Name: 解剖和三刺鳃骨架的平面安装 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 学习解剖和平面安装三刺鱼鳃骨架的方法，用于研究鱼类摄食性状和发育进化生物学。该技术可详细观察鳃耙、咽齿等结构，适用于多种鱼类物种的研究。

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本工作部分由美国国立卫生研究院（NIH）R01 #DE021475 基金（资助 CTM）以及美国国家科学基金会（NSF）研究生研究奖学金（资助 NAE）提供支持。感谢 Miles Johnson 在成像方面的协助，以及 Priscilla Erickson 对稿件的审阅。

所有鱼类实验均经加州大学伯克利分校机构动物护理与使用委员会批准（方案编号 R330）。安乐死采用浸入含 0.1% 碳酸氢钠缓冲的 0.025% 三卡因-S 溶液进行39。所有步骤均在室温下进行。
1. 准备
注意：步骤 1.1–1.5 需在可严密封口并能水平放置的锥形管或闪烁瓶中进行。鱼类样本无需持续震荡，但应通过轻柔地倒置或晃动试管架/小瓶，尽可能频繁地混合溶液，使鱼体各面均能接触染色液，从而确保染料均匀渗透组织。切勿将大量鱼类样本置于平台摇床上震荡，因为液体的重量过大会导致摇床损坏。
<ol>
	<li>使用10%中性缓冲福尔马林（NBF）对新鲜处死的鱼类或保存在乙醇中的鱼类进行固定，固定过夜。或者，可使用4%多聚甲醛溶于1× PBS溶液代替10% NBF。 
	注意：若需提取DNA，应在固定前剪取少量尾鳍或胸鳍组织，并保存于乙醇中。</li>
	<li>在通风橱中妥善处理固定液，随后用自来水（pH约7.0）浸泡2小时。避免使用去离子水，因其常呈酸性，可能导致骨骼脱钙。</li>
	<li>将鱼类移出固定液，用含1% KOH的0.008%茜素红S水溶液染色24小时。对于标准长度小于20 mm的鱼类，使用0.004%茜素红S。（可先配制100倍浓缩液（0.8%）茜素红S，使用时再稀释）。</li>
	<li>移除染色液（倒入通风橱内的适当废液容器中），将鱼类转入自来水中浸泡数小时。根据需要更换水，直至洗液基本澄清。</li>
	<li>移除水后，将鱼类放入含50%甘油和0.25% KOH的溶液中，以进行轻微透明处理及后续解剖。 
	注意：本染色方案经先前报道的方法修改而来40,41。</li>
</ol>
2. 解剖
注：有关头部骨骼形态学的综述，请参见图1。
<img alt="鱼类头骨解剖图；标注的骨骼：Fron, Nas, Max；结构分析工具。" src="/files/ftp_upload/54056/54056fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1：刺鱼头部骨骼形态学。 经茜素红染色的三刺刺鱼头部在罗丹明B滤光片组下通过荧光成像。图中标识了关键的形态结构：Op = 鳃盖骨，Subop = 下鳃盖骨，BSRs = 鳃膜条，Preop = 前鳃盖骨，Infraorb 1-3 = 下眶骨1-3（也称为环眶骨或下眶骨），Dent = 齿骨，Premax = 前颌骨，Max = 上颌骨，Nas = 鼻骨，Lat. ethm = 外筛骨，Psph = 副蝶骨，Fron = 额骨。有关刺鱼头部骨骼的更详细描述，请参见 Anker (1974)31。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54056/54056fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>将鱼平放（图 2A），以尖头 #5 钟表镊从眼球侧面约 45° 角插入，刺破覆盖眼球的膜。</li>
	<li>将膜从眼球上剥离，类似于揭开酸奶盖（图 2B）。</li>
	<li>将张开的镊子插入眼球后方，夹住眼球后方的视神经，然后取出眼球（图 2C）。切勿刺破眼球，否则会泄漏黑色素。若发生刺破，可在后续步骤中将黑色素冲洗掉。</li>
	<li>在另一侧重复上述操作。</li>
	<li>从后部开始，将一把小型解剖剪的一侧刀片置于鳃盖瓣下方，沿鳃盖背侧向上拖动剪刀，然后剪开至眼眶的软组织（图 2D）。切口应位于鳃盖骨背侧。</li>
	<li>剪断位于眼眶背侧的额骨（图 2E）。</li>
	<li>在眼眶中心周围剪断中线处的间蝶骨（图 2F）。</li>
	<li>在对侧重复鳃盖切口操作。</li>
	<li>将镊子插入鳃盖下方，缓慢将面部组织从身体剥离，并修剪仍附着的软组织（图 2G–H）。注意不要破坏第一排鳃耙。
	<ol>
		<li>用镊子在剥离并移除前部颅面骨骼时，将两侧角舌骨从中线的基舌骨上分离（包括齿骨、前颌骨和上颌骨在内的整个下颌；包括外层真皮鳃盖骨、前鳃盖骨、下鳃盖骨和鳃条骨以及其下方的背侧和腹侧软骨内骨骼在内的整个舌弓骨骼；以及包括鼻骨、外侧筛骨和眶下骨在内的颅骨前部，见 图 1 和 图 2I）。</li>
		<li>若存在，可将腹鳍棘从身体向外折叠，作为镊子抓握的把手。棘刺可锁定位置；解锁时，用镊子轻轻将棘刺垂直于鱼体方向拉出，然后轻柔向后弯曲，使其平贴于鱼体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将闭合的镊子插入鳃篮后方及腹侧（紧位于肠管下方），向前拖动镊子，逐步分离仍附着于鳃篮的肌肉和韧带（图 2J–K）。</li>
	<li>使用闭合镊子的尖端，从后向前刮除连接背侧鳃篮与腹侧脑颅的肌肉（图 2L）。</li>
	<li>在对侧重复步骤 2.9 和 2.10。</li>
	<li>握住肠管基部，向前拉动，以移除鳃篮和肠管（图 2M–N）。</li>
	<li>在第五角鳃骨末端后方作一垂直切口，以分离肠管（图 2O）。</li>
	<li>在移除鳃篮背侧脑颅上任何残留的骨碎片后，将剪刀插入鳃篮，在左右两组背侧齿板之间作一背侧切口（从前向后切割）（图 3A–D）。确保切口居中，以避免损伤背侧齿板。</li>
	<li>在鳃篮后端（肠管前端）的橡胶状肠腔上作两个浅的侧向切口，以辅助打开鳃篮结构（图 3E）。</li>
	<li>将鱼体及所有组织碎片放入样品瓶中，并将鳃篮放入含有 50% 甘油、0.25% KOH 的微量离心管中以继续温和透明处理；若无需进一步透明，则可使用 100% 甘油。使用唯一标识符标记样品瓶和离心管，以便追踪。所需透明处理的程度主要取决于鱼体大小，大型成鱼（标准体长超过 40 mm）通常需要更长时间的透明处理。</li>
</ol>
<img alt="解剖过程示意图；使用工具剥离、切割和刮除标本组织的步骤。" src="/files/ftp_upload/54056/54056fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图2"> 
图2：刺鱼鳃部骨骼的解剖。 经茜素红染色的三刺刺鱼已准备好进行解剖，其眼部因充分透明化处理而失去色素。蓝色箭头指示操作方向。(A) 刺鱼头部的侧面观，前方朝右。(B) 去除覆盖眼部的膜。(C) 去除眼球。(D) 在鳃盖上方做背侧切口。(E) 切断额骨。(F) 切断副蝶骨。(G-I) 去除面部骨骼。(J) 去除鳃部骨骼腹侧软组织连接。(K-L) 去除鳃部骨骼背侧连接。(M-N) 取出鳃部骨骼。(O) 将肠管与鳃部骨骼分离。详见步骤2.1至2.16。比例尺 = 5 mm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54056/54056fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
3. 鳃弓骨骼复染色（如必要）
<ol>
	<li>若要使鳃弓骨骼染色更深或使组织更透明，需去除50%甘油和0.25% KOH溶液，并用1% KOH洗涤两次（先进行一次5分钟洗涤，随后进行一次24小时洗涤，期间在平台摇床上水平摇动）。</li>
	<li>去除1% KOH溶液，并在1% KOH中重新加入0.008%茜素红S染色24小时。</li>
	<li>去除染液，更换为1% KOH溶液，继续孵育24小时。</li>
	<li>去除KOH溶液，替换为50%甘油、0.25% KOH溶液。</li>
</ol>
4. 鳃弓骨骼的制备
<ol>
	<li>从50%甘油、0.25% KOH或100%甘油中取出鳃弓骨骼，置于22 mm × 60 mm玻璃盖玻片底部附近， dorsal面朝上（图3F）。在鳃弓骨骼上方加入几滴 50% 甘油、0.25% KOH 或 100% 甘油。若需从 50% 甘油、0.25% KOH 转换至 100% 甘油，应将样本转移至微量离心管中，更换溶液并轻轻振荡 &gt;装片前5分钟使组织达到平衡。</li>
	<li>将两小团建模黏土揉成球状，分别置于盖玻片两端，作为间隔物。</li>
	<li>轻轻放置第二块盖玻片于其上，施加适当压力以展平鳃弓前部骨骼（图3G).</li>
	<li>剥开左侧背侧瓣，包括背侧齿板，展平后置于盖玻片之间（图 3H).</li>
	<li>用右侧背侧瓣重复该技术，并将整个鳃弓骨骼推离盖玻片边缘图 3I).
	<ol>
		<li>或者，用镊子将两侧背侧瓣膜撑开，小心地将盖玻片放置其上，以一个流畅的动作压平鳃弓骨骼。</li>
		<li>或者，将鳃弓骨骼倒置固定于一张盖玻片上，将每一侧背面向外侧展开，以防止重力作用导致鳃弓骨骼闭合。随后盖上第二张22 mm × 60 mm玻璃盖玻片，并将制备样本翻转。 
		注意：不同的安装技术对每个人的效果可能有所不同。建议尝试每种方法，选择最舒适的一种。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>轻轻按压盖玻片顶部，使黏土小球适度展平，以确保鳃弓骨骼标本保持平整固定，但需注意避免压碎标本。
	<ol>
		<li>在封片过程中，角鳃条可能发生旋转，从而遮挡一排鳃耙。可通过将镊子插入盖玻片之间，重新调整角鳃条或整个鳃弓骨骼的方向来解决此问题。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样本平放在载玻片盒中，于室温保存。若用100%甘油封片，样本可置于桥式盖玻片之间保存至少十年。用异丙醇或乙醇清洁镊子和剪刀，并覆盖尖端。</li>
</ol>
<img alt="植物组织解剖顺序，逐步过程，显微镜制片，实验方法。" src="/files/ftp_upload/54056/54056fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3：鳃弓骨骼的平展封片。 图示鳃弓骨骼的操作与封片过程。蓝色箭头指示运动方向。（A）鳃弓骨骼背面向上。（B–D）在背侧齿板之间进行旋转和切开。（E）在软组织上做侧向切口，以进一步打开肠管基部。（F）将鳃弓骨骼置于盖玻片底部，准备封片。（G）在鳃弓骨骼前半部分（背侧齿板上方）放置第二张盖玻片。（H–I）通过打开背侧齿板瓣并将其在两张盖玻片之间滑动，实现鳃弓骨骼的平展封片。详见步骤4.1至4.6。比例尺 = 5 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54056/54056fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

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作者无任何利益冲突需要披露。

鳃弓骨骼是鱼类咽喉内一组复杂的骨骼结构，在食物进入食道的过程中起到操控、过滤和研磨的作用。许多有趣的摄食相关性状，如鳃耙的排列模式、咽齿以及鳃弓骨骼的形态，在不同物种之间乃至同一物种内部均存在变异。对于这些性状中的大多数而言，若以完整的鳃弓骨骼进行测量，准确测定极为困难甚至几乎无法实现。 原位 (例如，鳃耙长度，鳃弓骨长度）。该平铺式制备方法可将所有鳃部骨骼结构置于一个简单的二维平面中，便于对多个性状进行成像和量化分析。 
本方案的一个局限性在于，尽管在此种平铺的二维制备样本中，牙齿、鳃耙以及大多数软骨内骨骼可以轻松成像并定量，但第二至第四上鳃骨由于具有更强的三维结构，难以清晰观察，需要额外解剖才能准确测量。本方案的第二个局限性是该方法对鱼头具有轻微破坏性。然而，仅有两个骨骼会受到损伤，每个骨骼仅被切割一次，即副蝶骨和额骨。所有其他颅面骨骼结构均可在后续时间点重新取出并进行测量。
该实验方案虽然最初是为刺鱼开发的，但也可用于许多其他鱼类物种，尽管有时需要进行修改。例如，某些鱼类（如斑马鱼）具...

在脊椎动物中，尤其是鱼类之间，头部骨骼存在极为丰富的多样性。在许多情况下，这种多样性有助于不同的摄食策略1-4，并可能涉及颅面结构在外部和内部模式上的重大改变。鳃部骨骼位于鱼类咽喉内部，环绕大部分口腔腔体。鳃部骨骼由5个依次同源的节段组成，其中前四个节段支撑着鳃。这五个节段共同发挥着鱼类与其食物之间相互作用界面的功能5。包括鳃耙、咽齿和鳃部骨骼在内的多种性状的变异，有助于鱼类高效地觅食不同种类的食物。
刺鱼在其海洋祖先迁移到北半球各地的淡水湖泊和溪流后，经历了适应性辐射。其食性从海洋中的小型浮游动物转变为淡水中的较大猎物，导致多种头骨面部特征发生显著的营养性变异6。尽管已有许多研究集中于刺鱼外部头骨面部差异7-13，但重要的头骨面部变化也反复出现在内部鳃部骨骼中。形态差异显著的刺鱼种群之间能够产生可育杂交后代，这为定位鳃部骨骼进化改变的遗传基础提供了极佳的研究机会。
一个具有重要生态意义的营养性状是鳃耙的排列模式，鳃耙是成对分布于鳃弓前后缘的周期性真皮骨，用于滤食猎物。通常以小型猎物为食的鱼类，其鳃耙往往比以较大猎物为食的鱼类更长且间距更密集14,15。种内和种间均已有报道显示鳃耙存在变异14–19，而鳃耙排列模式的某些特征有助于决定其营养生态位和适应性16。数十年来的研究已广泛记录了三刺鱼（threespine sticklebacks）鳃耙数量和长度的变异17–21；然而，这些研究通常仅关注第一列鳃耙。近期研究表明，鳃耙数量在鳃弓骨骼上的遗传调控具有模块性22,23，而单列鳃耙的间距23和长度24也表现出模块性，这凸显了在探究鳃耙减少的发育遗传基础时，研究第一列以外的鳃耙或单个鳃耙之外的更广泛结构的重要性。
另一个在生态学和生物医学上均具有重要意义的营养性状是咽齿的排列模式。鱼类的牙齿可位于口腔颌骨，也可位于鳃部骨骼，后者称为咽齿。口腔牙齿主要用于捕食，而咽齿则用于咀嚼和操控食物25-27。这两类牙齿通过共同的发育机制形成，被认为在发育上具有同源性28。存在有趣的模块化现象：某些物种（如斑马鱼）缺乏口腔齿和背侧咽齿29，而其他物种则在多个角鳃骨、咽鳃骨，有时甚至在基舌骨和下鳃骨上具有牙齿30。在刺鱼中，咽齿位于第五角鳃骨的腹侧以及前后咽鳃骨的背侧31。对刺鱼摄食运动学的研究表明，口腔颌主要用于捕食及辅助吸食摄食9，咀嚼功能则由咽颌承担。在慈鲷中，下咽颌形态表现出显著变异32,33，已被证明具有适应性，并与营养生态位相关34。多个淡水刺鱼种群在进化过程中显著增加了腹侧咽齿数量23,35,36。近期研究表明，这种牙齿数量增加的发育遗传基础，在两个独立演化的淡水刺鱼种群中存在显著差异36。与哺乳动物牙齿不同，鱼类在成体生命期间能够持续再生牙齿37。此前描述的这两个高齿数淡水种群均进化出了更快的牙齿替换速率，为研究再生的遗传基础提供了一个罕见的脊椎动物系统36。
在淡水刺鱼中反复演化出的第三种营养性状是更长的上鳃骨和角鳃骨，它们分别是上颌和下颌的鳃弓节段同源结构38。更长的鳃骨可形成更大的口腔腔体，可能有助于摄食更大的猎物，因而具有适应性优势。此外，在其他鱼类中，上鳃骨对于背侧咽部齿板的下压具有重要作用25。与鳃耙和咽齿类似，鳃骨位于体内，因此难以直接观察或量化。
本文介绍了一种详细的方法，用于解剖并平铺展示鳃部骨骼，从而便于观察和量化多种重要的颅面特征。尽管本方案以刺鱼的解剖为例进行描述，但该方法同样适用于多种其他鱼类。

<table><tbody><tr><td>氢氧化钾 (KOH)</td><td>EMD</td><td>PX1480-1</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7893-4L</td><td></td></tr><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林 (NBF)</td><td>Azer Scientific</td><td>NBF-4-G</td><td></td></tr><tr><td>茜素红 S</td><td>EMD</td><td>AX0485-3</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片 22 mm × 60 mm</td><td>VWR</td><td>16004-350</td><td></td></tr><tr><td>100 mm × 10 mm 玻璃培养皿</td><td>Kimble Chase</td><td>23064-10010</td><td>用于样品解剖</td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅胶弹性体试剂盒</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td>可倒入玻璃或塑料培养皿中以制作解剖板</td></tr><tr><td>油灰模型黏土</td><td>Sargent Art</td><td>22-4000</td><td>1 磅，乳白色</td></tr><tr><td>闪烁瓶（每箱 500 个）</td><td>Wheaton</td><td>986586</td><td>硼硅酸盐玻璃，带螺旋盖</td></tr><tr><td>镊子-Dumont #5 Inox（生物学尖头）</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td>Dumostars 可作为替代品</td></tr><tr><td>解剖剪&amp;nbsp;</td><td>FST</td><td>15003-08</td><td>可根据样品大小选择其他尺寸</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>S6E 配 KL300 LED</td><td>其他多种型号也可使用，具有平坦底座者更佳</td></tr><tr><td>微量离心管 1.7 ml</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>纸板载玻片托盘</td><td>Fisher</td><td>12-587-10</td><td></td></tr></tbody></table>

三刺鱼鳃弓骨骼的解剖与平铺制备

Dissection and Flat-mounting of the Threespine Stickleback Branchial Skeleton

脊椎动物头部的咽后节段发育形成鳃弓骨骼，这是鱼类食物处理的主要部位。鱼类鳃弓骨骼的形态与其物种的食性相适应。三刺棘背鱼（Gasterosteus aculeatus）已成为研究多种性状进化差异的遗传与发育基础的模式系统。棘背鱼的海洋种群已多次迁入大量新的淡水湖泊和溪流。在这些淡水环境中对新食性的适应，可能是导致多个独立演化的淡水种群中反复出现一系列颅面结构变化的原因。这些变化主要包括鳃弓骨骼的三种主要模式改变：鳃耙骨的数量和长度减少、咽部牙齿数量增加，以及鳃弓骨长度增加。本文详细描述了一种用于解剖并平铺三刺棘背鱼内部鳃弓骨骼的实验方案。将整个三维结构的鳃弓骨骼完整解剖并平展为近二维制备样品，可方便地观察和量化鳃弓骨骼的形态。该解剖方法成本低、速度快、相对简便，且适用于多种鱼类。在棘背鱼中，这一高效方法可用于遗传杂交后代骨骼形态的量化分析，进而定位控制颅面模式形成的基因组区域。

本实验方案可获得解剖后平铺固定的鳃部骨骼（图4），便于对多种重要的摄食相关性状进行量化分析。从背侧观察，所有鳃耙列、咽齿板以及几乎所有的鳃弓骨骼均可清晰识别并量化22-24,35,36,38,42。茜素红S在罗丹明或类似的红色滤光片下亦可产生荧光，因此可与其他标记物（例如，转基因GFP42）进行双重标记，并提供另一种可视化方法。荧光在光照下会迅速褪去，因此若计划进行荧光成像或表型分析，应将样品避光保存。从腹侧观察，可清晰看到鳃组织，并可对其色素沉积进行量化分析43。样品可长期保存于100%甘油中。
<img alt="透明化鱼骨骼，骨与软骨染色，比较显微图像，解剖学研究。" src="/files/ftp_upload/54056/54056fig4.jpg" data-altupdated...

鳃部骨骼，包括鳃耙、咽齿和鳃弓骨，在大多数鱼类中是食物处理的主要部位。本文介绍了一种用于解剖并平铺三刺棘背鱼内部骨骼的方法。该方法同样适用于多种其他鱼类物种。

脊椎动物头部的咽后节段发育为鳃弓骨骼，这是鱼类食物处理的主要部位。其形态……

本实验的总体目标是解剖并平铺固定刺鱼的鳃弓骨骼。该方法有助于回答发育、遗传和进化领域中的关键问题，例如动物如何适应新环境，以及在发育过程中成体形态差异是如何产生的。该技术的主要优势在于，通过解剖并平铺鳃部骨骼，可以观察到多种无法在整体骨骼标本中研究的摄食相关性状。在操作前，需先复习三刺棘背鱼头部骨骼的相关形态学知识。在完成鱼类解剖前的准备工作后，首先将尖头5号镊子以45度角从鱼眼侧面插入，刺穿覆盖眼睛的膜结构。然后，像掀开酸奶盖一样剥去眼球的膜。接着，将张开的镊子插入眼球后方，夹住视神经，将眼球摘除。注意避免刺破眼球，否则会导致黑色素泄漏。对另一侧眼睛重复此操作。然后将小型剪刀的刀片置于鳃盖后缘下方，沿鳃盖背侧上方的软组织向眼眶方向剪开。接着剪开位于眼眶背侧的额骨。然后，沿眼眶中心位置的中线切割副蝶骨。在对侧重复进行鳃盖骨切割。在接下来的步骤中，可用骨盆棘作为操作手柄。将它们轻轻直接向外拉离身体，使其展开。然后将镊子插入鳃盖下方，缓慢将面部从身体上剥离，同时修剪掉在此过程中仍附着的任何软组织。操作时请注意鳃耙，避免对其造成扰动。在移除面部骨骼时，容易意外夹住 Percoll 以及第一角鳃骨。剥离 Percoll 向前翻起时，应检查其下方，确保未夹住其他多余组织。现在，用镊子将两侧中线处的角鳃骨与基鳃骨分离，同时剥离并移除前颅面骨骼。在对侧重复此操作。前颅面骨骼包括整个下颌、整个舌骨骨骼、其下方的背侧和软骨内元素以及颅骨的前部。接下来，将闭合的镊子插入食管下方，并向前方拖动，同时分离附着在鳃骨上残留的肌肉和韧带。然后，用闭合镊子的尖端刮除将背侧鳃骨与腹侧脑颅相连的肌肉。从后向前刮取。在刺鱼的另一侧重复肌肉去除操作。接下来，抓住肠管基部，向前牵拉，以去除鳃部骨骼。在第五角鳃骨后方，以垂直切割法分离肠管。常见的错误是抓取肠管的位置过于靠前，导致腹侧额管被远远留下。务必在胸腔后部深处抓取，之后如有需要，可随时去除多余的肠管部分。在从鳃部骨骼背侧的脑颅中去除所有残留的骨碎片后，将剪刀插入鳃篮内，在左右两侧的背侧齿板之间进行背侧剪切。保持该切口居中，以避免损伤背侧齿板。接下来，在鳃骨后端的软质肠腔上做两个浅的侧向切口。在肠管的前端，以协助打开鳃骨结构。现在，将骨骼转移到已装有50%甘油和0.25%氢氧化钾的微量离心管中，以进行温和透明处理。如果无需进一步透明，则可直接转移至纯甘油中。如需重新染色，具体步骤详见文本方案。为准备封片，将溶液更换为纯甘油，并将试管摇动至少五分钟。随后，取出鳃弓骨骼，将其背侧朝上放置于一块22 × 60毫米的玻璃盖玻片底部附近。接着，向骨骼上转移数滴甘油。接下来，揉出两小团油灰，分别置于盖玻片的两端，作为间隔物。然后，在样本上轻轻放置第二片盖玻片，施加适当压力以压平鳃弓前部骨骼。接着，掀开左侧背侧瓣膜（包括背侧齿板），并将该瓣膜滑入两片盖玻片之间。然后对右侧背瓣进行相同操作，并将整个鳃部骨骼从盖玻片边缘推开。为完成该步骤，轻轻按压上方的盖玻片，使黏土小球压平。刚好使鳃弓骨骼保持平展固定即可，切勿过度按压导致压碎。若在操作过程中发现一排鳃耙被遮挡，可用镊子插入盖玻片之间，调整角鳃骨或整个标本的方向。当在纯甘油中压片时，该标本可在室温下平放保存至少十年。本方案可获得解剖并压片的鳃部骨骼，其中多种重要的摄食相关性状均可被长期保存。从背侧观察，所有鳃耙列、咽齿板以及几乎所有的鳃弓骨均可被清晰观察并记录。茜素红S在罗丹明或类似的红色滤光片下也会产生荧光，因此可实现与其他标记物的双重标记及多种可视化方法。在本图像中，鳃耙以尖号标记。牙齿用箭头标示，骨骼用星号标示。掌握该技术后，解剖可在数分钟内完成，可相对快速地对数百只动物进行操作。尽管我们以刺鱼的鳃部骨骼解剖为例进行了演示，但我们希望该操作流程可作为多种鱼类物种解剖的参考指南。通过解剖出鳃部骨骼，我们可以快速且直观地观察到多种重要的摄食相关性状，这些性状在整体标本中无法看到，从而有助于更好地理解颅面骨骼的发育与演化。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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三刺鱼鳃弓骨骼的解剖与平铺制备

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