sanguíneos é essencial para avaliar a vasculatura tumoral. </li><li> Uma vez que uma região de interesse tiver sido seleccionado alternar o microscópio no modo de imagiologia multifotônica. </li><li> Definir os limites superior e inferior de uma série z. Defina o limite superior da série z usando o ajustador de foco para mover o objetivo para o local de início desejada e clicando no botão posição Z &quot;Top&quot;. Determinar o limite superior do Z-série através da visualização da rede de fibras de colagénio na superfície do tumor no canal de segunda geração harmónica (SHG) e observando-se quando não há células, mas apenas as fibras de colagénio são visíveis. <ol><li> Definir o limite inferior da série Z movendo o objectivo para a profundidade desejada de imagem (Typically 50 - 150 mm) e clicando no botão posição Z &quot;Bottom&quot;. </li><li> Defina o tamanho do passo digitando o valor desejado no campo de tamanho do passo. Determinar o tamanho do passo com base em considerações de resolução e tempo de aquisição (normalmente 2 mm é utilizado para reconstrução 3D de alta resolução e 5 mm de outra forma). </li></ol></li><li> Defina o intervalo de time-lapse, alternando para o painel de Time-Lapse e inserindo o lapso de tempo desejado no campo Time-Lapse. Para resolução temporal ideal definido o intervalo de tempo de 0 segundos para imagiologia contínua. Nota: Para longa de imagem time-lapse é recomendado para definir o intervalo de tempo para 10 seg entre as aquisições para repor o líquido de imersão objectivo. </li><li> Uma vez que os parâmetros de imagiologia têm sido determinado, injectar lentamente 155 kDa dextrano-TMR. <ol><li> Retirar a seringa com PBS no cateter na veia da cauda e substituir com a seringa contendo 155 kDa dextrano-TMR tomando cuidado para não introduzir quaisquer bolhas no line. </li><li> Lentamente injetar 155 kDa dextrano-TMR para o rato, com um volume máximo de 200 mL, e substituir a seringa com seringa contendo PBS. Passo crítico: Executar a injeção devagar e tomar as devidas precauções para evitar solução fora da veia. </li></ol></li><li> Comece a aquisição do Z-stack imagens de lapso de tempo, clicando nos botões de lapso de tempo Z-Stack e para deprimir-los e, em seguida, clicar no botão de gravação. </li><li> Se outros dextranos fluorescentes, ou seja, isotiocianato de 10 kDa dextrano-fluoresceína (ITCF), ou proteínas, ou seja, VEGFA 165, foram preparados com antecedência, injetá-las após o início da aquisição da imagem para a = 0 min início. <ol><li> Retirar a seringa com PBS no cateter na veia da cauda e substituir com a seringa contendo 10 kDa dextrano-FITC ou VEGFA 165 tomando cuidado para não introduzir quaisquer bolhas na linha. </li><li> Lentamente injetar injetáveis ​​no rato através do cateter na veia da caudae substituir a seringa com uma seringa contendo PBS. </li></ol></li><li> Cada 30-45 minutos, injectam-se lentamente 50 mL de PBS ou soro fisiológico para manter a hidratação do animal. </li></ol> 8. A eutanásia <ol><li> Ao término de aquisição de imagem, eutanásia do animal. <ol><li> Aumentar o isoflurano a 5%. </li><li> Mantenha o animal com menos de 5% de isoflurano até 30 segundos depois ela deixa de respirar e remover o animal do palco. </li><li> Realizar deslocamento cervical para assegurar a eutanásia completa. </li></ol></li></ol> Processamento 9. Imagem <ol><li> Adquirir imagens em arquivos TIFF de 16 bits para cada canal individual em cada ponto de tempo e economizar sequencialmente. </li><li> Realizar a separação de sobreposição espectral (ou seja, GFP e PCP), a eliminação de deriva xy ea geração de filmes a partir de sequências de lapso de tempo usando métodos estabelecidos no ImageJ 9. Executar reconstruções de superfície 3D de imagens de alta resolução 13. </li></ol>

<ol><li>Gerlowski, L. E., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+permeability+of+normal+and+neoplastic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Microvascular permeability of normal and neoplastic tissues.</a> Microvasc Res. 31 (3), 288-305 (1986).</li>
<li>Wang, H. -L., Lai, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Evans+blue+quantitation+in+limited+rat+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples.</a> Sci Rep. 4, (2014).</li>
<li>Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rous-Whipple+Award+Lecture.+How+tumors+make+bad+blood+vessels+and+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Rous-Whipple Award Lecture. How tumors make bad blood vessels and stroma.</a> Am J Pathol. 162 (6), 1747-1757 (2003).</li>
<li>Nagy, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+properties+of+tumor+surrogate+blood+vessels+induced+by+VEGF-A%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Permeability properties of tumor surrogate blood vessels induced by VEGF-A.</a> Lab Invest. 86 (8), 767-780 (2006).</li>
<li>Egawa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+analysis+of+vascular+permeability+in+mice+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy.</a> Sci Rep. 3, (2013).</li>
<li>Yuan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+permeability+in+a+human+tumor+xenograft%3A+molecular+size+dependence+and+cutoff+size%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular permeability in a human tumor xenograft: molecular size dependence and cutoff size.</a> Cancer Res. 55 (17), 3752-3756 (1995).</li>
<li>Dellian, M., Yuan, F., Trubetskoy, V. S., Torchilin, V. P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+permeability+in+a+human+tumour+xenograft%3A+molecular+charge+dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Vascular permeability in a human tumour xenograft: molecular charge dependence.</a> Br J Cancer. 82 (9), 1513-1518 (2000).</li>
<li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setup+and+use+of+a+two-laser+multiphoton+microscope+for+multichannel+intravital+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging.</a> Nat Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).</li>
<li>Entenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tumor+cell+movement+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Imaging tumor cell movement in vivo.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter. 19, (2013).</li>
<li>Patsialou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+imaging+reveals+multicellular+streaming+as+a+crucial+component+of+in+vivo.+cell+migration+in+human+breast+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo. cell migration in human breast tumors.</a> Intravital. 2 (2), e25294(2013).</li>
<li>Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+classification+links+tumor+microenvironments+with+tumor+cell+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype.</a> PLoS Biol. 12 (11), e1001995(2014).</li>
<li>Roussos, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mena+invasive+%28MenaINV%29+promotes+multicellular+streaming+motility+and+transendothelial+migration+in+a+mouse+model+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer.</a> J Cell Sci. 13, 2120-2131 (2011).</li>
<li>Harney, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Imaging+Reveals+Local%2C+Transient+Vascular+Permeability%2C+and+Tumor+Cell+Intravasation+Stimulated+by+TIE2hi+Macrophage-Derived+VEGFA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA).</a> Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).</li>
<li>Robinson, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+of+metastasis+in+human+breast+carcinoma%3A+a+potential+prognostic+marker+linked+to+hematogenous+dissemination%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination.</a> Clin Cancer Res. 15, 2433-2441 (2009).</li>
<li>Sasmono, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+macrophage+colony-stimulating+factor+receptor-green+fluorescent+protein+transgene+is+expressed+throughout+the+mononuclear+phagocyte+system+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse.</a> Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).</li>
<li>Ovchinnikov, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Gal4-dependent+transgenes+in+cells+of+the+mononuclear+phagocyte+system+labeled+with+enhanced+cyan+fluorescent+protein+using+Csf1r-Gal4VP16%2FUAS-ECFP+double-transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukcocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice.</a> J Leukcocyte Biol. 83 (2), 430-433 (2008).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+from+human+breast+tumors+are+involved+in+spontaneous+metastases+in+orthotopic+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).</li>
<li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+drug+responses+in+the+tumor+microenvironment+in+mouse+models+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.</a> J Vis Exp. (73), (2013).</li>
<li>Weis, S., Cui, J., Barnes, L., Cheresh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+barrier+disruption+by+VEGF-mediated+Src+activity+potentiates+tumor+cell+extravasation+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelial barrier disruption by VEGF-mediated Src activity potentiates tumor cell extravasation and metastasis.</a> J Cell Biol. 167 (2), 223-229 (2004).</li>
<li>Wyckoff, J., Gligorijevic, B., Entenberg, D., Segall, J., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+Multiphoton+Imaging+of+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo.+Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-Resolution Multiphoton Imaging of Tumors.</a> In Vivo. Cold Spring Harb Protoc. (10), (2011).</li>
<li>Lathia, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+in+vivo.+evidence+for+tumor+propagation+by+glioblastoma+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Direct in vivo. evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells.</a> PLoS One. 6 (9), e24807(2011).</li>
<li>Nakasone, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).</li>
<li>Dreher, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+vascular+permeability%2C+accumulation%2C+and+penetration+of+macromolecular+drug+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers.</a> J Natl Cancer Inst. 98 (5), 335-344 (2006).</li>
<li>Wyckoff, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+macrophage-assisted+tumor+cell+intravasation+in+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors.</a> Cancer Res. 67 (6), 2649-2656 (2007).</li>
<li>Chittajallu, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo.+cell-cycle+profiling+in+xenograft+tumors+by+quantitative+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo. cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy.</a> Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).</li>
<li>Kedrin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nat Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).</li>
<li>Yano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial-temporal+FUCCI+imaging+of+each+cell+in+a+tumor+demonstrates+locational+dependence+of+cell+cycle+dynamics+and+chemoresponsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Spatial-temporal FUCCI imaging of each cell in a tumor demonstrates locational dependence of cell cycle dynamics and chemoresponsiveness.</a> Cell Cycle. 13 (13), 2110-2119 (2014).</li>
<li>Yang, M., Jiang, P., Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+subcellular+multicolor+imaging+of+tumor-host+interaction+and+drug+response+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Whole-body subcellular multicolor imaging of tumor-host interaction and drug response in real time.</a> Cancer Res. 67 (11), 5195-5200 (2007).</li>
<li>Manning, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+reveals+conversion+between+distinct+tumor+vascular+morphologies+and+localized+vascular+response+to+Sunitinib%5BTitle%5D)+AND+%22Intravital%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging reveals conversion between distinct tumor vascular morphologies and localized vascular response to Sunitinib.</a> Intravital. 2 (1), 24790(2013).</li>
<li>Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+cancer+growth+and+invasion%3A+a+modified+skin-fold+chamber+model%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model.</a> Histochem Cell Biol. 130 (6), 1147-1154 (2008).</li>
<li>Brown, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo.+measurement+of+gene+expression%2C+angiogenesis+and+physiological+function+in+tumors+using+multiphoton+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo. measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy.</a> Nat Med. 7 (7), 864-868 (2001).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

interacções celulares que ocorrem espontaneamente no microambiente do tumor pode levar a alterações na motilidade de células tumorais e intravasamento. De alta resolução de imagem intravital do tecido tumoral ao vivo permite a visualização da dinâmica multicelulares que podem ser 10,13,24 altamente transitória. Ponto final em ensaios in vivo ou imagens de lapso de tempo adquiridos com pontos de tempo discreto pode fornecer informações essenciais sobre mecanismos moleculares de processos no m...

Divulgação de células tumorais a partir do tumor mamário primário tem sido demonstrado que envolvem as células de tumor não apenas, mas células hospedeiras estromais incluindo macrófagos e células endoteliais. Além disso, a vasculatura tumoral é anormal, com um aumento da permeabilidade. Assim, determinar como células tumorais, macrófagos e células endoteliais interagem para mediar a permeabilidade vascular e intravasamento célula tumoral no microambiente do tumor primário é importante para a metástase compreensão. Compreendendo a cinética da permeabilidade vascular, intravasamento de células tumorais e o mecanismo de sinalização subjacente de interacções multicelulares no microambiente tumoral pode fornecer a informação crucial no desenvolvimento e administração de terapias anti-cancerosas. O principal meio de estudar a permeabilidade vascular do tumor in vivo tem sido a medição de corantes extravasculares, tais como azul de Evans 2, dextranos de elevado peso molecular (155 kDa)3 e fluoróforo ou proteínas radiofármaco-conjugados (incluindo a albumina) 4 em pontos fixos de tempo após a injecção do corante. Avanços na microscopia, modelos animais e corantes fluorescentes permitiram a visualização de processos celulares e permeabilidade vascular em animais vivos por meio de microscopia intravital 5. Imaging animal vivo com a aquisição de imagens estáticas, ou sequências de curto lapso de tempo ao longo de vários pontos de tempo não permite a compreensão completa dos eventos dinâmicos no microambiente do tumor 6,7. De facto, a aquisição de imagem estática ao longo de 24 horas demonstraram que a vasculatura tumoral é permeável, no entanto, a dinâmica da permeabilidade vascular não foi observada 6. Assim, estendido de imagem contínua de lapso de tempo de até 12 horas capta a cinética de eventos dinâmicos no microambiente do tumor. Este protocolo descreve o uso de estendido multiphot time-lapseem microscopia intravital para estudar eventos multicelulares dinâmicos no microambiente tumoral. Vários tipos de células no microambiente do tumor são marcadas com corantes injectáveis ​​ou usando animais transgénicos que expressam proteínas fluorescentes. Utilizando um cateter na veia da cauda corantes vasculares ou proteínas pode ser injectado após o início da imagiologia para adquirir dados de cinética de eventos multicelulares no microambiente tumoral. Para imagens de células vivas do tumor mamário é exposto através da preparação cirúrgica de um retalho de pele. As imagens são adquiridas por até 12 horas usando um microscópio multiphoton equipado com múltiplos tubos fotomultiplicadores (PMT) detectores 8. Ao usar filtros apropriados, um algoritmo de subtracção possibilita 4 detectores PMT para adquirir sinais fluorescentes 5 no microambiente tumoral, simultaneamente 9. microscopia de alta resolução multiphoton intravital captura de imagem resolução única célula de interações tumor-estroma no microambiente tumoral, levando a uma melhor understanding da permeabilidade vascular e intravasamento célula tumoral 10-13. Especificamente, imagiologia intravital reveladas altamente localizadas transientes, eventos de permeabilidade vascular estendidos que ocorrem selectivamente em locais de interacção entre uma célula tumoral, um macrófago e uma célula endotelial (definido como o microambiente do tumor de metástase, TMEM 14) 13. Além disso, intravasation células tumorais ocorre apenas em TMEM e é espacialmente e temporalmente correlacionada com a permeabilidade vascular 13. resolução única célula da dinâmica destes eventos foi possível através do uso de microscopia multiphoton lapso de tempo prolongado de células com marcação fluorescente no microambiente tumoral.

<table><tbody><tr><td>155 kDa de isotiocianato de dextrana-tetrametilrodamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1287</td><td>reconstitui a 20 mg/ml em 1x PBS</td></tr><tr><td>70 kDa dextrano-Texas Red</td><td>Life Technologies</td><td>D-1830</td><td>reconstitui a 10 mg/ml em 1x PBS</td></tr><tr><td>10 kDa isotiocianato de dextrana-fluoresceína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>FD10S</td><td>reconstitui a 20 mg/ml em 1x PBS</td></tr><tr><td>Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots Life</td><td> Tecnologias</td><td>Q21561MP</td><td>diluem 25 &#956; l em 175 &#956; l de 1x PBS para injeção Camundongos</td></tr><tr><td>MMTV-PyMT</td><td>Jackson Laboratory</td><td>2374</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos Csf1r-ECFP (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP)</td><td>Jackson Laboratory</td><td>26051</td><td></td></tr><tr><td>Camundongos Csf1r-EGFP</td><td>Jackson Laboratory</td><td>18549</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoethesia (isoflurano)</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>50033</td><td>Seringa de 250 ml</td></tr><tr><td>Oxygen</td><td>AirTech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml, ponta deslizante de tuberculina</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>30 G x 1 (0.3 mm x 25&nbsp; mm) agulha</td><td>BD</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td>Tubo micro médico de polietileno&nbsp;</td><td>Scientific Commodities Inc</td><td>BB31695-PE/1</td><td>0,28 mm I.D. x 0,64 mm O.D.</td></tr><tr><td>Tampa de lamínula para microscópio</td><td>Corning</td><td>2980-225</td><td>espessura 1.5, 22 x 50&nbsp; mm</td></tr><tr><td>PhysioSuite MouseSTAT oxímetro de pulso, software e sensores</td> Fita de laboratório <td>Kent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>159015R</td><td></td></tr><tr><td>almofada de borracha macia</td><td>McMaster-Carr</td><td>8514K62</td><td>Filme de poliuretano ultramacio, 3/16" Espessura, 12" x 12", 40 Oo Dureza, Borracha dura de fundo liso</td></tr><tr><td></td><td>McMaster-Carr</td><td>8568K615</td><td>Folha de Borracha de Neoprene de Alta Resistência 1/4" de Espessura, 12" x 12", 50&nbsp; Um microscópio de durômetro</td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td></td><td>O microscópio é um microscópio multifotônico de dois lasers personalizado baseado em um suporte Olympus IX-71 utilizando uma lente objetiva 20X 1.05NA.</td></tr><tr><td>Conjunto de 7 punções</td><td>McMaster-Carr</td><td>3429A12</td><td>Diâmetro do furo de 1/4" a 1", para furador acionado por martelo</td></tr></tbody></table>

estendida time-lapse imagem intravital do real-time multicelular dynamics no microambiente tumoral

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

No microambiente tumoral, as células estromais do hospedeiro interagem com as células tumorais para promover a progressão tumoral, angiogênese, disseminação de células tumorais e metástase. As interações multicelulares no microambiente tumoral podem levar a eventos transitórios, incluindo motilidade direcional das células tumorais e permeabilidade vascular. A quantificação da permeabilidade vascular tumoral tem usado frequentemente experimentos de ponto final para medir o extravasamento de corantes vasculares. No entanto, devido à natureza transitória das interações multicelulares e da permeabilidade vascular, a cinética desses eventos dinâmicos não pode ser discernida. Ao marcar células e vasculatura com corantes injetáveis ou proteínas fluorescentes, a microscopia intravital de lapso de tempo de alta resolução permitiu a visualização direta e em tempo real de eventos transitórios no microambiente tumoral. Aqui descrevemos um método para usar microscopia multifotônica para realizar imagens intravitais estendidas em camundongos vivos para visualizar diretamente a dinâmica multicelular no microambiente tumoral. Este método detalha as estratégias de marcação celular, a preparação cirúrgica de um retalho cutâneo mamário, a administração de corantes ou proteínas injetáveis por cateter de veia caudal e a aquisição de imagens de lapso de tempo. As sequências de lapso de tempo obtidas a partir deste método facilitam a visualização e quantificação da cinética de eventos celulares de motilidade e permeabilidade vascular no microambiente tumoral.

microscopia de lapso de tempo intravital estendida permite imagiologia resolução única célula de processos multicelulares no microambiente do tumor. Por células tumorais rotulagem fluorescente, macrófagos, do espaço vascular, e visualizando a rede de fibra de colagénio utilizando o segundo sinal de geração de harmónicas, vários compartimentos no microambiente tumoral são rastreados simultaneamente durante o exame. As células de tumor marcadas com proteínas fluorescentes pode ser gerada e...

Este protocolo descreve o uso de microscopia multifotônica para executar imagiologia prolongado de lapso de tempo de interacções multicelulares em tempo real, in vivo, a resolução de células simples.

Estendida Time-lapse Imagem intravital do Real-time multicelular Dynamics no microambiente tumoral

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar os eventos dinâmicos dentro do microambiente tumoral por meio de microscopia intravital de múltiplos fótons com alta resolução. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre o microambiente tumoral, como quais eventos dinâmicos estão envolvidos na permeabilidade vascular e nas interações multicelulares. A principal vantagem desta técnica é que a cinética dos eventos no microambiente tumoral pode ser observada e medida.Antes de iniciar o procedimento, ligue todos os componentes do microscópio e do laser, incluindo os lasers de dois fótons e os detectores. E ajuste a caixa de aquecimento para 30 graus Celsius para pré-aquecer a platina. Limpe a platina do microscópio e o inserto da platina com etanol 70%.Quando o estágio estiver seco, coloque uma grande gota de água sobre a objetiva microscópica 25 x 1,05 NA para manter o contato óptico com o lamínula e posicione um lamínula de espessura número 1,5 sobre a porta de imagem do inserto. Em seguida, corte um pedaço de tubo de polietileno com 30 centímetros de comprimento. Coloque a almofada de borracha sobre o lamínula.Usando pin&ccedil;as, quebre uma agulha de calibre 31 do se

extended-time-lapse-intravital-imaging-real-time-multicellular

Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Nós apresentamos uma nova abordagem para quantificar a localização das nanopartículas na vasculatura de tumores humanos xenografted utilizando dinâmicas, imagens em tempo real intravital em um modelo embrião aviária.

Avaliação de Captação de nanopartículas em tumores em tempo real usando imagens intravital

Descreve-se um método para a resposta de imagem para tratamento...

Viver de imagem de Respostas de drogas no microambiente tumoral em modelos do rato do cancro da mama

A matriz extracelular sofre remodelação substancial durante a cicatrização de feridas, inflamação e tumorigênese. Nós apresentamos uma abordagem microscopia de imunofluorescência intravital romance de visualizar a dinâmica de fibrilar, bem como componentes da matriz de malha-like com resolução espacial e temporal alta usando epifluorescência ou microscopia de dois fótons.

Longo prazo intravital Imunofluorescência imagem do tecido componentes da matriz com epifluorescência e microscopia de dois fótons

Descreve-se um método relativamente simples para a imagiologia ex vivo, ao vivo das interacções de células de estroma tumoral dentro de metástase pulmonar, utilizando repórteres fluorescentes, em ratinhos. Utilizando microscopia confocal de disco rotativo, esta técnica permite a visualização de células vivas durante pelo menos 4 horas e pode ser adaptado para estudar outras condições inflamatórias do pulmão.

Ex vivo de imagens ao vivo de pulmão Metástase e seu microambiente

Este protocolo descreve o uso de microscopia multifotônica para realizar imagens de célula única de alta resolução de longo prazo do pulmão intacto em tempo real usando uma janela de imagem estabilizada a vácuo.

De longo prazo de alta resolução Intravital Microscopia no pulmão com um vácuo estabilizado Janela de imagem

Este protocolo descreve a intravital imagem de ratos transgênicos expressando marcadores fluorescentes específicos de célula. Intravital imagem fornece um método não-invasivo para observações de alta resolução em animais vivos usando windows implantáveis, através do qual a visualização microscópica de processos é possível. Este método é especialmente útil para estudar processos longitudinais.

A microscopia intravital da vasculatura Tumor-associado usando avançada Dorsal câmaras de janela dobras cutâneas em ratos transgênicos fluorescentes

Aqui nós descrevemos um método para a imagem latente high-resolution do multifotônica do tempo-lapso de pilhas do tumor cerebral antes e depois da intervenção cirúrgica invasora (por exemplo, biópsia) dentro do mesmo animal vivo. Este método permite estudar o impacto destes procedimentos cirúrgicos invasivos no comportamento migratório, invasivo e proliferativo das células tumorais em um único nível de células.

Imagem latente longitudinal de intravital do comportamento da pilha do tumor cerebral em resposta a uma biópsia cirúrgica invasora

Nós descrevemos dois métodos para avaliar a permeabilidade vascular transiente associada com o microambiente do tumor da função da entrada da metástase (TMEM) e da intravasação da pilha de cancro usando a injeção intravenosa do dextrano high-molecular do peso (155 kDa) nos ratos. Os métodos incluem a imagem latente intravital em animais vivos e a análise fixa do tecido usando a imunofluorescência.

Avaliando o microambiente do tumor da permeabilidade vascular entrada-negociada metástase associada com a disseminação da pilha do cancro usando a imagem latente intravital e a análise fixa do tecido

Nós descrevemos um método para visualizar o IELS do ltγδ GFP-etiquetado usando a imagem latente intravital do intestino pequeno murino pela microscopia confocal invertida do disco de giro. Esta técnica permite o rastreamento de células ao vivo dentro da mucosa para até 4 h e pode ser usada para investigar uma variedade de interações imunológicas intestinais.

Imagem latente intravital de linfócitos intraepithelial no intestino pequeno murine

O recrutamento de leucócitos e plaquetas constitui um componente essencial necessário para o crescimento efetivo das artérias colaterais durante a arteriogênese. A microscopia multifóton é uma ferramenta eficiente para rastrear a dinâmica celular com alta resolução espaço-temporal in vivo e menor fototoxicidade para estudar o recrutamento e extravasamento de leucócitos durante a arteriogênese.

Imagem Intravital Multifóton para Monitoramento do Recrutamento de Leucócitos durante a Arteriogênese em Modelo de Membro Posterior Murino

O método de imagem intravital descrito aqui utiliza colágeno segunda geração harmônica e fluorescência endógena do cofator metabólico NAD(P)H para segmentar não invasivamente um microambiente tumoral não rotulado em compartimentos tumorais, estromaéreos e vasculares para análise aprofundada de imagens intravital 4D.

Uma abordagem de segmentação sem rótulos para imagens intravitais do microambiente tumoral mamário

Aprenda a usar microscopia intravital multiphóton para visualizar dinâmicas celulares em tempo real no microambiente tumoral. Esta técnica permite medir a permeabilidade vascular e interações multicelulares com resolução de célula única.

Estendida Time-lapse Imagem intravital do Real-time multicelular Dynamics no microambiente tumoral

Explorar mais vídeos