利用凝胶辅助再水合法制备巨型聚合物体

本凝胶辅助再水化方法的总体目标是稳定地形成完整的单层巨型聚合物囊泡，并可轻松控制囊泡的尺寸分布。该方法为聚合物囊泡的制备提供了一种可靠的替代方案，可用于研究膜的物理特性，并进一步将这些囊泡整合到生物工程应用中。该技术的主要优势在于能够比传统方法更快、更省力地大量制备数百个完整的巨型聚合物囊泡。

这一想法源于我们了解到通过凝胶辅助再水化技术可制备巨型脂质体。然而，目前制备巨型聚合物体的方法较为困难，且产率通常较低，因此我们决定采用该方法作为替代方案。首先开始配制聚合物溶液：将5毫克PEO-PBD二嵌段共聚物加入1毫升氯仿中，置于玻璃小瓶内涡旋振荡，直至完全溶解。

向一个新样品瓶中加入五毫克每毫升的聚合物氯仿溶液和一毫克每毫升的荧光标记脂质氯仿溶液，直至获得终浓度为99.5摩尔百分比的聚合物和0.5百分比的脂质。为减少蒸发，将聚合物溶液转移至带有耐氯仿盖子的密封瓶中，并在20摄氏度下保存以备后续使用。开始制备琼脂糖薄膜时，向一个250毫升的锥形瓶中加入50毫升水和0.5克标准琼脂糖。

使用微波炉煮沸一分钟。继续操作前，将琼脂糖溶液冷却至65至75摄氏度，以防止粘附不良或结块。接下来，剪掉一个1000微升移液枪头的末端，用其吸取300微升琼脂糖溶液，滴加到一块25毫升的方形玻璃盖玻片上。

佩戴手套后，用手捏住盖玻片边缘，用另一支1000微升移液器吸头的长边将琼脂糖均匀涂布在整个表面。将涂有琼脂糖的一面朝上放置于Parafilm上，并在37摄氏度下孵育至少一小时。随后，用移液器吸取30微升先前配制的聚合物溶液，滴加到涂有琼脂糖薄膜的盖玻片上。

用戴着手套的手指夹住盖玻片边缘，使用18号针头的长边以环形运动方式将聚合物溶液涂布在琼脂糖薄膜上。涂布完成后，将盖玻片有聚合物的一面朝上放入塑料培养皿中，并置于真空干燥器内。抽真空至少一小时，以去除任何残留溶剂。

为了形成聚合物囊泡，首先将盖玻片的盖槽轻轻按压在涂覆有聚合物的一侧，直至形成紧密密封。然后，向腔室内加入 200 至 500 微升的再水化溶液。接着，将一张湿润的卷筒式实验室擦拭纸沿玻璃培养皿的内边缘放置，以构建一个湿度环境室。

将带有黏附盖玻片的培养小室放入培养皿中，并盖上盖子。用铝箔包裹培养皿以减少光漂白，然后将其置于40摄氏度的加热板上至少30分钟，以完成聚合物囊泡的形成。开始进行荧光漂白恢复（FRAP）成像时，将带有黏附盖玻片的培养小室放置在配有可调聚光镜的倒置荧光显微镜载物台上。

接下来，根据所用的荧光脂质选择合适的滤光片组，并使用100倍油镜对盖玻片顶面的聚合物囊泡进行成像。为了利用荧光漂白恢复技术（FRAP）表征膜流动性，首先将显微镜聚焦于一个聚合物囊泡，然后将显微镜聚光器调至较小孔径，并确保囊泡边缘位于成像视野范围内。随后，增加相机曝光时间，移除所有中性密度滤光片，并使目标区域接受30至60秒的光漂白。

最后，关闭光源并完全打开聚光镜。将曝光参数调回初始设置，每30秒采集一次图像，持续3分钟。在显微镜的计算机上打开图像分析软件，载入所获得的聚合物囊泡图像。

通过打开“分析”下拉菜单并选择“设置比例尺”选项，来设定测量的标度。输入距离的校准单位（像素）、已知距离及长度单位，然后选择“确定”。接下来，使用线条工具，在选定的聚合体囊泡的直径上画一条线。

通过打开“分析”下拉菜单并选择“测量”，测定多嵌段聚合物囊泡的直径。为便于分析，在移动到下一个多嵌段聚合物囊泡之前，使用 Ctrl + D 将测量线打印在图像上。按照上述步骤继续测量多嵌段聚合物囊泡，并将每次测量结果添加至数据窗口，直至完成全部测量。

最后，单击“文件”并选择“另存为”来保存数据。在打开的窗口中单击“保存”，然后以电子表格形式打开结果文件以分析数据。通过使用不同缓冲液对 PEO-PBD 聚合物膜进行再水合所形成的聚合物囊泡，采用荧光显微镜进行成像。图像显示，在不同再水合条件下，聚合物囊泡的尺寸呈现非均一性，直径通常小于 10 微米。

在不同温度下于水中形成的聚合物囊泡的落射荧光图像显示，随着再水合温度的升高，形成的聚合物囊泡尺寸增大。统计了在不同再水合温度下于水中形成的超过100个聚合物囊泡的平均直径。在24摄氏度时，平均直径为2.93 µm，升高至70摄氏度时达到14.04 µm。

一旦掌握，该技术若操作正确，可在大约一小时内完成。在进行此操作时，必须始终确保聚合物囊泡保持在溶液中。务必确保盖玻片上的盖孔牢固地附着在盖玻片上，以避免复水溶液泄漏以及聚合物囊泡干燥。

通过该实验流程，可进一步采用电子显微镜等方法来研究多嵌段共聚物囊泡的其他结构特性。该技术为合成生物学和生物工程领域的研究开辟了道路，使研究人员能够探索多嵌段共聚物囊泡作为坚固且化学性质可调的脂质膜替代物，应用于非生物-生物界面、药物递送研究以及原始细胞系统。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用凝胶辅助再水化法稳定地制备巨型多嵌段共聚物囊泡，调控囊泡的整体尺寸，并表征其膜完整性。

请注意，使用氯仿、琼脂糖或针头时可能存在危险。操作这些步骤时需格外小心，务必采取预防措施，例如在通风橱中操作，并始终佩戴护目镜和手套。