Name: 气魄，侵略和浅水测定斑马鱼行为综合征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: 学习使用斑马鱼行为综合征标准化方法观察分析胆量、攻击性和集群行为。该技术可应用于进化理论、种群动态及药理学、行为遗传学等跨学科研究领域。

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本工作得到了霍华德·休斯医学研究所教育资助以及圣约瑟夫大学西格玛赛分会内部资助的支持。我们还要感谢三位匿名审稿人，他们帮助加强了本方案的严谨性和解释的准确性。

以下关于斑马鱼的饲养、护理和研究方法均已获得圣约瑟夫大学动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 斑马鱼的饲养与护理
<ol>
	<li>从本地供应商或野生种群中获取实验用斑马鱼。请注意，饲养斑马鱼需遵守IACUC指南，且饲养野生捕获种群需要额外的许可。</li>
	<li>根据性别识别并分离斑马鱼。或者，可根据研究假设跳过此步骤，或采用其他分离方法。 
	注意：斑马鱼的性别特征较难判断，尤其是雌性个体。请参考这些指南10或有用的在线手册以区分性别。</li>
	<li>将种群进一步随机分为适当比例的实验鱼与刺激鱼。注意：实验鱼是指在一系列行为检测中被持续观察的测试个体，而刺激鱼则是占据攻击性和群集行为检测中刺激腔室的个体。 
	注意：传统上，在群集行为检测中每条实验鱼对应1至5条刺激鱼，而在攻击性检测中采用1:1的刺激鱼与实验鱼比例14,17。然而，研究人员需根据研究假设具体设计实验（例如，是否应保持刺激鱼不变以维持实验鱼行为的一致性，或是否应在每次检测之间轮换刺激鱼以确保充分随机化）。</li>
	<li>将所有鱼类饲养于斑马鱼养殖架中（27.5–28.5 °C），并维持严格的12小时光照/12小时黑暗循环。在非实验日，每天投喂实验鱼和刺激鱼薄片饲料，每周投喂一次卤虫。</li>
	<li>确保所有测试均在ZT1至ZT5（时间授时因子时间）之间进行，以避免昼夜节律的影响26。</li>
</ol>
2. 随机分组与水箱设置
<ol>
	<li>随机化所有个体 先验的 到特定的行为实验序列。使用在线随机序列生成器建立一致的随机化方案27 或使用统计软件包（R）中的随机序列生成器。
	<ol>
		<li>将每次实验按1到3编号，并保持编号一致。为每个个体分配一个随机序列，并根据行为实验的编号映射该序列。例如，对于三项实验（1对应群集行为，2对应大胆性，3对应攻击性），某个个体的随机序列为“2,3,1”，则该个体需按此顺序依次完成相应的行为实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在实验室中设置行为实验水箱（用于 Boldness、Aggression 和 Shoaling 实验）时，应选择能最大限度减少外界不良刺激的位置，并确保留有足够空间以便摄像机完整拍摄整个水箱。摄像机应具备足够清晰度，能够清楚识别水箱标签，并能分辨目标鱼的细微行为，将摄像机置于符合上述要求的位置。</li>
	<li>使用摄像机记录所有行为学实验时，应保持摄像机位置固定，并确保完整视野覆盖指定的实验缸，以尽量减少因录制条件差异导致的行为评分偏差。 
	注意：避免将鱼缸放置在人员频繁走动的区域或门附近，因为移动和噪音会影响斑马鱼的行为。</li>
	<li>建立独特的 JWatcher 协议24 用于对每项行为实验进行评分。请参考 JWatcher 手册，学习如何创建焦点主文件以将行为分配给键盘按键，以及如何创建焦点分析文件以汇总收集的数据。 
	注：JWatcher 是一种行为评分软件，可实现可靠且可重复的定制化行为评分24.</li>
	<li>定义一种标记方案，用于记录所有行为实验的日期、鱼编号和实验编号例如， “F5-B-123115”表示第5号鱼，胆量实验，于12月31日进行st，2015）并在水箱外侧贴上标签，确保标签在摄像头视野内且对焦清晰。将此信息记录在实验记录本中，以便快速查阅和后续质量控制。</li>
	<li>在所有检测之间以及个体从饲养架取出后，均使用一个驯化水箱进行适应。 
	注意：驯化箱和终点箱为小型水族箱（40 cm × 20 cm × 25 cm），内含砾石和过滤器，其环境与饲养架高度相似。</li>
	<li>所有实验完成后，将个体转移至一个独立的终末饲养缸中，该饲养缸将作为所有已使用焦点个体的最终安置容器。选择足够大的饲养缸，以容纳这些个体在余下的生命周期中共同生活（例如， 25 加仑 
	注意：所有水箱中的水温及环境条件必须保持一致且相似，包括饲养、适应及所有测试用的水箱。</li>
</ol>
3. 进行攻击行为检测
<ol>
	<li>在尺寸为 30 cm × 15 cm × 10 cm 的 19 L 长方形水族箱中进行攻击行为检测。用水族箱外部不透明隔板遮挡其三侧，仅留前面用于观察，以减少不必要的外界刺激。通过外部标记将水族箱划分为四个相等的矩形象限，并在左下象限内永久固定一面镜子（使用硅胶密封剂），使其与水族箱最左侧壁呈 22.5° 倾斜，形成一个直角三角形结构。</li>
	<li>确保驯化水族箱和攻击行为检测水族箱中的水温与饲养架水温相差不超过 2 °C。为此，需提前准备好已除氯并预热至 27.5–28.5 °C 的新鲜水，用于加入攻击行为检测水族箱。请注意，每次检测之间必须更换水体，以消除不必要的嗅觉线索。</li>
	<li>用手持小杯的方式将一条目标鱼从饲养架转移至单独的驯化水族箱中，使其适应环境 10 分钟。 
	注意：必须尽量减少因操作不当而对鱼造成的刺激。个体转移方法应如前所述27。
	<ol>
		<li>具体操作为：手动小心地将一个小型透明塑料杯放入目标鱼所在的水族箱中。在不惊扰鱼的前提下，缓慢将鱼连水一并舀入杯中，避免使用网具转移所造成的干扰。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在将个体转移至攻击行为检测水族箱前，确认摄像机已准备就绪，并确保攻击行为检测水族箱（见步骤 3.1）处于清晰对焦状态，随后立即启动设备开始录像。通过手持小杯的方式将目标鱼从驯化水族箱转移至攻击行为检测水族箱。 
	注意：必须在鱼进入攻击行为检测水族箱之前开始录像，以便准确记录其进入时间。</li>
	<li>对攻击行为检测水族箱连续录像 10 分钟 30 秒，随后用小杯将目标鱼从攻击行为检测水族箱转移回驯化水族箱。</li>
	<li>回放录像时，在鱼被放入水族箱后需等待 30 秒，作为额外的适应期，之后再开始行为评分。</li>
	<li>使用为攻击行为定义的 JWatcher 行为分析系统，对以下行为进行 10 分钟的定量分析：靠近镜子的时间、接近镜子的次数、快速冲刺次数、试图咬击次数（朝向镜子张口）、以及侧身展示次数（背鳍、胸鳍、臀鳍和尾鳍竖起）9。</li>
	<li>每项攻击行为检测至少独立评分两次，直至各次评分结果之间具有高度一致性。</li>
</ol>
4. 进行胆量测定实验
<ol>
	<li>在小型1.5 L梯形水箱中进行胆量行为测试，水箱尺寸为高15 cm × 上底26.5 cm × 下底22.5 cm × 宽6 cm。用水不透明纸包裹水箱四周，仅留前面用于观察。在水箱外侧贴一条细胶带，以区分水箱的上部与下部区域。</li>
	<li>确保胆量测试水箱中的水温与饲养架水温相差不超过2 °C（见步骤3.2）。</li>
	<li>将目标鱼从饲养架转移至适应水箱（见步骤3.3），静置适应10分钟。</li>
	<li>确保摄像机已准备就绪，可开始录制胆量行为测试；在准备转移目标鱼时，启动设备开始录制。将目标鱼从适应水箱转移至胆量测试水箱，并持续录制8分30秒。</li>
	<li>观看录像时，在鱼被放入水箱后，额外给予30秒的适应期，之后再开始行为评分。</li>
	<li>使用JWatcher软件对8分钟内的胆量相关行为进行量化分析。具体行为指标包括：靠近水面的时间、进入上部区域的潜伏期、进入上部区域的次数，以及异常运动（急冲）的次数29。</li>
	<li>每项胆量行为测试至少独立评分两次，直至各次评分结果间达到高度一致性。</li>
</ol>
5. 进行群集行为实验
<ol>
	<li>在容积为76 L的实验水箱中进行群集行为实验，该水箱由两块用硅胶密封的玻璃隔板分隔成三个区域（形成两个刺激区和一个焦点鱼所在区）。在水箱外部标记两个偏好区域，分别距离每个刺激区的玻璃隔板6.35 cm，相当于两条鱼体长30。在群集实验水箱的外侧三面安装不透明隔板，仅保留正面用于观察。 
	注意：可根据不同体型物种的研究假设，自定义该偏好区域的范围。</li>
	<li>根据研究目的，选择用于刺激的鱼群，并在测试前至少适应环境12小时，且在整个实验过程中持续保留在群集实验水箱中。 
	注意：刺激鱼群是指用于评估焦点鱼在有无这些鱼群存在时行为反应的一组个体鱼。可通过选择不同的刺激鱼群组合，检验多种多样的群集行为假设。每次实验后应轮换刺激鱼群在两个刺激区之间的位置，以避免侧向偏好偏差，同时确保刺激鱼群在测试前至少有12小时的适应期。</li>
	<li>将焦点鱼转移至适应性水箱中，操作方法如前所述（见步骤3.3）。</li>
	<li>用手杯法将焦点鱼从中间的适应性水箱转移至群集实验水箱的中央区域。</li>
	<li>在开始10分钟的实时行为记录观察期之前，先给予10分钟的适应时间。也可选择录制群集实验视频，后续使用JWatcher软件进行行为分析。当焦点鱼位于目标鱼群所在腔室的偏好区域内时，判定其处于群集状态。</li>
	<li>量化焦点鱼在每个偏好区域中停留的时间，以及在中央区域停留的时间。</li>
	<li>作为额外的描述性指标，可计算“群集强度”（SoS）。赋予一个介于-1到+1之间的数值，其绝对值表示个体鱼进行群集行为的频繁程度。</li>
	<li>计算群集时间与群集区域面积的比值，减去非群集时间与非群集区域面积的比值，再将所得结果除以各区域停留时间与其各自体积比值之和。有关该计算方法的更多细节可参见先前的研究14。</li>
</ol>
6. 数据质量控制
<ol>
	<li>使用传统的数据分析工具分析数据31-32。</li>
	<li>对所有行为数据使用非参数Levene检验进行方差齐性检验。若某行为数据方差不齐，则进行对数转换33。</li>
	<li>在方差齐性的数据上，使用Kruskal-Wallis方差分析检验是否存在序列效应（即随机化顺序未影响个体行为）34。</li>
	<li>通过以侧边为固定因子，对SoS指数构建单变量一般线性模型，验证群集实验中是否存在侧边偏好偏差35。 
	注意：若数据基本无问题，可进行后续分析；若存在问题，应通过额外的数据转换、生物学上合理的解释进行调和，和/或增加样本量。</li>
</ol>
7. 分析数据
<ol>
	<li>分别在胆量和攻击性测试中，对所有行为计算双尾Spearman等级相关系数36。</li>
	<li>对于同一受试个体多次进行的行为测试，采用双因素混合模型并基于一致性计算组内相关系数（ICC）36。在此情况下，ICC用于衡量某条鱼在多次重复测试中行为表现的一致性程度。</li>
	<li>对胆量和攻击性行为数据进行预处理，通过中心化和标准化所有行为变量，为后续主成分分析（PCA）25的输入做准备。 
	注意：通过中心化和标准化对测量值进行预处理是至关重要的步骤。若不进行此步骤，发生频率较高或变异性较大的行为将过度影响所提取主成分的解释结果。中心化和标准化过程可消除此类偏差。</li>
	<li>利用相关矩阵进行主成分分析（PCA），以判断胆量与攻击性是否共同构成一种行为综合征。将各主成分中载荷值大于&#62;0.6的行为视为具有显著意义并予以解释。有关行为学研究中PCA结果报告的全面指南，请参见Budaev 201024。碎石图有助于判断应保留哪些特征向量用于解释。</li>
	<li>使用R或SPSS等统计软件包31,32，提取每个个体在各主成分上的得分。该得分表示特定个体的行为在多大程度上可由该主成分解释。</li>
	<li>计算因子回归得分与群集行为强度之间的Spearman等级相关系数36。 
	注意：若胆量和攻击性行为共同载荷于同一主成分，或任何具有显著可解释载荷的主成分与群集行为强度存在相关性，则认为存在行为综合征。此外需注意，群集行为强度未被纳入PCA分析，以便更清晰地解释更为复杂的行为量化指标（即胆量和攻击性）。PCA将正交压缩胆量和攻击性特征为若干特征向量，以最大化解释变异量，因此特别适用于此类复杂测量。通过解释所得特征向量，并将群集行为强度测量值对每个特征向量进行回归，可更直观地理解这些复杂行为（胆量和攻击性）如何与一个定义更明确的二元群集行为指标（i.e., 鱼是否参与群集）相关联。</li>
</ol>

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作者（GW 和 SPM）不存在任何竞争性财务利益或利益冲突。

本方案旨在确定斑马鱼在胆量、攻击性和群集行为方面是否存在一致的行为关联。如果在特定种群中，上述任何行为之间存在稳定的相关性，则表明存在行为综合征。通过研究种群的自然行为综合征，研究人员可以更全面地理解其行为动态、种群结构以及可能的进化历史3。此外，通过操控影响这些行为综合征的环境因素——例如在药理学6、毒理学7、行为遗传学8,9和内分泌学10研究中——有助于揭示不同因素如何影响行为之间的关联。本方案中所描述的攻击性-胆量-群集行为综合征的具体构成，涵盖了模式生物斑马鱼中已被广泛研究的常见行为11-13。尽管该方法可应用于任何鱼类物种，但斑马鱼的广泛应用可能有助于本方案在跨学科领域的标准化。上述每种行为检测方法相比其他类似技术更易于控制和操作。例如，攻击性检测采用倾斜镜面诱发更广泛的行为反应，而非使用活体或黏土模型、视频刺激或垂直镜像刺激17。胆量检测中的行为指标相比T型迷宫或大型开放场测试更易于量化15。最后，本方案所描述的群集行为检测能够轻松追踪个体行为，这对于...

越来越多的研究文献开始探讨同一群体中个体动物不同行为之间的关联。这类关联被称为行为综合征，其测量指标通常包括大胆性、攻击性、探索行为和社会性1-5。行为综合征具有直接和间接的重要价值。直接而言，对行为综合征的认识有助于更全面地理解进化理论、种群结构和种群动态3；间接而言，有关行为关联的知识可为药理学6、毒理学7、行为遗传学8,9和内分泌学10等量化行为的学科提供参考。由于这些直接与间接的价值，深入了解行为综合征在常用模式生物（如斑马鱼）中尤为重要。斑马鱼的研究广泛分布于多个学科领域，其中包括行为综合征的分析11-13。为了推动行为综合征研究的发展，并考虑到其他学科也常利用行为测量进行假设检验，必须提供可靠且简洁的行为描述，以确保分析与解释的有效性，同时标准化的实验方案将有助于同一物种内不同研究之间的比较。本实验方案旨在测量一组实验室饲养的斑马鱼群体中的大胆性—攻击性—群集性行为综合征14。然而，该方案的基础（如对个体鱼的行为追踪、确保适当的随机化以及合理的数据分析）可轻松调整，以适用于多种其他行为测量。此外，大胆性、攻击性或群集性检测也可单独进行，以检验特定假设。因此，尽管我们的目标是描述如何开展行为综合征研究以及成功实现个体水平行为测量的实验流程，但该程序的各个组成部分均可独立使用。
关于行为综合征的研究文献涵盖了多个分类群，从节肢动物到人类4。为了测量一种行为综合征，必须对至少两种行为情境进行量化。然而，目前在不同行为维度上用于量化行为的实验方法往往缺乏一致性。例如，在鱼类中，胆量（boldness）可通过T型迷宫实验、开放场实验或引入新异刺激或外来刺激来评估15。鱼类的攻击性研究可能涉及成对个体互动、视频刺激实验或黏土模型实验12,16,17。同样，对群集行为（shoaling behavior）的分析通常包括对同伴偏好程度的测量，可在不同类型的水族箱中进行，并采用不同的方法来确定个体的接近或伴随时间21-23。本实验方案介绍了一套特定的行为测试子集，具体而言，该方案提供了一种方法，可对个体在胆量、攻击性和群集行为测试中的表现进行追踪，从而便于在个体内部进行比较，以判断这些行为特征在种群内所有个体中是否具有一致性。我们在此前的研究中已将该方案应用于斑马鱼和慈鲷鱼（Amatitlania nigrofasciata）14,18，该方法也适用于其他体型相似的淡水鱼类。
在1.5 L的梯形水箱中进行胆量实验，水箱内有一条水平线将水箱上下两部分划分为面积相等的区域。量化的行为包括测试鱼在水箱上下部分之间的穿越次数、在每个区域停留的时间、 dart（快速冲刺）次数以及首次进入上部区域的潜伏期。攻击性实验在19 L的矩形水箱中进行，水箱左下角放置一个3英寸×5英寸的镜子，倾斜角度约为22°19。量化的行为包括目标鱼与镜像互动的总时间20，以及特定的攻击性指标——咬击次数、侧身展示次数、测试鱼与其镜像之间的dart次数。对于这些特定指标，咬击定义为张口快速冲向镜子的动作；侧身展示定义为朝向镜子方向展开侧鳍、胸鳍、臀鳍和背鳍；dart则指任何不朝向镜子的突发性不规则运动。最后，群集行为实验用于量化测试鱼在三室水箱中央腔室中的行为。水箱的两个侧腔室要么为空，要么包含一个&#34;目标鱼群&#34;，测量测试鱼在每个侧腔室附近停留的时间21-23。针对每个个体测试鱼，根据特定刺激计算出一个综合评分，称为群集强度（Strength of Shoaling, SoS），可用于后续分析14。所有行为均由单个观察者或多个观察者使用名为JWatcher的免费行为量化软件进行评分24。
检验行为综合征的存在主要是一项统计学工作，建议遵循Budeav 2010年提出的相关指南25建议对经过中心化和标准化处理的数据进行主成分分析（PCA），其中输入数据为个体在包含多项行为测量指标的实验中所表现出的行为向量。即， 大胆性和攻击性）。对相关性矩阵进行主成分分析（PCA），可降低行为测量数据的维度，从而提取出能够解释大部分变异的最重要信息。随后可根据个体行为对应的高因子载荷来解释提取出的主成分，并基于这些解释性主成分计算每个个体的回归得分。这些回归得分可进一步与SoS测量值以及其他各类非行为学测量指标（如鱼体大小或性别）进行比较。
该工作流程已应用于斑马鱼行为综合征的研究中，并发现了一种存在于雄性个体中的特定性别行为综合征，即大胆性与群集行为之间的关联14。在此情况下，更大胆的雄性斑马鱼更倾向于与体型较大且更具攻击性的白线斑马鱼（D. albolineatus）聚集，但这种关联在雌性中并不存在。该工作流程还被用于对未成年 convict 慈鲷（Amatitlania nigrofasciata）亲缘关系的研究18，但未发现明显的行为综合征，这可能表明该物种具有行为可塑性。因此，本方案旨在明确三种特定行为检测（大胆性、攻击性和群集行为）在个体水平行为综合征研究框架中的性质。

<table><tbody><tr><td>斑马鱼 Rack 系统</td><td>Aquaneering 公司</td><td>货号 ZS550</td><td></td></tr><tr><td>Pet Valu 热带鱼粮，224.0 克</td><td>宠物价值</td><td>货号 # 31700</td><td></td></tr><tr><td>优质卤虫卵，16盎司</td><td>卤虫直接法</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 L 梯形培养箱</td><td>Pentair 水生生态系统</td><td>货号 itsts-a</td><td></td></tr><tr><td>19 L 矩形水箱</td><td>那条鱼的地方</td><td>211932</td><td></td></tr><tr><td>76 L矩形水箱</td><td>那条鱼的地方</td><td>212180</td><td></td></tr><tr><td>日立 KP-D20A CCD 相机</td><td>Prescott公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>尼康 AF Nikkor 35-105 mm f/3.5~4.5s MACRO 镜头</td><td>尼康公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ArtMinds 方形镜子，经济装，3 件装&quot; × 3&quot;</td><td>Michaels</td><td>货号 # 10334162</td><td></td></tr><tr><td>Jwatcher</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPSS Statistics Base</td><td>IBM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R</td><td>R 基金会</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

斑马鱼行为综合征的勇敢性、攻击性和群集行为检测

Boldness, Aggression, and Shoaling Assays for Zebrafish Behavioral Syndromes

当特定行为在不同情境下相互关联时，即存在行为综合征。斑马鱼在近期研究中被用作实验对象，因此标准化实验方案对于确保分析和解释的准确性至关重要。在我们之前的研究中，通过监测一系列行为（在水面附近的时间、转移潜伏期、转移次数和快速冲刺行为），在1.5 L的梯形水箱中评估了斑马鱼的胆量。同样，在19 L的矩形水箱中，通过观察咬合行为、侧身展示、快速冲刺行为以及在倾斜镜面附近停留的时间来量化攻击性。通过将76 L的水箱均分为三部分，我们还考察了群集偏好。群集实验是一种高度可定制的实验方法，可根据具体假设进行调整。然而，该实验的方案也必须实现标准化，同时保留足够的灵活性以支持个性化修改。在以往的研究中，末端腔室或为空置，或包含5条或10条斑马鱼，或包含5条珍珠丹鱼（D. albolineatus）。在下文的手稿中，我们提供了一套详细的实验方案及代表性数据，以支持该方案的成功应用，从而实现行为综合征实验的可重复性。

根据研究的性质和所采用的具体方案，行为综合征实验可能产生多种不同的结果。下表和下图（如标注所示）改编自我们先前发表在《行为过程》期刊14和《斑马鱼》期刊17的研究。当完整实施上述方案时，预期将得到两组结果：“单次实验内的相关性”和“不同实验间的相关性”（图1）。
第一组结果描述了单次实验内的重复性。具体而言，这些结果分别描述了在胆量实验和攻击性实验中，各项行为指标在单个实验内部的相互关联性。表1和表2展示了胆量实验和攻击性实验中预期的相关性模式，所呈现的数据改编自先前的一项研究14。在胆量实验中，预期在水箱上半区域的穿梭次数与停留时间呈正相关，而进入上半区域的潜伏期则呈负相关。针对在胆量实验水箱（见步骤4.1）中测量的行为胆量维度个体，其代表性结果见表1...

本文描述了斑马鱼在胆量、攻击性和群集行为方面的实验设置、实施与分析方法，并检测是否存在行为综合征。采用标准化的行为量化方法将有助于不同研究之间的比较。本实验方案可根据需要进行修改，每种行为检测均可独立进行。

当特定行为在不同情境下相互关联时，即存在行为综合征。斑马鱼在近期研究中被用作测试对象，且其……

本实验方案的总体目标是标准化用于观察、分析和解读斑马鱼（Zebrafish）中大胆性、攻击性和群集行为综合征的方法学。该方法可直接用于解答进化理论、种群结构和种群动态领域中的科学问题。当与跨学科技术相结合时，还可应用于药理学、毒理学、行为遗传学和内分泌学等领域。该技术的主要优势在于，斑马鱼的 boldness（大胆性）、aggression（攻击性）和 shoaling（群集行为）组合涵盖了众多经过深入研究且易于量化的生物学行为。此外，每种检测方法均可根据不同的实验目的进行调整。首先，将斑马鱼随机分配为适当的实验鱼与刺激鱼的比例。将所有斑马鱼饲养在斑马鱼养殖架中，严格保持12小时光照/12小时黑暗的光照周期。每天向所有目标鱼和刺激鱼投喂薄片饲料，并仅在非实验日每周投喂一次卤虫。接下来，在实验室中设置三个实验水箱，分别用于测试攻击性、胆量和群集行为，放置位置应尽量减少不利的外部刺激干扰，并预留足够空间以便视频摄像机能够完整拍摄整个水箱。设置视频摄像机，确保其具有足够的清晰度，能够看清鱼缸标签，同时能够分辨目标鱼的细微行为。在所有行为实验记录过程中，保持摄像机位置固定，并完整覆盖鱼缸视野，以尽量减少因拍摄差异导致的行为评分偏差。接下来，制定标签方案，用于记录所有行为实验的日期、鱼编号和实验编号。用胶带在水箱外侧标记，确保摄像机可以拍摄到。将此信息记录在实验记录本中，以便快速查阅和后续质量控制。最后，设置一个驯化水箱，用于所有检测之间以及个体从饲养架取出后立即使用。首先准备一个19升的矩形水箱，尺寸为30厘米×15厘米×10厘米。在水箱外侧用不透明隔板遮挡攻击水箱的三个侧面，仅留前面暴露用于观察，以减少不必要的外界刺激。通过外部标记将水箱均分为四个相等的矩形象限。使用硅胶密封剂将一面镜子固定在左下象限内，镜面倾斜22.5度，与水族箱最左侧边形成直角三角形。准备已预热至27.5至28.5摄氏度的新鲜陈化水，以便加入攻击行为观察箱中，确保驯化箱与攻击行为观察箱内的水温与养殖架水温相差不超过2摄氏度。从养殖架中用网捞取一条目标鱼，转移至独立的驯化箱中，使其适应环境10分钟。确认摄像机已对准攻击行为检测装置中的鱼缸，然后按下录制按钮。随即通过杯子将待测鱼从适应缸转移至攻击行为检测缸中。对攻击行为检测缸持续录制10分钟30秒。然后，将攻击性测试 tank 中的目标鱼重新舀回适应 tank 中。在实验结束后观看录像时，在鱼被放入 tank 后需等待 30 秒，作为额外的适应期，再开始行为评分。最后，每项攻击性实验至少重复评分两次，直至各次评分结果之间达到高度一致性。为建立胆量测定实验，首先准备一个小型1.5升的梯形水箱，高15厘米，顶部宽26.5厘米，底部宽22.5厘米，宽度为6厘米。用水箱三侧包裹不透明纸张，仅留前面用于观察。在水箱外侧贴一条细胶带，以划分水箱的上部与下部区域。接下来，确保 boldness tank 中水的温度与饲养架的温度相差不超过两摄氏度。将目标鱼从饲养架转移到适应性水箱中，并使其适应10分钟。确保视频摄像机对准 boldness assay，并在设备上按下录制按钮。立即将目标鱼从适应性水箱转移至胆量测试水箱，记录8分30秒。实验结束后观看录像时，在鱼被引入水箱后额外给予30秒适应期，再开始评分。最后，每项胆量测试至少重复评分两次，直至各次评分结果高度一致。为建立群集行为实验，准备一个76升的水箱，该水箱由两块用硅胶密封的玻璃隔板分隔成三个区域。在水箱外部，用胶带标记两个偏好区域，分别位于距每块玻璃隔板6.35 cm的位置，以划定每个刺激区域。在群集水箱的三个外侧加装不透明隔板，仅留前面用于观察。接下来，选择用于刺激的鱼群，在测试前至少驯养12小时，并使其在整个实验过程中始终留在群游水箱中。将目标鱼从饲养架中用容器转移至一个独立的驯养水箱中，使其适应环境10分钟。然后，再通过容器将目标鱼从驯养水箱转移至群游水箱的中央区域。在开始10分钟的实时评分观察期之前，先让鱼适应环境10分钟。在观察期间，若鱼位于容纳目标鱼群的腔室中的偏好区域，则定义为群集行为。接下来，量化每条鱼在各偏好区域以及中央区域所停留的时间。最后，在实验结束后，将鱼转移至一个独立的终末水箱，该水箱将作为所有已使用实验个体的最终安置容器。本方案研究了斑马鱼在攻击性、大胆性以及群集行为方面的一致性关联，以确定是否存在行为综合征。其中，组分一代表攻击性行为，而组分二与大胆性行为相关。由于攻击性和大胆性行为并非由同一组分所表征，因此可以得出结论：斑马鱼中不存在大胆性-攻击性行为综合征。一旦掌握，单条目标鱼类的整个实验流程可在70分钟内完成。在实施该操作时，重要的是要确保您及团队成员熟悉每一种目标行为，以尽量减少观察者偏差。对同一段视频记录进行多次评分也有助于提高结果的可信度。通过此操作步骤，还可进一步在药理学、遗传学或生理学领域采用其他方法，以探讨影响行为综合征的内外因素。观看本视频后，您应能充分理解如何观察、分析并解读斑马鱼的胆量、攻击性和群游行为综合征。感谢观看，祝您的实验顺利！

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气魄，侵略和浅水测定斑马鱼行为综合征

我们开发了视觉-运动反应方法，用于定量分析幼年斑马鱼对光强增加和减少的运动输出。我们还研究了斑马鱼的视觉突变体，包括在另一种视觉检测方法——视动反射检测中被认为完全失明的无视动反应（nrc）突变体。...

测量斑马鱼对光强度变化反应性的行为学实验

本视频介绍了斑马鱼幼鱼的回避行为和接触趋向性实验。视频考察了斑马鱼幼鱼对视觉厌恶刺激的行为反应。...

斑马鱼回避与趋触性检测：一种高通量检测幼鱼对厌恶性视觉刺激行为反应的方法

本文描述了一种用于研究斑马鱼攻击行为的实验方法。该方法利用一面简单的镜子，观察斑马鱼对其自身镜像的行为反应。...

攻击行为实验：一种研究斑马鱼对镜像产生攻击行为的方法

关键词：攻击行为，斑马鱼，镜像刺激，行为分析，社会行为，动物模型，神经行为学

本实验室开发了一种新型高通量自动成像系统，可用于检测7日龄斑马鱼幼鱼的多种不同行为。该系统适用于在幼鱼暴露于环境毒物或药物后，检测其行为发生的细微变化。...

斑马鱼幼体的自动化高通量行为分析

介绍了一种可追踪单条及群体斑马鱼的三维自动视频系统。作为应用示例，我们探讨了NMDA受体拮抗剂MK-801对斑马鱼群行为的影响。...

使用自动化三维追踪系统记录成年斑马鱼个体及鱼群行为

本文描述了一种通过行为学方法简单测量成年斑马鱼应激反应的技术。该方法利用了斑马鱼在应激状态下倾向于停留在水箱下半部分的先天行为特征。我们还介绍了将该检测方法与药理学实验相结合的技术。...

研究斑马鱼先天应激的动物行为学方法

我们介绍了一种用于评估认知功能的行为实验装置。我们提供的数据显示，斑马鱼在完成任务后8周仍能记住该任务。我们还发现，高血糖斑马鱼的认知表现发生改变，表明该实验范式适用于认知与记忆相关研究。...

利用斑马鱼作为模式系统进行的三室选择行为实验

本实验方案的目的是阐述建立和使用成年斑马鱼社会偏好检测方法的必要步骤，并证明该方法可用于表征乙醇诱导的社会行为缺陷。...

在斑马鱼中建立胎儿酒精谱系障碍模型以表征不良胚胎环境对成年社会行为的影响

本文介绍了一套全面的行为测试组合，包括新奇水箱、群集和社会偏好测试，可用于通过单个水箱有效评估化学品（如甲基苯丙胺和草甘膦）对成年斑马鱼的潜在神经毒性效应。该方法与神经毒性和环境研究密切相关。...

使用单一水箱中的一系列行为学测试评估成年斑马鱼（Danio rerio）的神经毒性

本方案建立了一种在MPTP处理的斑马鱼幼虫中进行行为表型分析的范式，用于评估类似帕金森病的运动和非运动功能缺陷。...

基于行为学实验的MPTP诱导斑马鱼幼鱼帕金森病样行为表型分析

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使用三室开放式自由游动实验检测斑马鱼（Danio rerio）社会偏好行为的低成本替代方法

学习使用斑马鱼行为综合征标准化方法观察分析胆量、攻击性和集群行为。该技术可应用于进化理论、种群动态及药理学、行为遗传学等跨学科研究领域。

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