解剖和三刺鳃骨架的平面安装
May 7th, 2016
鳃骨骼，包括鳃耙、咽齿和鳃骨，是大多数鱼类食物加工的主要场所。在这里，我们描述了一种协议，用于解剖和平装三脊椎粘背鱼中的这个内部骨骼。这种方法也适用于各种其他鱼类。
该程序的总体目标是解剖和平装 Stickleback 鳃骨。这种方法可以帮助回答发育、遗传学和进化论领域的关键问题。例如动物如何适应新环境以及成体形态在发育过程中如何出现变化。
这种技术的主要优点是，通过解剖和扁平安装鳃骨架，可以可视化无法在整个安装中研究的各种营养性状。在准备过程中，回顾三个脊柱粘背的相关头部骨骼形态。准备好鱼进行解剖后，首先将锋利的 5 号镊子以 45 度角插入眼睛侧面，以刺穿覆盖眼睛的膜。
然后，剥掉眼膜，就像酸奶容器的盖子一样。接下来，将打开的镊子插入眼睛后面，抓住视神经，然后取出眼睛。小心避免刺破眼睛，否则会漏出黑色素。
重复此过程，眼睛在另一侧。然后，将小剪刀的刀片放在鳃盖瓣的后侧下方，从鳃盖上方的背侧切开软组织，朝向眼窝。接下来切开额骨，即眼眶背侧。
然后，切开中线蝶骨，围绕眼窝中心。在另一侧重复鳃盖切割。在接下来的步骤中，骨盆棘可以用作手柄。
它们通过轻轻地将它们直接从身体上拉开来折叠起来。现在，将镊子插入鳃盖下，慢慢地将面部从身体上剥离。修剪掉在此过程中仍然附着的任何软组织。
小心鳃耙周围，注意不要打扰它们。在去除面部骨骼时，很容易不小心抓住第一块角鳃骨和颈椎。向前剥皮时，请查看他们的 percoll 下方，以确保您没有多余的东西。
现在，用镊子从中线基底骨的两侧分离角骨，同时剥离并去除前颅面部骨骼。在另一侧重复。前颅面部骨骼包括整个下颌、整个舌骨、下面的背侧和内软骨元件以及颅骨的前部。
接下来，将闭合的镊子插入肠管正下方，然后向前拖动。在此过程中梳理附着在鳃骨架上的剩余肌肉和韧带。然后，使用闭合镊子的尖端刮掉将背鳃骨架连接到腹侧脑壳的肌肉。
用从后到前的运动刮擦。在 stickleback 的另一侧重复肌肉去除过程。接下来，抓住肠管的底部并向前拉，去除鳃骨。
使用垂直切口将肠管分开，位于第五尾鳃骨的后方。一个常见的错误是将肠管抓住得太靠前，这会使腹侧额管远远落后。一定要抓住胸腔后部的深处，以后可以随时取出多余的肠管。
从鳃骨背侧的脑壳中取出任何剩余的骨碎片后。将剪刀插入鳃篮中，并在双侧背齿板之间做一个背切。保持此切口居中，以免损坏背侧牙板。
接下来，在鳃骨架后端的橡胶肠腔中做两个浅的横向切口。在肠管的前端。协助打开鳃骨。
现在，将骨架转移到装有 50% 甘油、零点 2 5% 氢氧化钾的 microsentrifuge 管中，以温和地清除。或者，如果不需要进一步澄清，则将其转移到纯甘油中。如果需要重新染色，文本方案中给出了详细信息。
准备封片时，将溶液改为纯甘油，并摇晃试管至少 5 分钟。然后，取出鳃骨，将其放在 22 x 60 毫米玻璃盖玻片底部附近，背侧朝上。现在，将几滴甘油转移到骨骼上。
接下来，擀出两个小的造型粘土球，在盖玻片的两端各打一个，它们起到垫片的作用。然后，在制剂上松散地放置第二个盖玻片，用足够的压力使前鳃骨变平。现在，撕开左背侧皮瓣，包括背侧牙板，然后将皮瓣滑入盖片之间。
然后对右背皮瓣做同样的事情。并将整个鳃骨架从盖玻片的边缘推开。要完成该过程，请轻轻按压顶盖玻片以压平粘土球。
刚好足以让他们保持鳃骨平放。但是，并没有太多以至于它被压碎了。如果在此过程中，一排耙子被遮挡，请在盖玻片之间滑动镊子并重新定向角鳃或整个制剂。
当平装在纯甘油中时，制剂可以在室温下平放储存至少十年。该方案导致解剖和扁平的鳃骨架。可以记录各种重要营养性状的地方。
从背视图看，所有行的鳃耙、所有咽齿板和几乎所有的鳃骨都可以很容易地可视化和计时。茜素红 S 也在罗丹明或类似的红色滤光片上发荧光，允许使用其他标记物和替代方法进行双重标记以进行可视化。在这张图片中，鳃耙标有克拉。
牙齿用箭头标记，骨骼用星号标记。一旦掌握，解剖可以在几分钟内完成，并且可以相对较快地对数百只动物进行解剖。虽然我们已经展示了粘背鳃骨骼解剖，但我们希望该程序可以用作各种鱼类的指南。
通过解剖鳃骨架，我们可以快速轻松地可视化各种重要的营养性状，这些性状在整个坐骑中是看不到的。可以更好地了解颅面部骨骼的发育和进化。
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概述
本文介绍了一种解剖和展平三刺鳅鳃骨骼的方法，这是鱼类食物处理的一个关键方面。该方法适用于各种鱼类，有助于理解发育和进化生物学。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 进化生物学
背景
- 鳃骨骼包括鳃耙、咽齿和鳃骨。
- 它是大多数鱼类食物处理的主要部位。
- 理解这种结构可以提供关于动物适应和形态变异的见解。
- 在解剖之前，回顾头部骨骼形态至关重要。
研究目的
- 解剖并展平鳅鱼的鳃骨骼。
- 可视化整体制备中不可见的营养特征。
- 探索发育、遗传学和进化中的关键问题。
使用的方法
- 准备鱼进行解剖。
- 插入尖钳以穿刺覆盖眼睛的膜。
- 解剖鳃骨骼。
- 展平解剖的骨骼以供可视化。
主要结果
- 该技术允许详细可视化鳃骨骼。
- 它促进了鱼类营养特征的研究。
- 提供了适用于各种鱼类的方法。
- 增强了对发育和进化过程的理解。
结论
- 解剖和展平方法对研究鳃骨骼是有效的。
- 这种方法可以帮助回答重要的生物学问题。
- 它有助于更广泛地理解鱼类形态和适应。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables precise morphological analysis of the branchial skeleton, a key determinant of feeding efficiency and dietary adaptation in fish. By allowing quantification of trophic traits such as gill raker number and pharyngeal tooth density, it supports target validation in studies of evolutionary developmental biology. The method provides a scalable, reproducible system for linking genotype to phenotype in vertebrate craniofacial patterning.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of genetic variants affecting craniofacial morphology through quantitative trait analysis.
- Operational Value: Provides a standardized, high-throughput compatible dissection workflow for phenotypic screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable, two-dimensional preparations suitable for imaging-based assay readouts.
- Operational Value: Facilitates assay standardization through consistent flat-mount morphology and glycerol-based clearing.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by visualizing developmental changes in skeletal patterning relevant to human congenital disorders.
- Operational Value: Enables cross-species applicability, enhancing translational continuity in vertebrate model systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where phenotypic screening of genetic mutants or natural variants requires detailed anatomical readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking genomic variation to measurable skeletal phenotypes.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative morphological outputs essential for assay development.
- Analytics: Enables measurement of trait distributions such as bone length and tooth number for statistical comparison.
- Translational Research: Connects fish craniofacial evolution to conserved developmental pathways in higher vertebrates.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for skeletal phenotyping across diverse fish species and genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in genotype-phenotype maps by reducing observational ambiguity in complex 3D structures.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized dissection and mounting steps applicable across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in target validation by providing clear, quantifiable phenotypic data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of genetic loci based on effect size and penetrance of craniofacial traits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in vertebrate anatomy and microsurgical dissection techniques.
- Dependent on fine forceps, micro-scissors, and glycerol-based clearing solutions.
- Necessitates standardized training to ensure consistent flat-mount quality and avoid tissue damage.
- Adaptation to larger or more heavily mineralized fish may require adjusted clearing times or enzymatic treatments.
- Practical limitations include potential obscuration of posterior elements if mounting pressure is uneven.
