Name: 一步法负色谱纯化幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白过度表达大肠杆菌在批处理模式 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 学习使用DEAE树脂批处理负色谱法从大肠杆菌中一步纯化幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白，获得高纯度天然蛋白，助力疫苗与药物研发。

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我们感谢中国台湾国立清华大学的程超生博士协助完成圆二色性测量。我们还感谢美国梅奥诊所的Evanthia Galanis博士和Ianko D. Iankov博士提供抗HP-NAP单克隆抗体。我们感谢中国台湾新竹马偕纪念医院的张汉文博士和陈仲珠博士在伦理审查委员会（IRB）申请方面提供的建议，感谢中国台湾新竹马偕纪念医院的蔡德隆先生对分离中性粒细胞分析工作的指导，以及感谢中国台湾国立清华大学的翁郁晨女士提供的技术协助。本研究得到了中国台湾科技部资助项目（MOST 104-2311-B-007-003、NSC101-2311-B-007-007 和 NSC98-2311-B-007-006-MY3）、国立清华大学与马偕纪念医院联合研究计划（100N7727E1、101N2727E1、103N2773E1）以及国立清华大学研究计划（104N2052E1）的支持。

人血样来自中国台湾新竹市国立清华大学机构审查委员会批准并签署知情同意书的健康志愿者。
1. 重组HP-NAP的表达 E. coli
<ol>
	<li>准备含有幽门螺杆菌中性激活蛋白（HP-NAP）DNA序列的质粒pET42a-NAP H. pylori 26695 菌株，如先前所述16. 按照所述方法制备含有目标点突变HP-NAP DNA序列的质粒（见方案，步骤8）。</li>
	<li>将上述DNA质粒10 ng转化至 E. coli BL21 (DE3) 感受态细胞在 42 °C 下热激 45 秒，将细胞涂布于含有 50 µg/ml 的溶菌肉汤（LB）琼脂平板上&#160;卡那霉素，并在37 °C下孵育平板16小时。</li>
	<li>接种单个菌落至分别含有5 ml的试管中&#160;在含有50 µg/ml卡那霉素的LB肉汤中培养，37 °C、170 rpm振荡培养16小时，作为预培养物。</li>
	<li>将上述预培养的菌液2 ml接种至含有50 µg/ml卡那霉素的200 ml LB液体培养基中，置于1 L锥形瓶内。将接种后的培养瓶在37 °C、170 rpm振荡条件下培养约2小时，直至紫外-可见分光光度计测定的600 nm处吸光度达到约0.4–0.5。</li>
	<li>向上述培养物中加入80 µl的1 M异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG），使终浓度为0.4 mM，以诱导HP-NAP的表达。继续培养3小时，直至600 nm处的吸光度达到约1.6–1.7。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 6,000 × g 离心 15 分钟，去除上清液。将细胞沉淀保存于 −70 °C，直至纯化。</li>
</ol>
2. 含 HP-NAP 可溶性蛋白组分的制备
注意：以下所有步骤均在 4 °C 下进行。
<ol>
	<li>按照先前所述方法16，在 4 °C 下，将步骤 1.6 中制备的 50 ml 细胞沉淀重悬于 20 ml 含 0.13 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）、0.03 mM N-对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲基酮（TLCK）和 0.03 mM N-对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）的 20 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 9.0）、50 mM NaCl 中。</li>
	<li>将细菌悬液在 4 °C 下通过高压均质器处理 7 次，压力范围为 15,000 至 20,000 psi，以破碎细菌细胞。</li>
	<li>将细胞裂解液在 4 °C 下以 30,000 × g 离心 1 小时，使用超速离心机分离可溶性和不溶性蛋白组分。将上清液转移至烧杯中，作为可溶性蛋白组分。</li>
	<li>使用商用试剂盒，以牛血清白蛋白（BSA）为标准品，按照制造商说明书通过 Bradford 法测定可溶性蛋白组分的蛋白浓度。</li>
	<li>向步骤 2.3 获得的 20 ml 可溶性蛋白组分中加入 177.6 µl 的 1 N HCl，将其 pH 值从 9.0 调整至 8.0。</li>
	<li>向上述蛋白溶液中加入 20 mM Tris-HCl（pH 8.0）、50 mM NaCl，调节最终蛋白浓度至 0.5 mg/ml。</li>
</ol>
3. 采用 DEAE 离子交换树脂进行负模式分批色谱法从E. coli中纯化重组 HP-NAP
<ol>
	<li>准备 15 ml DEAE 树脂。
	<ol>
		<li>称取 0.6 g DEAE 树脂干粉，加入 30 ml 20 mM Tris-HCl（pH 8.0，含 50 mM NaCl）溶液中，室温下悬浮至少 1 天。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 10,000 × g 离心 1 分钟。</li>
		<li>移除并弃去上清液。</li>
		<li>加入 15 ml 20 mM Tris-HCl（pH 8.0，含 50 mM NaCl）溶液。</li>
		<li>重复步骤 3.1.2 至 3.1.4 共四次。</li>
		<li>将 15 ml 沉降后的树脂（在 30 ml Tris 缓冲液中形成 50% 悬浮液）于 4 °C 保存，以备后续使用。 
		注意：以下所有步骤均在 4 °C 下进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将步骤 2.6 制备的 45 ml 可溶性蛋白加入 15 ml 树脂中，使用磁力搅拌器在 4 °C 下搅拌 1 小时。</li>
	<li>将蛋白/树脂悬液倒入装有活塞的塑料或玻璃层析柱中，静置使树脂自然沉降。</li>
	<li>打开活塞，使蛋白溶液依靠重力流过层析柱，直至柱内液面刚好位于树脂上方。收集流出液作为未结合组分，其中含有纯化的 HP-NAP。</li>
	<li>向层析柱中加入 15 ml 冰冷的 20 mM Tris-HCl（pH 8.0，含 50 mM NaCl）溶液。</li>
	<li>打开活塞，使洗涤缓冲液依靠重力流过层析柱，直至液面刚好位于树脂上方。收集流出液作为洗涤组分。</li>
	<li>重复步骤 3.5 至 3.6 共四次，以收集额外的洗涤组分。</li>
	<li>向层析柱中加入 15 ml 冰冷的 20 mM Tris-HCl（pH 8.0，含 1 M NaCl）溶液。</li>
	<li>打开活塞，使洗脱缓冲液依靠重力流过层析柱，直至液面刚好位于树脂上方。收集流出液作为洗脱组分。</li>
	<li>重复步骤 3.8 至 3.9 共四次，以收集额外的洗脱组分。</li>
</ol>
4. 采用DEAE树脂负模式分批层析纯化的HP-NAP的缓冲液置换与内毒素去除
注意：在用于刺激中性粒细胞之前，需对在大肠杆菌（E. coli）中表达的纯化HP-NAP进行缓冲液置换和内毒素去除。
<ol>
	<li>使用截留分子量为14 kDa的透析袋，在4 °C条件下将纯化的HP-NAP缓冲液置换为Dulbecco's磷酸盐缓冲液（D-PBS，pH 7.2），透析操作按先前所述方法进行24。</li>
	<li>将透析后的HP-NAP通过连接在20 ml一次性注射器上的带正电荷亲水膜的注射器滤器，在4 °C、流速为2.5至4 ml/分钟的条件下过滤，以去除内毒素。</li>
</ol>
5. 通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、Western印迹、非变性PAGE、凝胶过滤色谱和圆二色光谱对纯化的重组HP-NAP分子特性进行表征
<ol>
	<li>采用SDS-PAGE和Western印迹法分析纯化的重组HP-NAP，使用含有小鼠单克隆抗体MAb 16F425的杂交瘤细胞培养上清液进行检测，方法同前文所述24。</li>
	<li>采用非变性PAGE和凝胶过滤层析分析纯化的HP-NAP，以检测其寡聚状态，方法同前文所述26。</li>
	<li>采用圆二色光谱法分析纯化的重组HP-NAP，以检测其二级结构，方法同前文所述26。</li>
</ol>
6. 通过 SDS-PAGE 凝胶银染法评估 HP-NAP 的纯度
<ol>
	<li>根据银染试剂盒的制造商说明，配制固定液、致敏液、银染液、显色液、终止液和洗涤液。</li>
	<li>按照银染试剂盒的制造商说明，对SDS-PAGE凝胶进行银染。</li>
	<li>使用成像系统获取凝胶图像。</li>
</ol>
7. HP-NAP诱导的中性粒细胞活性氧产生的测定
<ol>
	<li>通过葡聚糖沉降法结合密度梯度离心法从人肝素化血液中分离中性粒细胞，方法如前所述24。</li>
	<li>使用鲁米诺依赖性化学发光法检测HP-NAP刺激后中性粒细胞的活性氧（ROS）产生。
	<ol>
		<li>开启酶标仪并将温度设置为37 °C。将一个空的平底96孔白色板放入酶标仪腔内，使其预热至37 °C。</li>
		<li>在D-PBS（pH 7.2）中配制刺激混合液，其中含有0.9 mM CaCl2、0.5 mM MgCl2和13.3 µM 5-氨基-2,3-二氢-1,4-酞嗪二酮（鲁米诺），并分别加入或不加由方案步骤4.2制备的0.67 µM去内毒素HP-NAP。</li>
		<li>将由方案步骤7.1制备的人中性粒细胞浓度调整为2 × 106 个细胞/ml，悬浮于含5 mM葡萄糖的D-PBS（pH 7.2）中。</li>
		<li>向96孔白板的每个孔中加入50 µl中性粒细胞悬液。</li>
		<li>将由方案步骤7.2.2制备的刺激混合液150 µl加入含中性粒细胞的各孔中，每孔间隔5秒。</li>
		<li>使用酶标仪在三小时内每5秒测量一次各孔的化学发光信号。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 基于聚合酶链式反应（PCR）的定点突变法构建携带幽门螺杆菌中性激活蛋白突变体的DNA质粒
注意：基于 PCR 的定点突变基本按照先前所述方法进行27，不同之处在于通过定点突变（SDM）辅助软件28在突变引物中引入了&#34;沉默&#34;限制性酶切位点。
<ol>
	<li>进行PCR反应。
	<ol>
		<li>在含有去离子水的PCR管中加入10 ng质粒pET42a-NAP、1 µM的定点突变引物对（见表1）、200 µM脱氧核苷三磷酸（dNTPs）以及3单位的高保真PCR酶混合物，总体积为25 µl。</li>
		<li>启动PCR循环：95 °C变性10分钟，随后进行12轮扩增循环，每轮包括95 °C变性1分钟、Tm no-5 °C退火1分钟、72 oC延伸6分钟。</li>
		<li>PCR循环最后进行一步退火：在Tm pp-5 oC退火1分钟，然后在72 °C延伸30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取15 µl PCR产物，加入0.4 µl Dpn I限制性内切酶，在37 °C孵育2小时，随后取2 µl经Dpn I处理的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。</li>
	<li>筛选突变体。
	<ol>
		<li>将2 µl PCR产物通过42 °C热激45秒转化至E. coli DH5α感受态细胞中。</li>
		<li>将转化后的细胞涂布于含50 µg/ml卡那霉素的LB平板，37 °C培养16小时。</li>
		<li>使用商品化的碱裂解法质粒提取试剂盒，按照生产商说明书从细菌菌落中提取质粒DNA。</li>
		<li>使用XhoI限制性内切酶处理步骤8.3.3中提取的质粒DNA，按照生产商说明书验证目标沉默突变的存在。</li>
		<li>使用T7启动子引物对经步骤8.3.4验证的质粒DNA进行测序，按照生产商说明书确认HP-NAP突变体编码序列的正确性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Karnik, A., Karnik, R., Grefen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDM-assist+software+to+design+site-directed+mutagenesis+primers+introducing+%27silent%27+restriction+sites%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">SDM-assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing 'silent' restriction sites.</a> BMC bioinformatics. 14 (105), (2013).</li>
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HWF 和 YCY 是专利 TW I 432579 和 US 8,673,312 的发明人，该专利涉及一步法纯化方法 幽门螺杆菌 中性粒细胞激活蛋白。论文中描述的所有材料均可用于科研目的。作者确认，此声明不会改变其对JoVE所有数据与材料共享政策的遵守。

采用DEAE阴离子交换树脂的负模式批次色谱法适用于纯化在大肠杆菌中过表达的重组HP-NAP 大肠杆菌细胞裂解和纯化步骤中所用缓冲液的pH值对于确保HP-NAP的溶解度至关重要 E. coli 裂解物及高效分离重组HP-NAP与宿主细胞杂质。细菌细胞应在pH 9.0条件下裂解，负相纯化应在pH 8.0条件下进行，以获得高得率和高纯度的HP-NAP。HP-NAP的典型回收率为90%，典型纯度为95%24由于HP-NAP存在于未结合组分中，应使用最小但足量的树脂，以实现其对杂质的最大吸附能力。在本实验中，最大载样量为每1.5 mg可溶性蛋白质 E. coli 每毫升树脂对应的裂解液量。
所提供的方案旨在从50 ml样品中纯化重组HP-NAP E. coli 培养. HP-NAP 的产量约为 15 mg。纯化过程可根据需要进行相应缩小或放大。例如，两种重组 HP-NAPY101H 和 HP-NAPE97GY101H 突变体从1中纯化&#...

幽门螺杆菌 (H. pylori) 是导致胃炎和消化性溃疡的主要原因。1994年，世界卫生组织下属的国际癌症研究机构已将该细菌归类为人类致癌物。据估计，其感染率 H. pylori 在发展中国家感染率为70%，在工业化国家为30-40%1。尽管感染率 H. pylori 在工业化国家呈下降趋势，但感染率 H. pylori 在发展中国家仍然很高2. 根除的标准治疗方法 H. pylori 感染治疗包括给予一种质子泵抑制剂（PPI）和两种抗生素，即克拉霉素联合阿莫西林或甲硝唑3然而，抗生素耐药性的上升 H. pylori相关溃疡治疗迫切需要开发新的策略以预防或治愈感染。针对该感染的预防性和/或治疗性疫苗的研发 H. pylori 可提供一种控制的替代方法 H. pylori 感染
Helicobacter pylori 中性粒细胞活化蛋白（HP-NAP）是 H. pylori 的一种主要毒力因子，最初在 H. pylori 的水提取物中被发现，具有激活中性粒细胞使其黏附于内皮细胞并产生活性氧（ROS）的能力4。在患有活动性胃炎的 H. pylori 感染患者中，胃黏膜中出现的中性粒细胞浸润可能导致胃部炎症和组织损伤。因此，HP-NAP 可能通过激活中性粒细胞诱导胃部炎症，进而引发溃疡或与 H. pylori 相关的胃部疾病，发挥病理作用。然而，HP-NAP 也是临床应用的潜在候选分子5,6。由于 HP-NAP 具有免疫原性和免疫调节特性，该蛋白可用于开发疫苗、治疗剂和诊断工具。已有临床试验将重组 HP-NAP 作为抗 H. pylori 蛋白疫苗的组分之一，该疫苗包含重组 HP-NAP、细胞毒素相关基因 A（CagA）和空泡毒素 A（VacA）蛋白，并以氢氧化铝为佐剂，已在人体中证明具有良好的安全性和免疫原性7。此外，HP-NAP 作为一种强效免疫调节剂，可诱导 T 辅助细胞 1 型（Th1）极化的免疫反应，用于癌症治疗8，同时可下调由过敏反应和寄生虫感染引发的 Th2 介导的免疫反应9,10。在诊断方面，基于重组 HP-NAP 的 ELISA 已被用于检测 H. pylori 感染患者血清中抗 HP-NAP 的抗体11。一项研究表明，伴有胃癌的 H. pylori 感染患者血清中 HP-NAP 特异性抗体水平显著高于慢性胃炎患者12。另一项研究也表明，抗 HP-NAP 血清抗体与非贲门部胃腺癌的发生相关13。因此，基于重组 HP-NAP 的 ELISA 可用于检测 H. pylori 感染患者血清中抗 HP-NAP 抗体，以辅助胃癌的预后判断。综上所述，纯化的 HP-NAP 可进一步用于 H. pylori 相关疾病的预防、治疗及预后评估，以及癌症治疗。
在用于纯化于其中表达的重组HP-NAP的多种方法中 大肠杆菌 (E. coli) 据目前报道的天然形式，还需通过凝胶过滤色谱进行第二步纯化，以获得高纯度的HP-NAP14-16. 本文描述了一种使用二乙氨基乙基（DEAE）离子交换树脂在负模式下进行批量层析的方法，用于纯化在其中过表达的HP-NAP E. coli 高产率且高纯度。该纯化技术基于宿主细胞蛋白和/或除HP-NAP以外的杂质与树脂的结合。在pH 8.0条件下，未结合组分中几乎不回收除HP-NAP以外的其他蛋白质。这种采用DEAE离子交换色谱的负向模式纯化方法简便且节省时间，通过收集未结合组分即可实现重组HP-NAP的一步色谱纯化。除HP-NAP外，其他多种生物分子（如病毒）17免疫球蛋白G（IgG）18血红蛋白19蛋白磷酸酶20和毒力因子鞭毛蛋白21，也已有通过阴离子交换色谱在负模式下进行纯化的报道。若待纯化样品中的杂质为次要组分，则离子交换色谱优先采用负模式。22负相色谱法在天然或重组生物分子纯化中的应用已有综述报道23.
本报告提供了一步一步的实验方案，用于在大肠杆菌（E. coli）中表达重组HP-NAP蛋白、裂解细胞，并利用DEAE离子交换树脂通过负模式分批层析纯化HP-NAP。如果目标蛋白适用于负模式离子交换层析，则本方案也可作为开发其纯化工艺的起始参考。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET42a-NAP&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>制备方法见参考文献15的补充数据&amp;nbsp;&lt;br/&gt; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL21 (DE3)</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>C6000-03</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003</td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Amresco</td><td>25389-94-0</td><td>http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx</td></tr><tr><td>异丙基-&amp;beta;-D-硫代半乳糖苷（IPTG）</td><td>MD Biomedical 公司</td><td>101-367-93-1</td><td>http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&amp;amp;supplier=search&amp;amp;name&lt;br/&gt;=IPTG%20</td></tr><tr><td>苯甲基磺酰氟（PMSF）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10837091001</td><td>蛋白酶抑制剂&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/PMSFRO?lang=en&amp;amp;region=TW</td></tr><tr><td>N-对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲基酮（TLCK）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7254</td><td>蛋白酶抑制剂&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en&amp;amp;region=TW</td></tr><tr><td>N-对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4376</td><td>蛋白酶抑制剂&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en&amp;amp;region=TW</td></tr><tr><td>蛋白标准品（牛血清白蛋白）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5619&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad 蛋白测定试剂盒的标准蛋白&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en&amp;amp;region=TW</td></tr><tr><td>DEAE&amp;ndash;Sephadex &amp;nbsp;A-25 氯化物形式</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A25120</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en&amp;amp;region=TW</td></tr><tr><td>Spectrum/Por 透析管</td><td>Spectrum Laboratories</td><td>132720</td><td>截留分子量为14 kDa&lt;br/&gt; http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;</td></tr><tr><td>Acrodisc&amp;reg; 单元，含 Mustang&amp;reg; E 膜</td><td>Pall</td><td>MSTG25E3</td><td>用于去除内毒素；操作流速范围为1至4 ml/min&lt;br/&gt; http://www.pall.com/main/laboratory/product.page?id=19992</td></tr><tr><td>小鼠单克隆抗体 MAb 16F4</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>针对幽门螺杆菌NCTC 11637菌株纯化的HP-NAP制备，方法见参考文献23；由美国梅奥诊所Evanthia Galanis博士和Ianko D. Iankov博士惠赠&amp;nbsp;&lt;br/&gt; http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0264410X10017585</td></tr><tr><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td><td>GE 医疗生命科学</td><td>28989335</td><td>用于凝胶过滤层析&lt;br/&gt; http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28989335</td></tr><tr><td>PlusOne 银染试剂盒（蛋白）</td><td>GE 医疗生命科学</td><td>17-1150-01</td><td>http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/17115001</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE 医疗生命科学</td><td>17-1440-02</td><td>用于密度梯度离心法纯化人中性粒细胞&lt;br/&gt; http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-tw/products/AlternativeProductStructure&lt;br/&gt;_16963/17144002</td></tr><tr><td>平底96孔白色板</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>236108</td><td>http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html</td></tr><tr><td>鲁米诺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8511</td><td>避光保存&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a8511?lang=en&amp;amp;region=TW</td></tr><tr><td>Expand &amp;nbsp;长片段PCR系统</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11681834001</td><td>高保真PCR酶混合物来源&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/elongro?lang=en&amp;amp;region=TW</td></tr><tr><td>Dpn I</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>R0176S</td><td>https://www.neb.com/products/r0176-dpni</td></tr><tr><td>Xho I</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>R0146S</td><td>https://www.neb.com/products/r0146-xhoi</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DH5&amp;alpha;</td><td>赛默飞世尔科技公司</td><td>18265-017</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;产品编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>&lt;br/&gt; &amp;nbsp;</td></tr><tr><td>U-2800 双光束紫外/可见分光光度计</td><td>日立&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>已退市并升级为新型号&lt;br/&gt; http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers</td></tr><tr><td>EmulsiFlex-C3 高压均质机</td><td>Avestin 公司</td><td>C315320</td><td>http://www.avestin.com/English/c3page.html</td></tr><tr><td>日立工机 himac CP80WX 通用超速离心机</td><td>日立工机株式会社</td><td>90106401</td><td>用于从&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 裂解液中分离可溶性和不溶性蛋白组分&lt;br/&gt; http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html</td></tr><tr><td>&amp;Auml;KTA FPLC</td><td>GE 医疗生命科学</td><td>18-1900-26</td><td>用于凝胶过滤层析&lt;br/&gt; http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/18190026</td></tr><tr><td>Aviv model 62ADS 圆二色光谱仪</td><td>Aviv Biomedical</td><td>N/A</td><td>已退市并升级为新型号 http://www.avivbiomedical.com/circular.php</td></tr><tr><td>LAS-3000 成像系统</td><td>富士胶片</td><td>N/A</td><td>已停产并被替代&lt;br/&gt; http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences-tw/28955810</td></tr><tr><td>Wallac 1420 (Victor2) 多功能微孔板检测仪</td><td>珀金埃尔默</td><td>1420-018</td><td>用于化学发光检测&lt;br/&gt; http://www.perkinelmer.com/catalog/product/id/1420-018</td></tr></tbody></table>

一步法负向色谱纯化 幽门螺杆菌 中性粒细胞激活蛋白过表达于 大肠杆菌 批量模式

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

幽门螺杆菌中性粒细胞活化蛋白（HP-NAP）是幽门螺杆菌（H. pylori）的一种主要毒力因子。它通过激活多种天然免疫白细胞（包括中性粒细胞、单核细胞和肥大细胞），在H. pylori诱导的胃部炎症中发挥关键作用。HP-NAP具有免疫原性和免疫调节特性，使其成为H. pylori诊断和疫苗开发的潜在候选分子，同时也是一种新型癌症治疗药物的候选物。为了获得足量高纯度的HP-NAP以用于临床应用，亟需建立一种高效、高产且高纯度的蛋白纯化方法。
在本方案中，我们描述了一种一步法阴离子层析纯化在大肠杆菌中过表达的重组HP-NAP的方法 大肠杆菌 (E. coli) 通过使用二乙氨基乙基（DEAE）离子交换树脂（例如，Sephadex）进行批量纯化。重组HP-NAP约占总蛋白的70% E. coli 在pH 9.0条件下细胞裂解后，几乎全部存在于可溶性组分中。在pH 8.0的最佳条件下，大部分HP-NAP存在于未结合组分中，而内源性蛋白质则来自 E. coli 可被树脂高效去除。
利用DEAE离子交换树脂进行负模式分批色谱纯化的方法，能够以高得率和高纯度从大肠杆菌（E. coli）中获得天然形式且具有功能活性的HP-NAP蛋白。纯化后的HP-NAP可用于幽门螺杆菌（H. pylori）相关疾病的预防、治疗和预后，以及癌症治疗。

重组HP-NAP在负向纯化实验流程示意图 E. coli 通过分批模式使用DEAE离子交换树脂的示例示于 图1该纯化技术基于宿主细胞蛋白及/或除HP-NAP以外的杂质与树脂的结合。在pH 8.0条件下，未结合组分中几乎不回收除天然形式HP-NAP以外的其他蛋白质（图2A 和 B）。通过抗HP-NAP抗体在未结合组分中对纯化的HP-NAP进行免疫检测（图2C），其纯度经银染验证高于97%图 2D）。此外，通过天然PAGE分析发现，纯化的重组HP-NAP保持了其寡聚体形式（图2B) 和凝胶过滤层析（图3A）。圆二色光谱分析表明，纯化的蛋白质主要由α-螺旋构成（图3B）。此外，纯化的HP-NAP能够刺激人中性粒细胞产生ROS（图3C因此，通过该方法纯化的重组H...

一种高产率的一步法负向纯化重组蛋白方法 幽门螺杆菌 幽门螺杆菌中过表达的中性粒细胞激活蛋白（HP-NAP） 大肠杆菌 通过使用二乙氨基乙基树脂进行批次纯化的方法进行了描述。采用该方法纯化的HP-NAP有助于开发针对幽门螺杆菌的疫苗、药物或诊断试剂 H. pylori相关疾病.

幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白（HP-NAP）是幽门螺杆菌（H. pylori）的一种主要毒力因子。它在H. ...

本纯化实验的总体目标是利用二乙氨基乙基离子交换树脂进行负向模式分批色谱法，以高纯度和高得率获得天然形式且具有功能活性的幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白（Helicobacter pylori Neutrophil-activating protein，HP-NAP）。该技术的主要优势在于，HP-NAP 可在一步操作中以其天然形式被纯化，且纯度和得率均较高。HP-NAP 的负向纯化起始于分批结合步骤，即将细菌裂解物的可溶性蛋白组分加入 DEAE 树脂中。孵育混合物以使大量蛋白质结合到树脂上。通过重力流离心收集未结合组分中存在的幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白（HP-NAP）。该技术的意义在于，可实现10:1的幽门螺杆菌相关疾病以及癌症治疗的预防、治疗和预后评估。由于HP-NAP具有免疫原性和免疫调节特性。通常，初次使用该方法的人员会遇到困难。因为HP-NAP在灭菌过程中容易发生聚集。本实验操作由本实验室的研究生 Zhi-Wei Hong 演示。在 4°C 条件下，将按照文本方案制备的 50 毫升细胞沉淀重悬于 20 毫升低盐 Tris 缓冲液（pH 9.0）中，并加入蛋白酶抑制剂混合物。保持样品在 4°C 环境中至关重要，以防止蛋白质聚集。在4°C条件下，将细菌悬液通过高压均质机以15,000至20,000 PSI的压力处理七次，以裂解细菌细胞。细菌裂解后，应立即进行离心。将均质后的样品转移至离心管中。立即在4 °C条件下，以30,000 × g的离心力使用超速离心机离心一小时，以分离可溶性和不溶性蛋白组分。离心后，将上清液转移至烧杯中作为可溶性蛋白组分。根据制造商说明书，使用商用试剂盒并以牛血清白蛋白作为标准品，通过Bradford法测定可溶性蛋白组分的蛋白浓度。然后，将177.6 µL的1 N HCl加入20 mL可溶性蛋白组分中，将其pH值从9.0调节至8.0。向蛋白溶液中加入20 mM Tris-HCl（pH 8.0）和50 mL氯化钠，使最终蛋白浓度达到0.5 mg/mL。为制备15 mL DEAE树脂，将0.6 g DEAE树脂干粉悬浮于30 mL Tris-HCl缓冲液中，在室温下放置至少一天。在4 °C条件下，以10,000 × g离心树脂1分钟，然后移除并弃去上清液。随后加入15 mL Tris-HCl缓冲液。重复离心和重悬步骤4次后，将15 mL沉淀的树脂于4 °C保存，以备后续使用。在 4 摄氏度条件下，将 45 毫升制备好的可溶性蛋白质加入到数毫升树脂中，并转移至含有搅拌子的 100 毫升烧杯中。使用搅拌板在 4 摄氏度下搅拌蛋白质-树脂悬液一小时。随后，将蛋白质-树脂悬液倒入装有旋塞的塑料或玻璃层析柱中，静置使树脂在重力作用下自然沉降。打开活塞，使蛋白溶液在重力作用下流经层析柱，直至柱内液面略高于树脂表面。收集流出液作为未结合组分，其中含有纯化的中性粒细胞激活蛋白。向柱中加入15毫升冰冻的Tris-HCl缓冲液。再次打开活塞，使洗涤缓冲液依靠重力流过层析柱，直至柱内液面降至略高于树脂表面。收集流出液作为洗涤组分。用预冷的冰浴缓冲液重复洗涤四次，以收集额外的洗涤组分。然后向柱中加入15毫升冰冷的20毫摩尔Tris-HCl（pH 8.0）、1摩尔氯化钠。收集流出液作为洗脱组分，操作同前。重复洗脱步骤四次，以收集额外的洗脱组分。此处展示了pH值对HP-NAP在大肠杆菌裂解液中溶解度的影响。在pH 7.5至9.5条件下，该可溶性组分中检测到的HP-NAP含量显著增加。在pH 9.0条件下进行细胞裂解后，重组HP-NAP几乎完全回收于可溶性组分中。此处展示了在批处理模式下，pH值对DEAE树脂负向纯化大肠杆菌表达的重组HP-NAP的影响。在pH 8.0时，洗脱组分中仅有少量HP-NAP存在，而未结合组分中的HP-NAP含量在pH 8.0时最高。DEAE树脂上加载的蛋白质最佳量为每毫升树脂1.5毫克，以实现树脂从大肠杆菌中吸附杂质的最大容量。在pH 8.0条件下，使用DEAE树脂进行批次模式纯化时，未结合组分中除天然形式的HP-NAP外，回收的其他蛋白质极少。HP-NAP的纯度高于95%。纯化的 HP-NAP 折叠形成具有α-螺旋二级结构的多聚体，凝胶过滤色谱图和远紫外圆二色光谱结果揭示了这一点。管腔依赖性化学发光检测显示，纯化的 HP-NAP 能够触发中性粒细胞产生活性氧。一旦掌握，若操作得当，这些技术可在五小时内完成。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用二乙氨基乙基（DEAE）阴离子交换树脂，通过负向批次层析法以高得率和高纯度纯化天然形式的功能性 HP-NAP。在进行该实验操作时，需特别注意在批次层析的灭菌步骤中使用适当 pH 的缓冲液。我们最初提出该方法的构想，源于尝试采用其他层析技术替代过滤法，以实现对天然形式 HP-NAP 的纯化。 尽管该方法旨在通过大肠杆菌表达的重组HP-NAP进行诱导，但也可应用于其他细菌表达系统，如per-sida sep-tidas。该方法的可视化演示为快速代码。此外，灭菌和批次层析步骤较难掌握，因为这些操作必须在4°C条件下无缝衔接地进行，不能有任何时间延迟。如果目标纯化的蛋白质适用于我们的负向置换层析，则该方案也可作为开发纯化工艺的起点。该技术问世后，为临床研究领域的研究人员探索将HP-NAP应用于癌症治疗以及幽门螺杆菌相关疾病的疫苗、药物和诊断方法的开发铺平了道路。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

一步法负色谱纯化<em&gt;幽门螺杆菌</em&gt;中性粒细胞激活蛋白过度表达<em&gt;大肠杆菌</em&gt;在批处理模式

结合质谱技术的标签蛋白亲和纯化（APMS）是一种强大的方法，可用于系统性绘制蛋白质相互作用网络，并研究生物过程的分子机制基础。本文中，我们描述了一种为大肠杆菌（Escherichia...

蛋白质复合物的鉴定 大肠杆菌 使用连续肽亲和纯化与串联质谱联用技术

来源：Kuo, T., et al. 一步法负向色谱纯化在Escherichia coli中过表达的Helicobacter pylori中性粒细胞激活蛋白（批处理模式）。J. Vis. Exp.

负离子交换色谱法选择性纯化细菌蛋白

来源：Becker, B., et al．一种基于荧光报告基因的简易检测方法，用于鉴定酵母中蓖麻毒素A链（RTA）转运所需的细胞组分．J. Vis. Exp.

一种用于纯化重组细菌蛋白的亲和层析技术

本视频展示了利用亲和液相色谱纯化组氨酸标签自组装蛋白纳米颗粒（SAPNs）的方法。所获得的纯化SAPN组分适用于疫苗开发，在潜在的免疫治疗应用中具有广阔前景。...

使用亲和层析纯化自组装蛋白质纳米颗粒

类弹性蛋白多肽是一类对刺激响应的生物聚合物，其应用范围从重组蛋白纯化到药物递送。本方案描述了利用类弹性蛋白多肽及其肽段或蛋白融合物在大肠杆菌（Escherichia...

非色谱法纯化重组弹性蛋白样多肽及其与肽和蛋白质的融合产物，源自大肠杆菌（Escherichia coli）

本文介绍了一种纯化组氨酸标签焦磷酸激酶酶的方法，并利用放射性标记底物及产物的薄层色谱分析来检测其酶活性。...

一种纯化与 体外 一种(p)ppGpp合成酶的活性检测 艰难梭菌

本文提供了一种详细的方法，用于自组装蛋白纳米颗粒（SAPNs）的纯化、复性及表征，以应用于疫苗开发。...

E. coli表达的自组装蛋白质纳米颗粒的制备：适用于需要三聚体表位呈递的疫苗

多列柱适配器可将层析柱与多孔收集板连接，用于并行亲和或离子交换纯化，提供一种经济高效的高通量蛋白质纯化方法。该方法可在重力或真空条件下使用，通过价格适中的仪器即可获得毫克级蛋白质。...

一种使用多柱板适配器的经济且通用的高通量蛋白质纯化系统

本研究建立了一种基于双抗体的夹心检测法，用于快速检测感染幽门螺杆菌（Helicobacter...

粪便抗原的快速检测 幽门螺杆菌 基于双抗体夹心检测技术的感染检测

本文介绍了一种在C41(DE3)表达系统中过表达重组Nsp15（一种具有毒性的核酸酶）的方法，随后通过亲和层析和尺寸排阻层析纯化带标签的蛋白。这些方案可适用于其他难以表达的毒性蛋白。...

过表达并纯化一种来自 Escherichia coli 的毒性核酸酶

本方案描述了一种快速、可重复的基于有机溶剂的提取与沉淀方法，用于从大肠杆菌（Escherichia...

高效利用基于有机溶剂的提取与沉淀法从大肠杆菌（E. coli）中纯化弹性蛋白样多肽（ELPs）

学习使用DEAE树脂批处理负色谱法从大肠杆菌中一步纯化幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白，获得高纯度天然蛋白，助力疫苗与药物研发。

一步法负向色谱纯化幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白过表达于大肠杆菌批量模式

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