Name: 形成用凝胶辅助补液巨型的聚合物囊泡 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 45 s
Description: 了解凝胶辅助再水化法快速制备巨型聚合物囊泡的技术。该方法可调控囊泡尺寸分布，高效生成完整单层囊泡，适用于生物膜物理特性研究与生物工程应用。

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我们衷心感谢 Ian M. Henderson 博士、Andrew Gomez 和 Walter F. Paxton 博士在本研究中提供的专业技术、建议和帮助。本工作得到了美国能源部基础能源科学办公室材料科学与工程分部（BES-MSE）的资助。ACG、DYS 和 GDB 得到了 BES-MSE 的支持。本工作部分在集成纳米技术中心完成，该中心是美国能源部（DOE）科学办公室下属的科学用户设施（用户项目编号 RA2015A0004，项目负责人：ACG）。

1. 聚合物和琼脂糖的制备
注意：在整个实验过程中，必须始终佩戴手套和实验服。在使用任何有机溶剂或任何可能产生飞溅的步骤中，还必须佩戴护目镜。
<ol>
	<li>在玻璃小瓶中，将5 mg固体聚环氧乙烷-b-聚丁二烯（PEO-PBD, EO22-BD37）两亲性嵌段共聚物加入1 ml氯仿中，配制成5 mg/ml的聚合物溶液，轻轻旋转至完全溶解。所有涉及氯仿的操作均须在化学通风橱中进行。</li>
	<li>将荧光标记脂质（已预先溶于氯仿中购得）以0.5 mol%的终浓度加入至99.5 mol%未标记聚合物中混合。
	<ol>
		<li>例如，取约12 µl浓度为1 mg/ml的荧光标记脂质氯仿溶液，加入997.58 µl浓度为5 mg/ml的PEO-PBD, EO22-BD37聚合物氯仿溶液中（该聚合物分子量为2,950道尔顿），最终获得含0.5 mol%标记脂质和99.5 mol%聚合物的混合溶液。</li>
		<li>将溶液储存于密封小瓶中，瓶盖需耐氯仿，并将小瓶置于-20 °C保存。在瓶口螺纹处缠绕生料带，拧紧瓶盖后，再在外层瓶盖上缠绕一圈生料带，最后用Parafilm封口膜包裹外部，以最大限度减少溶剂挥发。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在250 ml锥形瓶中，将0.5 mg标准琼脂糖溶于50 ml水（或50 ml 100 mM蔗糖溶液）中，配制成1% w/v琼脂糖溶液。使用普通微波炉加热煮沸约1分钟（或持续加热至溶液澄清，表明琼脂糖完全溶解）。 
	注意：琼脂糖溶液可在冷却数分钟后直接使用，也可冷却凝固后储存，并在需要时按相同方法重新熔化使用。</li>
</ol>
2. 琼脂糖薄膜制备
<ol>
	<li>剪切一个1,000 µl枪头的末端，以防止堵塞。使用剪切后的枪头，直接从生产商提供的试剂中吸取300 µl融化的琼脂糖溶液，并将其加到一块25 mm的方形玻璃盖玻片上。</li>
	<li>在点样前，让琼脂糖冷却至约65–75 °C。若琼脂糖温度过低，在涂布过程中会在表面开始结块；反之，若温度过高，则需要更长时间的涂布才能使琼脂糖充分附着于表面。</li>
	<li>用戴手套的手指捏住盖玻片边缘，使用另一支1,000 µl枪头的长边，将琼脂糖均匀地涂布在盖玻片表面。来回移动枪头，直至琼脂糖完全附着并覆盖整个盖玻片表面。</li>
	<li>将涂有琼脂糖的盖玻片放置在一块Parafilm上，琼脂糖面朝上。当完成所需数量的盖玻片涂布后，将带有盖玻片的Parafilm放入37 °C培养箱中，使琼脂糖在表面脱水至少1小时。 
	注意：脱水完成的标志是肉眼可见的琼脂糖层消失，盖玻片应呈现平坦且透明的外观。一旦薄膜完全脱水，应将盖玻片（琼脂糖面朝上）存放于一次性塑料培养皿中。</li>
</ol>
3. 聚合物薄膜形成
<ol>
	<li>用移液器将 30 µl 已配制好的聚合物溶液滴加到琼脂糖薄膜上。</li>
	<li>戴手套的手仅捏住盖玻片边缘，用 18 G 针头的长边以环形涂布动作将溶液在琼脂糖薄膜上铺展。持续涂布直至溶液完全挥发。 
	注意：操作时注意针头尖端锋利。</li>
	<li>将聚合物薄膜放置于塑料培养皿中，聚合物面朝上，并将培养皿放入用铝箔包裹的标准家用真空干燥器中（以防止标记脂质发生光漂白），至少放置 1 小时，以彻底去除任何残留溶剂。</li>
</ol>
4. 聚合物囊泡的形成
<ol>
	<li>将一个盖玻片井（可使用自制的聚二甲基硅氧烷（PDMS）井（一种厚度约0.5 cm的固化PDMS块，中间打孔直径约1 cm）或市售的井）粘附到涂有聚合物薄膜的盖玻片上。轻轻按压盖玻片井，使其与聚合物涂层面朝上，并与盖玻片之间形成紧密密封。注意不要用力过猛，以免压碎盖玻片。</li>
	<li>向腔室内加入200–500 µl复水溶液（水即可，但也可使用多种缓冲液或培养基），复水体积取决于所粘附盖玻片井的大小。</li>
	<li>构建一个保湿室以减少复水溶液的蒸发。将一条卷起并润湿的Kimwipe纸沿玻璃培养皿边缘放置，将带有粘附盖玻片井的聚合物薄膜放入保湿室内，并盖上盖子。用铝箔包裹培养皿以减少光漂白。将培养皿置于设定为40 °C的加热板上，至少放置30分钟。</li>
	<li>在复水过程中调节加热板温度至24–70 °C，以调控所形成囊泡的大小（图5）。70 °C接近琼脂糖的Tm，因此超过此温度操作时应格外小心。</li>
</ol>
5. 通过荧光漂白后荧光恢复（FRAP）对聚合物囊泡进行表征
<ol>
	<li>将带有黏附盖玻片的盖玻片直接转移至倒置显微镜下进行成像。</li>
	<li>根据聚合物溶液中所含的荧光脂质选择合适的滤光片组。对于掺入聚合物溶液的罗丹明标记脂质，使用560/25 nm激发滤光片和607/36 nm发射滤光片，或性能相当的滤光片组。</li>
	<li>使用100倍油镜物镜聚焦于将要黏附多嵌段囊泡的盖玻片顶面。如果多嵌段囊泡特别大（&gt;20 µm）或若聚合物薄膜过厚，应使用较低倍率的物镜（例如， 应使用40倍物镜以更清晰地观察多聚体囊泡。</li>
	<li>使用荧光显微镜鉴定聚合物囊泡。通过具有特征性中空球形结构且直径为的囊泡来识别聚合物囊泡 &gt;5 µm.</li>
	<li>使用带有可调聚光镜的荧光显微镜，通过光漂白后荧光恢复（FRAP）技术表征膜流动性。由于多聚囊泡在基底上具有黏附性且排列紧密，其自然运动受到限制，从而提高了FRAP成像质量。
	<ol>
		<li>将显微镜聚焦于目标多聚体囊泡。缩小聚光器至较小区域，并确保多聚体囊泡的边缘位于成像感兴趣区域内。</li>
		<li>增加相机曝光时间，并确保移除所有中性密度滤光片，以有效漂白目标区域。让膜荧光强度光漂白30-60秒，或直至荧光强度显著降低。</li>
		<li>关闭光源并完全打开聚光镜。将曝光度调回初始设置，并立即开始每30秒拍摄一次图像，持续3分钟。</li>
		<li>使用标准方法计算膜扩散系数12若漂白区域在3-5分钟内恢复荧光强度，则表明该膜具有流动性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 聚合物囊泡尺寸的表征
<img alt="使用 Fiji 软件进行图像校准的过程，包括聚合物胶束直径测量步骤。" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 6"> 
图 6. 使用成像软件对聚合物囊泡进行尺寸分析的流程。 逐步说明如何测量所形成囊泡的直径。用户必须知晓所用显微镜的校准单位（像素/µm）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>在图像分析软件中打开所获取的多聚体囊泡图像13。</li>
	<li>通过点击“分析”下拉菜单并选择“设置比例尺”来设定图像的比例尺。
	<ol>
		<li>使用标准方法（即，显微测微尺）对显微镜的比例尺进行校准。</li>
		<li>填写校准单位后点击“确定”。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>点击线条工具框，绘制一条跨越囊泡直径的直线。</li>
	<li>通过点击“分析”下拉菜单并选择“测量”，收集长度数据。</li>
	<li>按照上述步骤继续测量各个单独的囊泡，每次新的测量结果将自动添加至测量数据窗口中。</li>
	<li>每次绘制直线并测量长度后，按下“Ctrl + D”，将所画线条标记在图像上，以便更方便地追踪已分析的囊泡。</li>
</ol>

<ol><li>Streicher, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+reconstituted+in+GUVs%3A+A+biomimetic+system+to+study+initial+steps+of+cell+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1788 (10), 2291-2300 (2009).</li>
<li>Paxton, W., Bouxsein, N. F., Henderson, I., Gomez, A., Bachand, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Assembly+of+Polymer+Nanotube+Networks+via+Kinesin+Powered+Microtubule+Filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Dynamic Assembly of Polymer Nanotube Networks via Kinesin Powered Microtubule Filaments.</a> Nanoscale. , (2015).</li>
<li>Bermudez, H., Brannan, A. K., Hammer, D. a, Bates, F. S., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+weight+dependence+of+polymersome+membrane+structure%2C+elasticity%2C+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Molecular weight dependence of polymersome membrane structure, elasticity, and stability.</a> Macromolecules. 35 (21), 8203-8208 (2002).</li>
<li>Amos, R. C., Nazemi, A., Bonduelle, C. V., Gillies, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+polymersome+surfaces%3A+functionalization+with+dendritic+groups%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Tuning polymersome surfaces: functionalization with dendritic groups.</a> Soft Matter. 8 (21), 5947-5958 (2012).</li>
<li>Egli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+functionalization+of+polymersome+surfaces%3A+A+new+approach+to+surface+immobilization+and+cell+targeting+using+polymersomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Biocompatible functionalization of polymersome surfaces: A new approach to surface immobilization and cell targeting using polymersomes.</a> J. Am. Chem. Soc. 133 (12), 4476-4483 (2011).</li>
<li>Kim, K. T., Cornelissen, J. J. L. M., Nolte, R. J. M., Van Hest, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+polymersome+nanoreactor+with+controllable+permeability+induced+by+stimuli-responsive+block+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">A polymersome nanoreactor with controllable permeability induced by stimuli-responsive block copolymers.</a> Adv. Mater. 21 (27), 2787-2791 (2009).</li>
<li>Paxton, W. F., Price, D., Richardson, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxide+ion+flux+and+pH-gradient+driven+ester+hydrolysis+in+polymer+vesicle+reactors%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Hydroxide ion flux and pH-gradient driven ester hydrolysis in polymer vesicle reactors.</a> Soft Matter. 9, 11295-11302 (2013).</li>
<li>Henderson, I. M., Paxton, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salt%2C+shake%2C+fuse+-+Giant+hybrid+polymer%2Flipid+vesicles+through+mechanically+activated+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Salt, shake, fuse - Giant hybrid polymer/lipid vesicles through mechanically activated fusion.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 53 (13), 3372-3376 (2014).</li>
<li>Discher, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymersomes%3A+Tough+Vesicles+Made+from+Diblock+Copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Polymersomes: Tough Vesicles Made from Diblock Copolymers.</a> Science. 284 (5417), 1143-1146 (1999).</li>
<li>Howse, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Templated+formation+of+giant+polymer+vesicles+with+controlled+size+distributions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mat%22%5BJournal%5D)">Templated formation of giant polymer vesicles with controlled size distributions.</a> Nat Mat. 8 (6), 507-511 (2009).</li>
<li>Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Films+of+Agarose+Enable+Rapid+Formation+of+Giant+Liposomes+in+Solutions+of+Physiologic+Ionic+Strength+Films+of+Agarose+Enable+Rapid+Formation+of+Giant+Liposomes+in+Solutions+of+Physiologic+Ionic+Strength%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength.</a> J. Am. Chem. Soc. , 1-24 (2009).</li>
<li>Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+measurement+by+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics.</a> Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+meth%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat meth. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
</ol>

桑迪亚国家实验室是一个多项目实验室，由洛克希德·马丁公司全资子公司桑迪亚公司负责管理和运营，为美国能源部国家核安全管理局提供服务，合同编号为DE-AC04-94AL85000。

聚合物囊泡正被广泛探索作为生物膜的模拟物。聚合物具有坚固且多功能的特性，使其在需要膜功能化、长效性和可调控响应性的研究中备受青睐。传统制备巨型聚合物囊泡9,10（&#62;4 µm）的方法费时费力，且需要昂贵且专用的设备。在此，我们首次提出一种快速、多功能且可靠的制备巨型聚合物囊泡的方法，仅需使用常规且廉价的实验室试剂和设备即可完成。
利用凝胶辅助再水化方法，可在多种再水化溶液（包括细胞培养基）中快速（&#60;30 分钟）形成单层聚合物囊泡，并适用于多种不同的聚合物（数据未显示）。该技术未观察到多层或不对称囊泡的形成。本研究中，我们使用了聚环氧乙烷-b-聚丁二烯（PEO-PBD, EO22-BD37）中性双嵌段共聚物。许多不同组成的聚合物（包括带电双嵌段共聚物）均能通过该方法有效形成囊泡（未展示）。然而，一些市售的三嵌段共聚物以及较高分子量的双嵌段共聚物（~ &#62;5,000 道尔顿）则无法形成清晰的聚合物囊泡。在本论文的所有实验中，仅为了可视化目的，在聚合物溶液中掺入了低浓度的标记脂质。其他可视化方法，包括直接功能化荧光染料的聚合物，也可使用。聚合物囊泡同样可通过明场显微镜成像，但荧光显微镜可提供更高的分辨率。
对方案进行的大多数小幅修改通常不会改变实验结果。例如，滴加到盖玻片上的聚合物溶液浓度存在微小差异，并不会影响所形成的聚合物薄膜。尽管尚未确定完整的浓度范围，但聚合物囊泡的形成可在较宽的聚合物薄膜浓度范围内成功实现。例如，1-10 mg/ml）。然而，某些实验方案的改动会对聚合物囊泡的形成产生不利影响。其中最显著的是使用圆形玻璃盖玻片（而非方形）会导致聚合物囊泡形成效果极差。我们认为这是由于琼脂糖在玻璃表面形成了极为均匀的涂层，反而阻碍了聚合物囊泡的形成。
该技术最具挑战性的问题之一是以高回收率从表面回收聚合物囊泡。在某些情况下，将聚合物囊泡从原始表面移除可能具有优势。由于脱水聚合物膜会产生较高的背景荧光，将单个聚合物囊泡移除并黏附到洁净的盖玻片上，可提高成像质量和表征效果（尤其是在进行FRAP分析时）。为此，可使用末端被截断的移液枪头进行轻柔吹打，使聚合物囊泡从表面解吸（尽管回收的囊泡数量显著低于最初形成的数量）。随后可将聚合物囊泡置于经过修饰的盖玻片表面，使其与新的盖玻片发生相互作用。通常情况下，对于中性的PEO-PBD聚合物囊泡，经臭氧处理15分钟的盖玻片可促使聚合物囊泡沉降到表面以供成像。不同组成的聚合物囊泡需要采用不同的表面修饰方法（例如，带负电或正电的聚合物）。
本实验方案中使用的大多数材料均可成功储存并使用数天至数周。凝固的琼脂糖可重新煮沸并重复使用，直至琼脂糖在煮沸后仍出现聚集现象，或凝固的琼脂糖开始变干。带有干燥琼脂糖薄膜的盖玻片可无限期储存和使用（例如，数月）。溶于氯仿中的聚合物可在 -20 °C 下保存数月。然而，一旦聚合物薄膜在琼脂糖薄膜上干燥，这些薄膜必须在常压真空条件下储存，并在两周内使用（更长期的储存效果尚未直接确定，但使用超过两周的聚合物薄膜所形成的聚合物体在性能上已出现明显差异）。
采用本文介绍的凝胶辅助水合方法，仅需使用常规设备和廉价的实验室试剂，在数小时内即可快速制备出数百个形态均一的聚合物囊泡。此外，聚合物囊泡可在多种生理缓冲溶液中形成，并可由不同的聚合物组成制备（未展示）。对本方法进行的微小调整不会对聚合物囊泡的形成产生负面影响，使得凝胶辅助水合成为一种适用于不同技术水平科研人员的通用且易于实施的技术。
轻松构建尺寸与细胞相当的巨型聚合物囊泡，对于开发类细胞的人工系统至关重要。利用凝胶辅助再水化技术制备这些聚合物囊泡，操作简便且用途广泛，为生物模拟领域带来了重大进展，有助于构建结构稳定的细胞膜模拟物。例如，借助该技术，可设计多种策略，如包封不同的细胞内组分、在聚合物上功能化修饰细胞膜蛋白，以及整合膜转运蛋白等，从而构建基于聚合物囊泡的人工细胞。

合成细胞大小的巨型单层囊泡（GUVs）的构建在近年来日益受到关注 体外 重建不同的细胞过程以构建人工细胞样系统的框架1,2尽管由脂质膜构成的巨大囊泡（GUVs）能够很好地模拟天然生物膜，但其对环境波动敏感且稳定性较差，保质期相对较短。由于这些局限性，两亲性嵌段共聚物被用作脂质模拟物以形成聚合物囊泡（polymersomes）。在此背景下，聚合物囊泡因其更高的稳定性，在仿生细胞系统的构建中具有显著优势3，化学多功能性4,5 可修改的物理特征6-8.
目前制备巨型聚合物囊泡的方法包括电场成形法9和模板辅助复水法10，这两种方法均耗时较长、劳动强度大、需要专用设备，且产生的完整巨型聚合物囊泡产率较低。最近开发了一种简单的凝胶辅助复水法用于制备脂质巨型单层囊泡（GUVs）11。本文中，我们描述了对凝胶辅助复水技术的改进，可用于制备具有不同聚合物组成的、尺寸可控的、并在多种缓冲液体系中形成的巨型聚合物囊泡。
简而言之，将1% w/v的标准DNA凝胶电泳琼脂糖薄膜脱水至玻璃盖玻片上。然后将溶于氯仿中的聚合物溶液铺展在脱水的琼脂糖薄膜上，并使其自然蒸发。在完全去除溶剂后，聚合物薄膜在选定缓冲液中通过适度加热（40–70 °C）重新水化，30分钟内即可形成巨大（>4 µm）的多聚体囊泡（polymersomes）。该方法利用常规实验室设备和试剂，以极低的成本快速制备出数百个结构完整、形态良好的多聚体囊泡。
<img alt="聚合物显微制备：琼脂糖薄膜、聚合物铺展、脱水、再水化、成像。" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 凝胶辅助再水化方法示意图。 由二嵌段共聚物组成的巨型聚合物囊泡在再水化约30分钟后形成。亲水嵌段以品红色表示，疏水嵌段以绿色表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>125 ml 锥形瓶</td><td>VWR</td><td>89000-360</td><td></td></tr><tr><td>18 号针头</td><td>VWR</td><td>BD-305196</td><td></td></tr><tr><td>25 mm 方形盖玻片</td><td>VWR</td><td>48366-089</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>用于DNA凝胶电泳的标准琼脂糖</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma</td><td>288306-2L</td><td></td></tr><tr><td>商用CoverWell密封圈</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70336</td><td>压合式硅胶隔离器</td></tr><tr><td>Fiji图像分析软件</td><td>ImageJ</td><td></td><td>免费下载：http://fiji.sc/Fiji&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>带聚四氟乙烯（Teflon）盖的玻璃小瓶</td><td>VWR</td><td>66009-556</td><td>容量1.9 ml，每箱144个</td></tr><tr><td>罗丹明B标记的PE脂质（Liss-rhodamine B PE Lipid）</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810150C</td><td>1 mg脂质，溶于氯仿，浓度为1 mg/ml</td></tr><tr><td>封口膜（Parafilm）</td><td>VWR</td><td>52858-000</td><td>10.2 cm × 38.1 m</td></tr><tr><td>聚环氧乙烷-嵌段-聚丁二烯（poly(ethylene oxide)-b-poly(butadiene)）或PEO-PBD（分子量为2,940）</td><td>Polymer Source</td><td>P2904-BdEO</td><td>&lt;a href=&quot;http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf">http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>塑料培养皿</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>聚四氟乙烯生料带（Teflon tape）</td><td>VWR</td><td>300001-057</td><td>1/2&quot; 宽度</td></tr></tbody></table>

利用凝胶辅助再水合法制备巨型聚合物体

Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration

聚合物囊泡（polymersomes）因其稳定性、坚固性、屏障特性、化学多样性和可调控的物理特性，正被广泛研究作为脂质囊泡的合成类似物。然而，制备巨型（&gt; 4 µm）囊泡的常规方法通常耗时且劳动密集，所得完整聚合物囊泡数量较少。在此，我们首次提出利用凝胶辅助再水化法，快速高效地制备巨型（&gt;4 µm）聚合物囊泡（polymersomes）。使用该方法，可从多种再水化溶液中形成聚合物囊泡，包括多种生理相容性缓冲液和完全细胞培养基，使其可直接适用于仿生学研究。该技术还能可靠地从不同聚合物组成中生成聚合物囊泡，产率显著高于传统方法，操作难度也大大降低。通过调节再水化过程中的温度或向聚合物膜中添加膜流动剂，可方便地调控聚合物囊泡的尺寸，从而获得巨型聚合物囊泡（&gt;100 µm）。

采用上述方法（图1）并结合 图2 所示的常规实验设备制备多嵌段共聚物囊泡（polymersomes）。将多嵌段共聚物囊泡用去离子水再水化（图3），并在倒置显微镜上使用100倍油镜通过落射荧光模式进行成像。需注意，若无法观察到多嵌段共聚物囊泡，可能是其尺寸过大，超出了100倍油镜的观测范围；此时应改用较低倍数的物镜进行观察。采用凝胶辅助再水化方法的一个优势在于，可在多种不同的再水化溶液中形成多嵌段共聚物囊泡。如 图4 所示，本方法已成功在去离子水、完整的哺乳动物细胞培养基、蔗糖溶液以及两种生理相关缓冲液（磷酸盐缓冲液（PBS）或Tris缓冲盐水（TBS））中形成多嵌段共聚物囊泡。在标准条件下（40 °C、1小时用水再水化），通常在每40 × 40 µm2 的视野中可观察到超过约70个囊泡。尽管囊泡在表面的生成分布并不完全均一，但存在数十个视野均能达到此代表性产量。此外，多嵌段共聚物囊泡在溶液中至少可稳定维持24小时。
通过在不同温度下重新水化聚合物薄膜，可轻松调节聚合物囊泡的尺寸。在室温下于去离子水中形成的聚合物囊泡，其平均直径为2.9 ± 0.7 µm。随着再水化过程中温度的升高，聚合物囊泡的平均尺寸也随之增大（表1）。在高温条件下（> 60 °C），形成的聚合物囊泡尺寸甚至可超过100 µm（图5）。
所有图像处理均使用开源成像软件完成（图6）。采集的图像在软件程序中打开。将标定的像素尺寸输入到“设置比例”框中。使用直线工具，沿直径方向绘制直线。每绘制一条直线后，测量其标定长度，并将数据添加至结果框中。随后可将数据导入任意选定的数学软件进行绘图（例如Excel、Prism、Origin 等等。)
<img alt="用于化学实验的培养皿、烧瓶和试剂瓶等实验设备装置" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 制备聚合物囊泡所需常见且廉价的实验材料照片。 所需物品包括：封口膜（Parafilm）、18.5 G 针头、溶于氯仿或其他合适溶剂中的聚合物、1,000 µl 移液枪头、锥形瓶、镊子、琼脂糖、25 mm 方形盖玻片、PDMS 成像孔板和玻璃培养皿。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜下琼脂糖-聚合物薄膜制备过程；使用移液器和盖玻片腔室的逐步操作示意图。" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 凝胶辅助再水化方法的示意图。 将溶解的琼脂糖均匀涂布于25 mm见方的盖玻片上，形成覆盖整个盖玻片的均匀薄膜。随后将盖玻片置于37 °C培养箱中，使薄膜脱水。将聚合物溶液滴加至脱水后的琼脂糖薄膜上，并用针头以环形运动方式涂布均匀。然后将盖玻片放入干燥器中过夜，以彻底蒸发残留溶剂。最后，将成像腔室粘附至基底上，用选定溶液对聚合物进行再水化，并将样品置于40 °C的培养皿中至少25分钟，以促进聚合物囊泡（polymersomes）的形成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="H₂O、培养基、蔗糖、TBS、PBS 中细胞形态的显微镜图像；比较分析。" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. 多种不同缓冲液中均可形成聚合物囊泡。 将 PEO-PBD 聚合物膜在指定缓冲液中 40 °C 下重水化 1 小时。比例尺 = 10 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="在24°C至70°C温度下，气泡尺寸随温度升高而增大的显微图像，微米级。" src="/files/ftp_upload/54051/54051fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图5"> 
图5. 在再水化过程中提高温度会增加聚合物囊泡的尺寸。 在指定再水化温度下于水中形成的聚合物囊泡的代表性落射荧光图像。温度升高导致聚合物囊泡尺寸增大。比例尺 = 10 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>温度 (°C)</td>
			<td>平均尺寸 (µm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24</td>
			<td>2.93 ± 0.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40</td>
			<td>5.76 ± 2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50</td>
			<td>6.65 ± 2.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60</td>
			<td>11.46 ± 5.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70</td>
			<td>14.04 ± 7.0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 再水化过程中温度升高导致多聚体囊泡尺寸增大。 每种不同温度条件下，水中超过100个多聚体囊泡的平均直径已计算并展示于此。误差表示标准偏差。

我们介绍一种快速制备巨型聚合物囊泡（pGVs）的实验方案。简言之，将聚合物溶液滴加在附着于盖玻片的干燥琼脂糖膜上进行脱水处理，随后对聚合物薄膜重新水化，即可迅速形成pGVs。该方法显著改进了合成型巨型囊泡的制备过程，可直接应用于仿生学研究。

聚合物囊泡，或称多嵌段共聚物囊泡（polymersomes），因其稳定性、强韧性和屏障特性，正被广泛研究作为脂质囊泡的合成类似物……

本凝胶辅助再水化方法的总体目标是稳定地形成完整的单层巨型聚合物囊泡，并可轻松控制囊泡的尺寸分布。该方法为聚合物囊泡的制备提供了一种可靠的替代方案，可用于研究膜的物理特性，并进一步将这些囊泡整合到生物工程应用中。该技术的主要优势在于能够比传统方法更快、更省力地大量制备数百个完整的巨型聚合物囊泡。这一想法源于我们了解到通过凝胶辅助再水化技术可制备巨型脂质体。然而，目前我们制备巨型聚合物体的方法较为困难，且产率通常较低，因此我们决定采用该方法作为替代方案。首先开始配制聚合物溶液：将5毫克PEO-PBD二嵌段共聚物加入1毫升氯仿中，置于玻璃小瓶内涡旋振荡，直至完全溶解。向一个新样品瓶中加入5毫克/毫升的聚合物氯仿溶液和1毫克/毫升的荧光标记脂质氯仿溶液，使最终浓度达到99.5摩尔％聚合物和0.5％脂质。为减少挥发，将聚合物溶液转移至带耐氯仿盖子的密封瓶中，并在20摄氏度下保存以备后续使用。开始制备琼脂糖薄膜时，向一个250毫升的锥形瓶中加入50毫升水和0.5克标准琼脂糖。使用微波炉煮沸一分钟。继续操作前，将琼脂糖溶液冷却至65至75摄氏度，以防止粘附不良或结块。接下来，剪掉一个1000微升移液器吸头的末端，用其将300微升琼脂糖溶液转移至一块25毫升的方形玻璃盖玻片上。佩戴手套后，用手捏住盖玻片边缘，用另一支1000微升枪头的长边将琼脂糖均匀涂布在整个表面。将琼脂糖面朝上的盖玻片放置于Parafilm上，并在37摄氏度孵育至少一小时。随后，用移液器将30微升先前配制的聚合物溶液滴加到涂有琼脂糖薄膜的盖玻片上。用戴手套的手指夹住盖玻片边缘，使用18号针头的长边以环形 motion 将聚合物溶液均匀涂布在琼脂糖薄膜上。随后将盖玻片有聚合物的一面朝上放入塑料培养皿中，并置于真空干燥器内。抽真空至少一小时，以去除任何残留溶剂。为形成聚合物囊泡，首先将盖玻片的涂层侧轻轻按压到盖玻片室上，使其紧密贴合并形成密封。然后，向腔室内加入 200 至 500 微升的再水化溶液。接着，将一块湿润的卷筒式实验室擦拭纸沿玻璃培养皿内边缘放置，以构建一个保湿环境室。将带有黏附盖玻片的小室放入培养皿中，并盖上皿盖。用铝箔包裹培养皿以减少光漂白，然后将其置于40摄氏度的加热板上至少30分钟，以完成聚合物囊泡的形成。开始FRAP成像前，将带有黏附盖玻片的小室放置在配有可调聚光镜的倒置荧光显微镜载物台上。接下来，根据所使用的荧光脂质选择合适的滤光片组，并使用100倍油镜对盖玻片上表面的聚合物囊泡进行成像。为了利用荧光漂白恢复技术（FRAP）表征膜流动性，首先将显微镜聚焦于一个聚合物囊泡，然后将显微镜聚光器调至较小的孔径，并确保囊泡的边缘位于成像视野之内。随后，提高相机曝光时间，移除所有中性密度滤光片，并使目标区域光漂白30至60秒。最后，关闭光源并完全打开聚光镜。将曝光参数调回初始设置，每30秒采集一次图像，持续三分钟。在显微镜连接的计算机上打开图像分析软件，载入所获取的聚合物囊泡图像。通过打开“分析”下拉菜单并选择“设置比例尺”选项，来设定测量的标度。输入距离的校准单位（像素）、已知距离及长度单位，然后选择“确定”。接下来，使用线条工具，在选定的聚合体囊泡的直径上绘制一条直线。通过打开“分析”下拉菜单并选择“测量”来测定多嵌段聚合物囊泡的直径。为便于分析，在移至下一个多嵌段聚合物囊泡前，使用 Ctrl + D 将测量线打印在图像上。按照上述步骤继续测量多嵌段聚合物囊泡，并将每次测量结果添加到数据窗口中，直至完成全部测量。最后，单击“文件”并选择“另存为”来保存数据。在弹出的窗口中单击“保存”，然后将结果文件以电子表格形式打开以进行数据分析。使用荧光显微镜观察了由经不同缓冲液复水的PEO-PBD聚合物薄膜形成的聚合物囊泡。图像显示，在不同复水条件下形成的聚合物囊泡在尺寸上呈非均一性，直径通常小于10微米。在不同温度下于水中形成的多嵌段共聚物囊泡的落射荧光图像显示，随着再水合温度的升高，形成的多嵌段共聚物囊泡尺寸增大。统计了在不同再水合温度下于水中形成的超过100个囊泡的平均直径。在24摄氏度时，平均直径为2.93微米，升高至70摄氏度时达到14.04微米。一旦掌握，若操作正确，该技术可在大约一小时内完成。在进行此操作时，必须始终确保聚合物囊泡保持在溶液中。确保盖玻片上的凹孔牢固地固定在盖玻片上，以防止再水化溶液泄漏以及聚合物囊泡干燥。通过该实验流程，可采用电子显微镜等方法进一步研究多嵌段聚合物囊泡的其他结构特性。该技术为合成生物学和生物工程领域的研究开辟了道路，可用于探索多嵌段聚合物囊泡作为坚固且化学性质可调控的脂质膜替代物，在非生物-生物界面、药物递送研究以及原始细胞系统中的应用。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用凝胶辅助再水化法稳定地制备巨型多嵌段聚合物囊泡，调控囊泡的整体尺寸，并表征其膜完整性。请注意，使用氯仿、琼脂糖或针头时可能存在危险。操作这些步骤时需格外小心，务必采取预防措施，例如在通风橱中操作，并始终佩戴护目镜和手套。

forming-giant-sized-polymersomes-using-gel-assisted-rehydration

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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一种由分裂型内含肽介导的人工蛋白质水凝胶的合成

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利用凝胶辅助再水合法制备巨型聚合物体

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