Name: 肌丝的Ca评估 2+灵敏度潜在心脏兴奋收缩耦联 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 了解心肌细胞肌丝钙敏感性评估方法，通过Fura-2 AM荧光探针和相位平面分析技术，研究心脏兴奋收缩耦联机制。该方法可检测高血压等病理状态下心肌收缩功能的变化。

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本研究由韩国国家研究基金会（NRF）通过韩国教育科技部资助的基础科学研究中心项目（2013068067）；韩国教育科技部脑科学BK21研究生项目、首尔国立大学医院、韩国高血压学会（2013）、SK电信研究基金（编号3420130290）以及国家自然科学基金委员会（NSFC&#160;31460265；NSFC 81260035）资助。

本方案遵循联合国国立卫生研究院（NIH出版物第85-23号，1996年修订版）发布的《实验动物护理与使用指南》，并已获得首尔国立大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准（IACUC批准编号：SNU-101213-1）。
1. 缓冲液制备（见材料与设备表）
<ol>
	<li>在实验当天配制 300 ml 新鲜分离液（单位：mM：NaCl 135；KCl 5.4；MgCl2 3.5；葡萄糖 5；HEPES 5；Na2HPO4 0.4；牛磺酸 20；用 NaOH 调节 pH 至 7.4）。</li>
	<li>在实验当天配制 100 ml 新鲜保存液（单位：mM：NaCl 120；KCl 5.4；MgSO4 5；CaCl2 0.2；丙酮酸钠 5；葡萄糖 5.5；牛磺酸 20；HEPES 10；甘露醇 29；用 NaOH 调节 pH 至 7.4）。</li>
	<li>配制 1 L 灌流液（单位：mM：NaCl 141.4；KCl 4；NaH2PO4 0.33；MgCl2 1；HEPES 10；葡萄糖 5.5；CaCl2 1.8；甘露醇 14.5；用 NaOH 调节 pH 至 7.4）。</li>
	<li>向 25 ml 分离液中加入胶原酶（1 mg/ml）、蛋白酶（0.1 mg/ml）、牛血清白蛋白（BSA，1.67 mg/ml）和 Ca2+（0.05 mM），配制成 30 ml 胶原酶溶液 1。</li>
	<li>向 16.7 ml 分离液中加入胶原酶（1 mg/ml）、BSA（1.67 mg/ml）和 Ca2+（0.05 mM），配制成 20 ml 胶原酶溶液 2。</li>
	<li>将 0.4 g BSA 加入 40 ml 分离液中，配制成 BSA 溶液。将该溶液分装至两个烧杯中，分别为 10 ml 和 30 ml。向 30 ml BSA 溶液中加入 Ca2+，使 BSA 溶液中 Ca2+ 的终浓度为 1 mM。</li>
</ol>
2. 左心室（LV）心肌细胞分离的准备工作
<ol>
	<li>将8至12周龄的雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠转移至清洁的运输笼中，从动物饲养室运送至制备与分离室。</li>
	<li>将两个水浴加热至37 o C. 
	注意：使用一个水浴锅为Langendorff灌流系统的水套式储液器和灌流管路提供恒温环境。使用另一个水浴锅振荡心肌组织块，以分离单个心肌细胞。</li>
	<li>加入5 ml和3.3 ml的BSA溶液（不含Ca2+将胶原酶溶液1加至25 ml，胶原酶溶液2加至16.7 ml，分别定容至30 ml和20 ml。</li>
	<li>向Langendorff灌流系统的1号柱（Col. 1）和2号柱（Col. 2）分别加入分离液（100 ml）和胶原酶溶液1（30 ml）图1A).</li>
	<li>在第1列和第2列中对分离溶液和胶原酶溶液1进行氧合 通过 Langendorff 灌流系统中的氧气连接管图1A）。类似地，在振荡水浴中用100% O₂预充氧胶原酶溶液2和BSA溶液2&#160;通过 氧气连接管</li>
</ol>
3. LV 心肌细胞的分离
<ol>
	<li>麻醉一只SD大鼠 通过 腹腔注射戊巴比妥钠（30 mg/kg），并通过脚趾夹捏无回缩反射来确认麻醉状态。</li>
	<li>将大鼠移至解剖托盘中，仰卧位，用胶带将四肢固定在身体两侧。</li>
	<li>用手术剪在胸部腋中线处做切口以打开胸腔，注意避免损伤心脏。使用另一把干净的手术剪将心脏从相连的血管处分离。例如， 上腔静脉和下腔静脉、肺血管、主动脉以及心包膜13.</li>
	<li>保留足够长度（5 - 8 mm）的一段主动脉，用精细镊子夹住主动脉，并在1分钟内迅速将Langendorff灌流系统的套管插入并固定图1A用4/0缝合线在主动脉上打紧结。</li>
	<li>打开第1列的阀门，用预热并充氧的分离溶液以12-14 ml/min的灌流速率灌注离体心脏10分钟。关闭第1列的阀门，打开第2列的阀门，用胶原酶溶液1灌注心脏8-10分钟。</li>
	<li>用镊子夹住主动脉，剪断后取下已消化的心脏，并将其转移至含有新鲜分离溶液的烧瓶中（图1Bi）。使用精细剪刀和镊子将左心室游离壁（包括室间隔）的大部分组织剪成较小的片段（约22 mm， 图1Bii).</li>
	<li>将组织块转移至含有预热且充氧的新鲜胶原酶溶液2的烧瓶中图1Biii）。振荡10分钟。持续向含有心肌细胞的胶原酶溶液中通入氧气2。</li>
	<li>使用带吸球的滴管将心肌细胞悬液转移至10 ml离心管中，并加入Ca2+ - 加入等体积含牛血清白蛋白（BSA）的溶液，30 g 离心 2 分钟，弃上清液。将心肌细胞沉淀重悬于 5 ml BSA 溶液中，离心后弃去上清液。</li>
	<li>重悬心肌细胞沉淀，并将心肌细胞置于10 ml预充氧的保存液中，在室温下保存（RT）图1Biv-vi).</li>
	<li>用烧瓶中剩余的左心室组织重复上述步骤（步骤 3.7 - 3.9）。 
	注意：重复步骤 3.7 至 3.9，直至大部分 LV 组织消失，以获得较大量的心肌细胞。</li>
	<li>将心肌细胞置于储存液中，在室温下保存6-8小时，直至实验结束。</li>
</ol>
4. 同时测量细胞内 Ca2+ 瞬变和心肌细胞收缩
<ol>
	<li>用乙酰甲酯Fura-2 AM（2 µM）负载LV心肌细胞。 
	注意：所有负载操作及对已负载心肌细胞的实验均需在避光试管中进行（图1Bvii）。
	<ol>
		<li>将心肌细胞悬液（1 ml）在2,000 × g下离心10秒。弃去上清液，并将心肌细胞沉淀重悬于1 ml低Ca2+浓度（250 µM，见材料与设备表）的Tyrode溶液中。</li>
		<li>加入Fura-2AM和泊洛沙姆407（2 µl），轻轻混匀心肌细胞悬液，并在室温（20 - 24o C）下孵育15分钟&#160;（图1Bvii）。</li>
		<li>将混合液离心5秒，弃去上清液，并将心肌细胞沉淀分散于含500 µM Ca2+的1 ml灌流液中。10分钟后，再次离心5秒并弃去上清液。</li>
		<li>加入新鲜灌流液（含500 µM Ca2+，1 ml），并将负载了Fura-2AM的心肌细胞沉淀保存在此溶液中用于记录。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LV心肌细胞收缩及细胞内Ca2+的测量
	<ol>
		<li>记录前，将预热至36 o C的Tyrode溶液注入穿过水浴夹套的灌流管中。</li>
		<li>取数滴已负载Fura-2 AM的LV心肌细胞悬液滴加至倒置荧光显微镜的样品室中，静置5 - 8分钟。以2.2 ml/min的速度缓慢灌流Tyrode溶液。</li>
		<li>按下数字刺激器前面板上的&#34;开始&#34;按钮，启动场刺激（2 Hz）。 
		注意：输出电压（10 V，持续时间5毫秒）通过位于样品室两侧的铂丝电极施加于样品室中的心肌细胞。
		<ol>
			<li>选择收缩稳定的心肌细胞（排除过度收缩或收缩不足的细胞）进行记录。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>调整目标心肌细胞在基于视频的肌节检测系统中的水平位置，并调节显微镜焦距，以获得清晰的肌节图像。将紫色矩形框置于肌节清晰可见的区域，直至肌节长度平均值（红色峰）呈现单一尖锐峰形（图2A，下图）。</li>
		<li>记录心肌细胞在场刺激下肌节长度的变化（图2A和B）。 
		注意：负载后的心肌细胞应在1 - 2小时内使用。</li>
		<li>调节相机光圈，使基于视频的肌节检测系统中的视野大小与心肌细胞相匹配（图2A）。以360 nm/380 nm激发、510 nm发射（采集频率1,000 Hz）对心肌细胞进行刺激，并同步记录肌节缩短程度及Fura-2 AM荧光比值（图2B）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 肌原纤维Ca2+敏感性的评估
<ol>
	<li>平均肌节长度和Ca2+ 稳态下的瞬变信号（10–20 次扫描），绘制 Fura-2 比值的相平面环路 与 同一心肌细胞的肌节长度（包括测量值和变化量）； 图 2C).</li>
	<li>在每个图中，定义Fura-2比值在50%松弛时的值（EC50, 图2C）。比较环状结构和EC50 每种干预措施</li>
</ol>

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<li>Grynkiewicz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

此处，我们描述了评估肌丝钙敏感性变化的实验方案，以及在分离的肌纤维中测量ATP酶活性的方法。2+ 单个分离心肌细胞中的敏感性，并强调在测量电生理特性、细胞内Ca的同时，检测该参数的重要性2+ 瞬变过程以及肌丝动力学。这是因为仅记录其中一个或两个参数可能无法阐明心肌收缩和舒张的潜在机制。与仅测量心肌细胞收缩和细胞内Ca2+ 单独分析每个样本1, 本方法在同一批心肌细胞中同时检测这两个参数.
通常采用多种方法来评估肌丝对钙离子的敏感性2+ 肌肉或肌细胞的敏感性15,16,17, 例如， 外源性Ca相互作用的检测2+ 以及去膜心肌细胞（经皂苷或β-伊辛等去污剂处理以通透细胞膜）中肌节/细胞长度/张力的测量。长度通过光电二极管与激光束衍射技术测定，张力则使用力传感器或碳纤维测定。这些技术在肌肉研究中被广泛应用，因其可实现肌丝对钙离子反应的定量评估2+ 灵敏度。然而，...

心脏兴奋-收缩（E-C）耦联是分析心肌机械特性的基本方案， 即， 心脏的收缩功能1,2. E-C 耦联由肌膜离子通道活动引起的膜去极化所启动（例如， 电压门控Na+ 通道，可进行测量 通过 膜片钳技术）。随后激活电压门控L型Ca2+ 通道（LTCCs）和Ca2+ 流入 通过 LTCCs 触发大部分 Ca2+ 通过兰尼碱受体（RyRs）释放，增加胞质 Ca2+ 从纳摩尔（nM）到微摩尔（µM）浓度水平。这种细胞质 Ca²⁺ 浓度的升高2+ 促进 Ca2+ 与细丝中的肌钙蛋白C（TnC）结合，引发肌丝复合物的构象改变，促进肌动蛋白与肌球蛋白的相互作用，从而实现心肌收缩3. 相反，细胞质中的 Ca2+ 被重新摄取&#160;回到肌浆网（SR）中，通过 Ca2+-ATP酶（SERCA2a）在肌质网（SR）中，或被排出心肌细胞外 通过 Na+/Ca2+ 交换体和质膜Ca2+ ATP酶1,2因此，胞质中 Ca2+ 引发细丝构象恢复至原始状态，导致肌动蛋白-肌球蛋白解离及心肌细胞舒张1-3在此机制中，SERCA2a 的活性通常被认为决定了心肌舒张的速度，因为它介导了胞质中 70 - 90% 的 Ca²⁺2+ 大多数哺乳动物心肌细胞中的去除1因此，异常的 Ca2+ LTCC、RyR 和 SERCA2a 等对钙离子的调控已被认为是病变心脏收缩和舒张功能受损的主要机制1-4.
实际上，游离的胞质 Ca2+ 在兴奋-收缩耦联中作为信使发挥作用的细胞内钙约占总细胞内钙的1%2+ 以及大多数Ca2+ 与细胞内 Ca 结合2+ 缓冲液5,6。这是由于不同的Ca2+ 缓冲液在心肌细胞中含量丰富， 例如， 膜磷脂、ATP、磷酸肌酸、钙调蛋白、副肌球蛋白、肌原纤维肌钙蛋白C、肌球蛋白、肌浆网钙泵2a（SERCA2a）以及肌质网中的钙结合蛋白（calsequestrin）。5,6,7其中，SERCA2a 和 TnC 是主要的 Ca2+ 缓冲液5,6,7。此外，Ca2+ 在抽搐过程中，与缓冲液的结合是一个动态过程例如， 30-50% 的 Ca2+ 与肌钙蛋白C（TnC）结合，并在Ca²⁺存在下与其解离2+ 瞬时表达7）以及Ca的变化2+ 结合导致额外 &#34;释放&#34; 游离 Ca2+ 进入细胞质后，导致细胞内 Ca 的改变2+ 浓度。因此，细胞内 Ca 的扰动2+ 水平升高会引发肌丝异常运动，这是收缩功能障碍和心律失常的前兆8,9许多因素（包括生理性和病理性因素）均可导致肌丝蛋白的转录后修饰，从而影响肌丝对钙离子的敏感性2+ 缓冲与肌丝钙2+ 灵敏度8-10最近有报道称，肌丝蛋白的突变会增加钙离子敏感性2+ 结合亲和力和细胞内 Ca2+ 处理，触发依赖于暂停的钙离子增强效应2+ 瞬变，异常Ca2+ 释放，以及心律失常8。与此概念一致，我们也已证明肌丝钙离子2+ 高血压大鼠心脏中由于神经元型一氧化氮合酶上调所致的去敏感化与舒张期和收缩期钙离子水平升高相关2+ 水平11，进而增加LTCC对Ca的易损性2+依赖性失活12因此，肌丝Ca2+ 敏感性是一种 &#34;活性&#34; 细胞内钙调节因子2+ 稳态与心肌细胞收缩功能。分析肌丝与钙离子之间的相互作用已变得十分必要2+ 处理蛋白质以深入研究心肌细胞的兴奋-收缩耦联及心脏功能。
在此，我们描述了一种用于评估肌丝钙敏感性变化的实验方案。该方法通过分离心肌纤维并测定其在不同钙离子浓度下的收缩力，以分析肌丝对钙离子的响应特性。该技术可用于研究心力衰竭、心肌病及其他影响心肌收缩功能的病理状态下肌丝功能的改变。2+ 分离心肌细胞中的敏感性。综合分析&#160;细胞内 Ca2+ 谱型，肌丝钙2+ 敏感性和收缩性将揭示心肌力学的新型潜在机制。

<table><tbody><tr><td>Sprague Dawley 大鼠</td><td>Koatech</td><td></td><td>8-12 周</td></tr><tr><td>戊巴比妥钠</td><td>韩国韩林制药公司</td><td>AHN901</td><td>保险代码：645301220</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td></td></tr><tr><td>甘露醇</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>默克</td><td>8.08616.1000</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&amp;nbsp;&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>71649</td><td></td></tr><tr><td>牛胎盘白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>II型胶原酶</td><td>沃辛顿</td><td>LS004177</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 (AM)</td><td>分子探针</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>DMSO 中 20% Pluronic F127 溶液</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr><tr><td>振荡水浴箱</td><td>张 Shin 科学</td><td>型号：C-108</td><td></td></tr><tr><td>IonWizard 软件套件</td><td>IonOptix Ltd</td><td>实验设计工具</td><td>心肌细胞中兴奋-收缩耦合数据的采集与分析</td></tr><tr><td>心肌细胞钙 &amp;& 收缩力记录系统</td><td>IonOptix Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>循环水浴</td><td>BS-Tech</td><td>BW2-8</td><td></td></tr><tr><td>心肌细胞荧光显微镜</td><td>尼康</td><td>DIATPHOTO 200</td><td></td></tr><tr><td>MyoCam-S 功率</td><td>IonOptix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光 &amp;和视频检测</td><td>IonOptix</td><td>MyoCam-S</td><td></td></tr><tr><td>CFA300</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMT400</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光 &amp;和系统接口</td><td>IonOptix</td><td>FSI700</td><td></td></tr><tr><td>激发光源</td><td>IonOptix</td><td>mSTEP</td><td></td></tr><tr><td>高强度ARC灯电源供应器</td><td>凯恩研究</td><td></td><td></td></tr><tr><td>滤光轮控制器</td><td>IonOptix</td><td>GB/MUS200</td><td></td></tr><tr><td>数字刺激器</td><td>Medical Systems Corporation</td><td>S-98 多模式</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;实验溶液的组成&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>分离液（pH：7.4，NaOH）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>浓度（mmol）135</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>浓度（mmol）5.4</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>浓度（mmol）5</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>浓度（mmol）5</td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td>浓度（mmol）3.5</td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>Sigma</td><td>CB2742654</td><td>浓度（mmol）20</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&amp;nbsp;&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>71649</td><td>浓度（mmol）0.4</td></tr><tr><td>储存溶液（pH：7.4，NaOH）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>浓度（mmol）120</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>浓度（mmol）5.4</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>浓度（mmol）10</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>浓度（mmol）5.5</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>浓度（mmol）0.2</td></tr><tr><td>甘露醇</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td>浓度（mmol）29</td></tr><tr><td>MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td>浓度（mmol）5</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td>浓度（mmol）5</td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>Sigma</td><td>CB2742654</td><td>浓度（mmol）20</td></tr><tr><td>灌流液（Tyrode 溶液，pH：7.4，NaOH）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>浓度（mmol）141.4</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P4504</td><td>浓度（mmol）4</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td>浓度（mmol）0.33</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>浓度（mmol）10</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td>浓度（mmol）5.5</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>浓度（mmol）1.8&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Fura 2AM 负载时，CaCl2 浓度分别为 0.25 mM 和 0.5 mM</td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td>浓度（mmol）1</td></tr><tr><td>甘露醇</td><td>Sigma</td><td>M4125</td><td>浓度（mmol）14.5</td></tr><tr><td>胶原酶溶液1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>分离液（30 mL）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛胎血清白蛋白（BSA 溶液 5 ml）</td><td></td><td></td><td>浓度（mmol）1.67 mg/mL</td></tr><tr><td>II型胶原酶</td><td>沃辛顿</td><td>LS004177</td><td>浓度（mmol）1 mg/mL</td></tr><tr><td>蛋白酶</td><td>Sigma</td><td>P6911</td><td>浓度（mmol）0.1 mg/mL</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>浓度（mmol）0.05 mM</td></tr><tr><td>胶原酶溶液2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>分离液（20 mL）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛胎血清白蛋白（BSA 溶液 3.3 mL）</td><td></td><td></td><td>浓度（mmol）1.67 mg/mL</td></tr><tr><td>II型胶原酶</td><td>沃辛顿</td><td>LS004177</td><td>浓度（mmol）1 mg/mL</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>浓度（mmol）0.05 mM</td></tr><tr><td>BSA 溶液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>分离液（40 mL）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛胎血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>浓度（mmol）400 mg</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Biosesang</td><td>C2002</td><td>浓度（mmol）1 mM</td></tr></tbody></table>

评估心肌兴奋-收缩耦联中肌丝对ca2+的敏感性

Assessment of Myofilament Ca2+ Sensitivity Underlying Cardiac Excitation-contraction Coupling

心力衰竭和心脏心律失常是全球范围内导致死亡和疾病负担的主要原因。然而，病变心脏中病理发生机制及心肌功能障碍仍未完全阐明。近年来强有力的证据表明，肌丝对Ca2+敏感性的改变会影响心肌细胞内Ca2+稳态以及离子通道活性，而这些正是健康与病变心脏中产生心脏动作电位和收缩功能的核心机制。事实上，通常通过检测介导心脏动作电位的离子通道和转运体活性（例如，Na+、Ca2+和K+通道以及Na+-Ca2+交换体）以及细胞内Ca2+调控蛋白（例如，兰尼碱受体、肌浆网Ca2+-ATP酶（SERCA2a）、磷胶蛋白及其磷酸化状态）来评估心肌兴奋-收缩（E-C）耦联的基本机制。细胞膜上的电活动与细胞内Ca2+变化是E-C耦联的触发信号，而肌丝则是收缩与舒张的功能单位，肌丝对Ca2+的敏感性在肌原纤维功能实现中至关重要。然而，除非研究重点即为此，否则极少有研究在心肌功能分析中纳入肌丝Ca2+敏感性的评估。本文介绍一种通过Fura-2 AM（比率检测法）测量大鼠心脏心肌细胞中肌节缩短/再伸长及细胞内Ca2+水平，并评估肌丝Ca2+敏感性变化的实验方案。主要目的在于强调，在进行机制性分析时，应将肌丝Ca2+敏感性纳入E-C耦联的研究范畴。全面探究健康与病变心脏中心肌细胞收缩力背后的离子通道、离子转运体、细胞内Ca2+调控以及肌丝Ca2+敏感性，将为设计更具转化意义和治疗价值的干预策略提供重要信息。

从正常和高血压大鼠心脏中分离左心室心肌细胞。选择具有清晰横纹（代表肌节）且在电场刺激下能产生稳定收缩的杆状心肌细胞作为理想细胞用于记录图2A）。在图F所示的示例中图2A将负载Fura 2 AM的左心室心肌细胞水平放置，并调节相机光圈，使心肌细胞占据记录视野的大部分区域，同时尽量减少背景区域的纳入。在记录视野中，通过计算机屏幕上的记录程序点击并拖动紫色方框，调整其尺寸。当平均肌节长度显示为一个清晰的红色峰时，开始记录图2A，下图）。
在同一心肌细胞中同时记录肌节长度和细胞内Ca2+瞬变（Fura-2比值）（图3A）。肌节长度和Ca2+瞬变的平均轨迹如图3B所示。分别测量舒张期/收缩期肌节长度、达峰时间（PT）和肌节缩短程度，以评估心肌细胞收缩功...

本文介绍了一种用于评估大鼠心脏分离心肌细胞在收缩过程中肌丝对Ca2+敏感性变化的实验方案。该检测方法结合心脏电生理学、收缩期/舒张期胞质Ca2+水平以及收缩/舒张功能，对于揭示健康与病变心脏中心肌兴奋-收缩耦联机制具有重要意义。

评估心肌兴奋-收缩耦联中肌丝对Ca2+的敏感性

心力衰竭和心律失常是全球范围内导致死亡和疾病负担的主要原因。然而，其发病机制以及心肌……

本实验的总体目标是获取肌丝对钙离子的敏感性，以加深我们对健康和病变心脏收缩机制的理解。该方法有助于解答与心脏充血和心力衰竭相关的问题。该技术的主要优势在于，结合离子通道、离子转运体以及细胞间钙离子调控，能够全面理解小鼠心脏在健康和疾病状态下收缩功能的潜在机制。开始此操作时，将两个水浴锅加热至 37 摄氏度。向 25 毫升胶原酶溶液一中加入 5 毫升无钙 BSA 溶液，向 16.7 毫升胶原酶溶液二中加入 3.3 毫升无钙 BSA 溶液。然后，在 Langendorff 灌流系统中，向第一柱加入 100 毫升分离溶液，向第二柱加入 30 毫升胶原酶溶液一。通过兰格多夫灌流系统中的供氧连接管，分别对第一列和第二列的分离溶液和胶原酶溶液进行氧合。同样，通过供氧连接管，在摇床水浴中用100%氧气对胶原酶溶液二和牛血清白蛋白（BSA）溶液进行氧合。在此步骤中，通过腹腔注射戊巴比妥钠麻醉SD大鼠后，通过夹趾实验及观察其是否缺乏回缩反射来确认麻醉状态。随后，将大鼠转移至解剖托盘中。使其呈仰卧位，用胶带将四肢固定于身体两侧。接着，用精细镊子夹住主动脉，并立即连接Langendorff灌流系统的灌流针。随后，将缝合线在主动脉上方扎紧。打开1号柱的阀门，用预热并充氧的分离溶液灌注离体心脏10分钟。接着，打开2号柱的阀门，用胶原酶溶液1灌注心脏8至10分钟。随后，剪断主动脉以取出已消化的心脏，并将其转移至含有新鲜分离溶液的烧瓶中。使用精细剪刀和镊子，将包括室间隔在内的大部分左心室游离壁剪成较小的组织块。接着，将组织转移至含有预热并充氧的新鲜胶原酶溶液二的烧瓶中。然后，振荡10分钟，并将含有心肌细胞的胶原酶溶液置于含氧环境中。随后，将心肌细胞悬液转移至10 mL离心管中，并加入含钙的BSA溶液，离心2分钟。两分钟后，弃去上清液，将心肌细胞沉淀重悬于5毫升BSA溶液中。然后再次离心并弃去上清液。接着分散心肌细胞沉淀，将心肌细胞置于10毫升预先充氧的保存溶液中，于室温下保存直至实验结束。现在，用2微摩尔的乙酰甲酯Fura-2AM对LV心肌细胞进行负载。将1毫升心肌细胞悬液离心10秒。然后，弃去上清液，并将心肌细胞沉淀重新悬浮于1毫升低钙浓度的Tyrode溶液中。随后，向心肌细胞中加入 Fura-2AM 和 2 微升泊洛沙姆 407。轻轻分散心肌细胞悬液，并在室温下孵育 15 分钟。孵育结束后，将混合液离心 5 秒。弃去上清液，并将心肌细胞沉淀物重悬于含有500 µM钙的1 mL灌流液中。10分钟后，将混合物以5秒离心，弃去上清液。接着，加入新鲜灌流液，并将负载Fura-2AM的心肌细胞沉淀物置于该溶液中用于记录。记录前，将36摄氏度的Tyrode溶液注入穿过水浴夹套的灌流管中。随后，取数滴负载Fura-2AM的左心室心肌细胞悬液置于倒置荧光显微镜的灌流 chamber 内，静置5至8分钟。以每分钟2.2毫升的速度用Tyrode溶液缓慢灌流。然后，按下数字刺激器前面板上的启动按钮，以2赫兹开始场刺激。选择收缩稳定的肌细胞进行记录。图中显示的是假手术组和高血压组大鼠左心室肌细胞的肌节缩短和Fura-2比率测量的原始轨迹。以下是肌节长度和Fura-2信号的平均迹线。以及两组中Fura-2比率与肌节长度的相平面图。高血压组的轨迹环向右偏移，且EC50有升高趋势，提示肌丝钙离子敏感性降低。在进行本实验操作之前，务必记住要通过检测未负载 Fura-2AM 的心肌细胞收缩情况来测试心肌组织或分离的心肌细胞。此外，在负载 Fura-2AM 后应始终检查心肌细胞的收缩功能，以避免染料过载。完成本实验步骤后，还可进一步采用其他方法（如膜片钳技术）来回答更多科学问题。例如，A型钙通道活性，即心肌细胞兴奋-收缩耦联过程中的关键环节。该技术的发展为未来心脏生理学领域的研究人员探索人类心脏疾病的机制开辟了道路。经过常规实践后，您应能够充分掌握心肌肌丝钙通道活性的分析方法。为了更好地理解介导健康和病变心脏中兴奋-收缩耦联的机制。

assessment-myofilament-ca2-sensitivity-underlying-cardiac-excitation

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

肌丝的Ca评估<sup&gt; 2+</sup&gt;灵敏度潜在心脏兴奋收缩耦联

我们介绍一种直接测量离体骨骼肌肌肉力量、肌肉功率、收缩动力学及疲劳性的方法 体外 使用场刺激的系统。关于Ca2+ 通过不同的刺激方案，可获得肌肉的力学特性及其收缩机制的相关数据。...

离体 离体骨骼肌收缩力、疲劳性及交替性的评估

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小鼠离体乳头肌收缩力测量用于心肌变力性研究

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兔心Langendorff灌注模型中肌浆网内Ca2+及跨膜电位的光学标测

本方案旨在逐步描述利用去膜心肌细胞提取和评估心脏功能的技术。该方法可利用从小块冷冻活检样本中获取的材料，对肌丝功能进行测量和急性调节，这些样本可从不同心脏部位获取，适用于从小鼠到人类的多种物种。...

利用去膜心肌细胞进行心脏功能的体外评估

我们提出了一种评估GtACR1激活在兔心肌细胞中机电效应的实验方案。本文详细介绍了细胞分离、培养与腺病毒转导，以及采用膜片钳和碳纤维技术进行的功能实验。...

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离体心脏小梁收缩过程中的明场、荧光与光学相干断层成像同步观察 Ex Vivo

本文介绍了一组通过检测分离大鼠心肌细胞的肌节长度并结合钙离子（Ca2+）瞬变测量来评估收缩功能的实验方案。同时包含了该方法在心力衰竭动物模型研究中的应用。...

啮齿类动物心肌细胞收缩功能障碍与Ca2+瞬变的分析

本方案介绍了如何使用MyoBLAZER系统测量供体心脏来源的成人原代心肌细胞的收缩力。MyoBLAZER是一种可靠的平台，可用于临床前药物研发阶段评估药物诱导的收缩力变化。...

分离的成年成人原代心肌细胞中心肌收缩力的测量

功能位点定向荧光法是一种实时研究蛋白质结构域运动的方法。对该技术进行改良并应用于天然细胞后， now allows the detection and tracking of single voltage-sensor motions from voltage-gated Ca2+...

利用功能性定点荧光测定法在原代细胞中研究骨骼肌兴奋性

了解心肌细胞肌丝钙敏感性评估方法，通过Fura-2 AM荧光探针和相位平面分析技术，研究心脏兴奋收缩耦联机制。该方法可检测高血压等病理状态下心肌收缩功能的变化。

评估心肌兴奋-收缩耦联中肌丝对Ca²⁺的敏感性

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