Name: 设计和适体 - 金纳米粒子基于比色法的开发在这领域的应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: 学习开发基于适体-金纳米粒子的比色检测方法，用于小分子现场快速检测。本研究优化了长期储存方案并显著降低假阳性率，提升检测可靠性与实用性。

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本工作部分由美国空军科学研究办公室和国防研究与工程助理部长办公室（国防生物识别与法证办公室）资助。JES 的参与得到了美国国家研究委员会在空军研究实验室设立的研究员协会奖的支持。

1. 通过柠檬酸盐还原法合成金纳米颗粒（AuNP）及表征
<ol>
	<li>在化学安全通风橱中，使用 5 ml 浓硝酸和 15 ml 浓盐酸清洗一个锥形瓶（500 ml）和一个大型搅拌子。
	<ol>
		<li>用酸洗液润湿锥形瓶的整个内表面，然后用无核酸酶水冲洗锥形瓶，并使其自然干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入 100 ml 的 1 mM 氯金酸（gold(III) chloride）溶液；用铝箔覆盖已酸洗过的锥形瓶口，在加热板上持续搅拌并加热至沸腾。</li>
	<li>加入 10 ml 的 38.8 mM 柠檬酸钠溶液。溶液颜色将在数分钟内由无色/灰色变为深蓝色/黑色，最终变为深红色。停止加热后继续搅拌 10 分钟。</li>
	<li>让金纳米颗粒（AuNP）悬浮液冷却至室温，并在持续搅拌下加入 110 µl 焦碳酸二乙酯（DEPC）。</li>
	<li>用铝箔完全包裹整个锥形瓶，使 DEPC 处理过夜孵育。所有金纳米颗粒均应避光保存，存放于棕色储存容器中或用铝箔包裹。</li>
	<li>对金纳米颗粒悬浮液进行高压灭菌，冷却至室温后，通过孔径为 0.22 µm 的醋酸纤维素膜过滤。将过滤并灭菌后的金纳米颗粒储备液避光保存于 4 °C。 
	注意：采用 DEPC 处理、高压灭菌及 4 °C 避光保存可显著延长适配体-金纳米颗粒（aptamer-AuNP）检测体系的保质期。按此方式保存，该检测体系可在两个多月内保持功能稳定。</li>
	<li>通过测定 520 nm 处的紫外-可见光吸收值计算金纳米颗粒浓度，并结合比尔定律利用消光系数（Ɛ）2.4 × 108 L mol-1 cm-1 计算浓度（c）。经测定，金纳米颗粒浓度为 10 nM，粒径为 15 nm（通过动态光散射法确定）。 
	注意：不同批次制备的金纳米颗粒浓度可能存在差异。根据需要，可用无核酸酶水稀释金纳米颗粒储备液，以维持所需的 10 nM 工作浓度。</li>
</ol>
2. DNA适配体、缓冲液、溶液及检测的制备
<ol>
	<li>使用标准亚磷酰胺化学方法合成或购买以下可结合可卡因的适配体序列22： 
	MN419：5'-GGC GAC AAG GAA AAT CCT TCA ACG AAG TGG GTC GCC-3' 
	MN619：5'-GAC AAG GAA AAT CCT TCA ATG AAG TGG GTC-3'</li>
	<li>采用标准脱盐方法纯化适配体23。将寡核苷酸溶解于无核酸酶水中，配制成100 µM或1 mM的储存液。分装后于-20 °C保存数月。</li>
	<li>购买或配制无菌的1 M 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）pH 7.4、100 mM 氯化镁（MgCl2）和1 M 氯化钠（NaCl）储备液。</li>
	<li>用无核酸酶水配制50 ml缓冲液，其中含20 mM HEPES、2 mM MgCl2，pH 7.4，并于室温下保存数月。</li>
	<li>将DNA与金纳米颗粒（AuNP）储备液（10 nM）在室温下避光孵育3–4小时。根据需要调整AuNP体积，以提供足够用于检测的样品量（2.5–7.5 ml）。
	<ol>
		<li>本研究中使用的DNA装载密度分别为90、120、150和180个DNA分子/ AuNP。相应调整DNA的体积和浓度。调节DNA覆盖度以减少非目标分析物引起的AuNP表面非特异性颜色响应。 
		注意：增加DNA覆盖度会降低检测灵敏度。装载密度的计算基于已知的AuNP储备液浓度，并计算实验所需体积中AuNP的总数。若需获得实际覆盖密度，已有相关方案可获取该数值7。通过使用50 kDa分子量截断的离心柱将结合在AuNP上的DNA与游离DNA分离来确定DNA覆盖度。AuNP体积过大无法通过离心柱，而游离DNA可顺利通过。下一步是利用吸光度测量或单链DNA荧光染料对收集到的游离DNA进行定量。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入等体积的20 mM HEPES、2 mM MgCl2、pH 7.4缓冲液，将样品置于4 °C避光过夜。适配体-AuNP检测体系所用缓冲液为10 mM HEPES、1 mM MgCl2、pH 7.4（检测缓冲液）。</li>
</ol>
3. 盐滴定与实验设置
<ol>
	<li>通过使用检测空白样进行盐滴定，确定诱导检测显色反应所需的初始盐浓度。在96孔板中，将20 µl甲醇（空白）加入180 µl等分的适配体-金纳米粒子（aptamer-AuNP）检测液中。用逐渐增加体积的储存NaCl溶液（1 M或2 M）对样品进行滴定，并确定等当点（图2）。 
	注意：可通过保持甲醇空白（或溶解的分析物）与适配体-AuNP检测液的比例不变，将该检测体系缩小至更小体积。
	<ol>
		<li>此处通过肉眼观察确定引起最轻微颜色变化所需的NaCl体积。在60个DNA分子/AuNP的覆盖密度下，MN4和MN6的检测起始浓度分别为75 mM和130 mM。 
		注意：为定量确定初始盐浓度，滴定曲线的中点可作为良好的起始点。此外，所用浓度会因适配体种类、DNA覆盖密度、不同日期的实验性能以及不同批次而有所变化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为优化检测响应，在室温下将20 µl溶于甲醇的分析物分子加入96孔板中180 µl等分的适配体-AuNP检测液中。立即加入上一步确定的NaCl浓度，以启动检测的显色反应。 
	注意：建议使用多通道移液器同时进行多个实验。</li>
	<li>通过调整NaCl浓度（增加或减少），比较目标响应与空白响应，获得尽可能大的颜色变化。选择能产生最大响应差异的NaCl浓度。</li>
	<li>在加入NaCl后150秒时观察或测量检测响应。使用分光光度计测定650 nm和530 nm处的吸光度，或拍摄检测响应的数码照片（照片分析方案见第4节）。 
	注意：本研究中的测量数据采用微孔板读数仪获得。</li>
	<li>将结果绘制成650 nm与530 nm处吸光度比值（E650/E530）随分析物浓度变化的曲线。将检测响应相对于空白信号进行归一化处理，如同本研究中所采用的方法。</li>
</ol>
4. 照片与数字图像颜色分析方案分析
<ol>
	<li>按照所述方法制备检测样品（第3.2–3.3节）。将96孔板置于透射式光源上。 
	注意：标准实验室用透射光源通常过亮，难以获得适用于本分析的可用数字图像。此类光源因强度过高，会在数字图像中产生规律分布的“暗线”。使用基于发光二极管（LED）的光源箱并配合一块不透明塑料板，可获得良好效果。</li>
	<li>在加入NaCl后150秒时拍摄96孔板的照片，将图像导入图像分析软件，并采用增量平均法计算平均红、绿、蓝（RGB）值，如公式124所示： 
	(1) <img alt="运行平均公式，AVE_N = AVE_N-1 + (Pixel_N - AVE_N-1) / N，用于数据分析。" src="/files/ftp_upload/54063/54063eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"></li>
	<li>使用以下公式24将RGB值从标准RGB（sRGB）色彩空间转换至色度图（CIExyY）色彩空间： 
	(2) <img alt="线性变换方程；数学公式；关于数据线性化的教学内容。" src="/files/ftp_upload/54063/54063eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 2"> 
	(3) <img alt="色彩空间转换矩阵，XYZ到线性RGB，矩阵方程。" src="/files/ftp_upload/54063/54063eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 3"> 
	(4) <img alt="比例方程；x=X/(X+Y+Z)，y=Y/(X+Y+Z)；用于概率分布的方程。" src="/files/ftp_upload/54063/54063eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 4"></li>
	<li>使用公式2将指数形式的RGB值转换为线性RGB值。使用公式3中指定的矩阵计算CIE色彩空间中的X、Y和Z值24。</li>
	<li>使用公式4计算x和y色度值，以表示所选分析区域内像素的平均颜色24。</li>
	<li>对每个孔进行分析，并绘制色度值以生成校准曲线（图4）。通过分析同一孔内不同区域的颜色来获得标准误差。</li>
</ol>
5. 用于长期保存的适配体-金纳米颗粒冻存检测法
<ol>
	<li>按照第 2.4 和 2.5 节所述准备适配体-AuNP 检测组分。在无核酸酶水中分别配制含有 1 g/ml 海藻糖和 1 g/ml 蔗糖的溶液，以制备冷冻保护液。 
	注意：使用高浓度的海藻糖和蔗糖是为了在制备冻存检测体系时减少稀释倍数。使用前将糖溶液置于烧杯中的水浴上加热，以充分溶解糖类。</li>
	<li>在 1.5 ml 微离心管中，将 60 MN4-DNA/AuNP 检测体系与终浓度为 19.2 mg/ml 海藻糖和 4.8 mg/ml 蔗糖的溶液混合，终体积为 200 µl。最终冷冻保护液的浓度会因 DNA 覆盖率不同而有所变化。 
	注意：待冻存样品体积不应超过 300 µl。体积过大可能导致样品无法充分冻结。</li>
	<li>使用 -146 °C 超低温冰箱或液氮对样品进行速冻。样品应保持冷冻状态储存直至使用。速冻完成后，可将样品转移至 -80 °C 或 -20 °C 冰箱中长期保存。</li>
	<li>本研究中，将样品在 -146 °C 冰箱中过夜冷冻，随后转移至 -20 °C 冰箱进行长期储存。 
	注意：速冻过程可能导致适配体-AuNP 发生聚集。通过监测吸光度谱图并与未冻存样品进行比较，以评估冻存过程的完整性。若观察到聚集现象，可增加冷冻保护液的用量以弥补此问题。</li>
	<li>在室温下解冻样品，并仅取实验所需量使用。获取解冻后样品的吸光度光谱，并与未经冻存处理的冷冻保护液对照样品的基线光谱进行比较。测定 400 nm 至 700 nm 范围内的吸光度。</li>
	<li>按照前述方法进行盐梯度滴定（第 3.1 节）、检测体系测试（第 3.2 节）以及结果绘图（第 3.3 和 3.4 节）。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

在过去十年中，基于纳米颗粒的比色检测技术已被开发用于检测小分子、DNA、蛋白质和细胞等目标物2-4。其中，结合DNA适配体与纳米颗粒的检测方法正受到越来越多关注。通常，这类比色检测是先将DNA适配体与待测分析物分子混合，然后再加入金纳米颗粒（AuNPs）中9-10。然而，这些检测方法目前主要局限于概念验证性研究，且多在受控的实验室条件下进行，所用对照有限。近年来，已有研究推动该技术向实际应用转化7。在本方法中，DNA适配体在加入待测分析物分子之前，即被预先吸附到AuNP表面（图1）。无论是哪一种基于适配体–金纳米颗粒的比色检测，其开发过程均需在制备和分析的各个阶段进行优化。因此，初涉该领域的研究人员必须充分了解优化和排除此类检测中各类技术细节的关键要点，以确保实验成功。
吸附型适配体-金纳米颗粒检测方法需要针对每一对适配体/靶标进行仔细优化。然而，按照本文所述步骤操作，可为这类比色检测的优化提供一致的实验方案。其中最关键的优化步骤之一是确定并调整盐浓度，以获得靶标组与检测空白组之间最...

比色法是分析化学中使用最古老的技术之一。该技术基于生成有色化合物，对分析物进行定性或定量测定1。通常，比色分析使用在分析物存在时发生颜色变化的试剂，从而在可见光谱范围内产生可观察或可检测的颜色变化。比色法已被用于检测从原子、离子和小分子到脱氧核糖核酸（DNA）、肽和蛋白质等复杂生物大分子等多种目标物2-4。在过去的二十年中，纳米材料彻底改变了检测分析领域，尤其是基于颜色的分析方法5-6。将纳米材料独特的化学和物理性质与靶标选择性识别元件（如抗体、寡核苷酸适配体或肽适配体）相结合，推动了比色检测分析方法设计与开发的复兴7。
金属纳米颗粒具有明显的尺寸依赖性颜色变化特性，该特性已被应用于多种比色分析方法的设计中。金纳米颗粒（AuNPs）尤其受到关注，因为当分散的颗粒溶液发生聚集时，溶液会呈现出独特的由红到蓝的颜色转变8，这种聚集通常通过精确加入盐来诱导。通过调控颗粒从分散态（红色）向聚集态（蓝色）的转变，已开发出针对离子、小分子、肽、蛋白质及细胞等目标物的比色传感器2-4,9。这些传感器中的许多都采用适配体作为目标识别元件。
适配体是从包含1012-1015种不同序列的随机文库中筛选出的DNA或核糖核酸（RNA）分子10-11。筛选过程可鉴定出具有低纳摩尔亲和力的靶标识别元件，其中最广为人知的方法是指数富集配体系统进化技术（SELEX）12-13。寡核苷酸类适配体在传感应用中的优势包括易于合成、可调控的化学修饰性以及良好的化学稳定性14-15。
一种构建比色分析方法的策略是将纳米材料与识别元件相结合，具体是通过DNA适配体分子在金纳米颗粒（AuNP）表面的物理吸附来实现这两种组分的结合。当适配体与目标物结合后，适配体会发生构象变化16-18，从而改变适配体与AuNP表面的相互作用，进而在加入盐后引发溶液颜色由红变蓝的可诱导性响应19。AuNPs这一显著特性为基于适配体的检测装置提供了一种可观测的比色响应机制，可用于设计针对不同分析物的比色分析方法。
基于非共价、物理吸附在金纳米颗粒（AuNP）表面的DNA适配体设计的比色检测方法，由于存在稳定性差、在受控实验室环境之外容易失效，以及缺乏可用于实际应用的信息等问题，常被认为是一种较弱的传感平台。然而，适配体-AuNP比色检测法因其操作简便且具有可观察的颜色响应而受到关注。本研究旨在提供一套完整的操作流程，用于以可卡因为代表性分析物的DNA-AuNP比色检测方法的设计、开发、操作、降低表面相关假阳性响应以及长期储存。此外，我们提出这种吸附型适配体检测策略（图1）具有操作简单、使用方便的优势，相比传统适配体-AuNP检测方法步骤更少。在该检测中，首先将适配体加入AuNPs溶液中，并使其长时间吸附于纳米颗粒表面。该策略的另一优势在于降低了因AuNP表面相互作用引起的对非目标分析物分子的响应。然而，这种假阳性响应的降低是以牺牲检测灵敏度为代价的。因此，必须在表面保护与分析物可及性之间取得平衡，以维持检测的正常功能。此外，通过非仪器手段分析比色结果的主要缺陷在于，结果往往具有主观性，不同分析人员之间可能存在解读差异，尤其是在需要区分细微颜色变化时尤为明显。相反，将实验室仪器用于非实验室环境也面临诸多问题，例如电源供应、便携性实用性等等等。在本研究中，我们开发了一套颜色分析流程，以提高便携性，并减少比色检测结果解释过程中常见的主观判断20-21。与以往方法相比，本研究致力于将此类检测方法推向极限，拓展其在实验室以外场景中的应用潜力。

<table><tbody><tr><td>三氯化金水合物</td><td>Sigma</td><td>254169</td><td>纯度达99.999%至关重要，且溶液需每次新鲜配制</td></tr><tr><td>柠檬酸钠二水合物</td><td>Sigma</td><td>W302600-1KG-K</td><td>我们发现生产厂家对金纳米颗粒（AuNP）检测结果影响显著，且溶液需每次新鲜配制</td></tr><tr><td>Synergy</td><td>Bio-TEK</td><td>HT</td><td>任何吸光度光谱仪均可使用，但酶标仪可实现多样品同步分析</td></tr><tr><td>4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸（HEPES）缓冲液，1&amp;nbsp;M，已灭菌</td><td>Amresco</td><td>J848</td><td>任何已灭菌品牌均可使用</td></tr><tr><td>Corning，250 ml 过滤系统，0.22&amp;nbsp;&amp;micro;m 醋酸纤维素膜</td><td>Fisher</td><td>430767</td><td>已发现其他膜材料会去除金纳米颗粒（AuNPs）</td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>Varian</td><td>Cary 300&amp;nbsp;</td><td>任何吸光度光谱仪均可使用</td></tr><tr><td>氯化镁六水合物</td><td>Fluka</td><td>63068</td><td>&amp;ge;98%，任何品牌均可使用</td></tr><tr><td>DNA</td><td>IDT</td><td>定制</td><td>DNA通过脱盐柱纯化，也可采用更高纯度的纯化技术</td></tr><tr><td>盐酸普鲁卡因</td><td>ACROS</td><td>AC20731-1000</td><td>以甲醇配制1 mg/ml的储备液，纯度99%</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Fisher</td><td>A144S-500</td><td>36.5–38.0% w/w，其他品牌亦可使用</td></tr><tr><td>盐酸可卡因</td><td>Lipomed</td><td>COC-156-HC-1LM</td><td>我们发现生产厂家对金纳米颗粒（AuNP）检测结果影响显著</td></tr><tr><td>硝酸</td><td>Fisher</td><td>A509-SK212</td><td>65% w/w，其他品牌亦可使用</td></tr><tr><td>氯化钠溶液，5 M，生物试剂级</td><td>Sigma</td><td>S5150-1L</td><td>使用固体自行配制的无菌溶液亦可使用</td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯</td><td>Sigma</td><td>D5758-25 mL</td><td>&amp;ge;97%，任何品牌均可使用</td></tr><tr><td>甲基麻黄碱盐酸盐</td><td>Lipomed</td><td>COC-205-HC-1LM</td><td>我们从与可卡因检测物相同的厂家获得EME对照品</td></tr><tr><td>微量离心管，Axygen Scientific，非无菌，1.7&amp;nbsp;ml</td><td>VWR</td><td>10011-722</td><td>我们发现生产厂家对金纳米颗粒（AuNP）检测结果影响显著，且离心管需在实验室自行高压灭菌</td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

基于适配体-金纳米粒子比色法检测技术的设计与开发及其在野外现场的应用

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

本文研究了一种用于现场检测小分子的适体-金纳米颗粒（AuNP）比色分析方法的设计与开发。基于金纳米颗粒的靶标选择性比色检测方法已在受控的概念验证实验室环境中得到开发。然而，这些方案尚未经历极限条件下的失效测试，以评估其在实验室以外实际应用中的可行性。本研究描述了一种通用的方法，用于设计、开发和优化针对小分子分析物的适体-AuNP比色检测体系，并将其应用于现场检测场景。该检测方法的优势在于，吸附的适体能够钝化纳米颗粒表面，从而有效减少甚至消除对非靶标分析物的假阳性响应。为了将该系统转化为实际应用，不仅需要明确适体-AuNP检测体系的保存期限，还需建立延长其长期储存能力的方法与操作流程。此外，比色读数的一个公认问题是，分析人员需准确识别通常较为细微的颜色变化，这带来了较大的判断负担。为减轻现场分析人员的责任，本研究设计了一套颜色分析流程，可在无需使用实验室级别设备的情况下完成颜色识别任务，并详细描述了该数据分析流程的建立与验证方法。然而，为了深入理解并优化吸附型适体检测体系的设计，还需进一步研究适体、靶标分子与AuNPs之间的相互作用。这些研究获得的知识有望用于定制化改造适体，以提升其功能性能。

本研究的主要目标是开发并考察基于适体的金纳米粒子比色法检测技术的稳定性和鲁棒性，以用于现场检测。正如先前发表的研究中所指出的，已探索了两种不同的方法来构建该检测体系7。这两种检测方法分别被称为游离适体检测法和吸附适体检测法。其中，吸附适体检测法在适用于现场检测方面更具优势（图1）。
<img alt="基于金纳米颗粒（AuNP）适配体的可卡因检测示意图，对比非目标分析物。" src="/files/ftp_upload/54063/54063fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. 吸附型适配体检测法的示意图。 将适配体与AuNPs混合并过夜孵育；将溶于甲醇中的分析物分子加入吸附型适配体检测体系中，随后立即加入氯化钠（NaCl），以在目标物存在时诱导AuNPs聚集。<a href="https://www...

研究了用于现场检测小分子的适体-金纳米粒子比色法的设计与开发。此外，验证了一种基于智能设备的比色应用程序（app），并建立了该检测方法的长期储存条件，以满足现场使用需求。

适体-金纳米颗粒（AuNP）比色法检测小分子的设计与开发及其在野外现场的应用

总体目标是提供一种基于适体-金纳米粒子比色法检测目标分子的通用开发方法，并提供提高长期储存稳定性和降低假阳性反应率的策略。该方法解决了金纳米粒子适体比色检测领域中的关键问题，例如检测方法在长期储存条件下的可重复性以及假阳性反应率的降低。这些检测方法容易出现保质期短和假阳性反应等问题。在本研究中，我们对上述两个问题均进行了改进。在化学安全通风橱中，使用5毫升浓硝酸和15毫升浓盐酸清洗一个500毫升的锥形瓶和一个大磁力搅拌子。用酸洗液润湿锥形瓶的整个内表面。然后用无核酸酶的水冲洗烧瓶，并让烧瓶自然干燥。加入100毫升1毫摩尔的三氯化金溶液。用一张铝箔纸覆盖经酸处理过的锥形瓶瓶口，置于加热板上持续搅拌并加热至沸腾。接下来，加入10毫升38.8毫摩尔的柠檬酸钠。颜色将在数分钟内从无色或灰色变为深蓝色或黑色，最终变为深红色。停止加热后继续搅拌10分钟。让金纳米颗粒悬浮液冷却至室温，然后在持续搅拌下加入110微升DEPC。用铝箔完全包裹整个烧瓶，并让DEPC处理过夜孵育。第二天，对金纳米颗粒悬浮液进行高压灭菌。然后冷却至室温，并通过孔径为0.22微米的醋酸纤维素膜过滤。将过滤并经高压灭菌的金纳米颗粒储备液避光保存于4°C。按照文本方案中所述方法计算金纳米颗粒的浓度。此处通过动态光散射测定，计算得到浓度为10纳摩尔，粒径为15纳米。采用标准亚磷酰胺化学法购买或合成可结合可卡因的适配体序列。使用标准脱盐方法纯化适配体后，将寡核苷酸溶解于无核酸酶的水中，配制成100微摩尔或1毫摩尔的储存溶液。分装的纯化适配体可在20摄氏度下保存数月。将DNA与10纳摩尔的储备金纳米颗粒溶液混合，根据需要调整金纳米颗粒的体积，以提供足够的样品用于检测。室温避光孵育混合物3至4小时。加入等体积的 20 毫摩尔 HEPES、2 毫摩尔氯化镁、pH 7.4 的缓冲液，将样品置于 4 摄氏度避光过夜。通过盐滴定法诱导检测显色反应所需的初始盐浓度由检测空白样确定。在 96 孔板中，向 180 微升的适配体-氯金酸检测样品分装液中加入 20 微升甲醇。进行这些检测时的一个关键步骤是确定氯化钠浓度，以便在加入目标物后使金纳米颗粒失稳。用逐渐增加体积的氯化钠储备溶液对样品进行滴定，并确定其等当点。此处通过肉眼观察，确定引起最轻微颜色变化所需的氯化钠体积。为优化检测响应，将20微升溶于甲醇中的分析物分子加入96孔板中180微升的适体-金纳米粒子检测试剂等分试样中，在室温下进行反应。立即加入上一步确定的氯化钠浓度，以启动检测的颜色响应。通过调整氯化钠浓度并比较目标响应与空白响应，获得尽可能大的颜色变化。使用能够产生最大响应差异的氯化钠浓度。在加入氯化钠后150秒观察或测量检测反应。使用分光光度计在650纳米和530纳米处分析吸光度。以650纳米和530纳米处测得的吸光度比值对分析物浓度作图。将检测响应信号相对于空白信号进行归一化处理。按照视频前面所述方法制备适体-金纳米颗粒检测的组分。分别配制含有1克/毫升海藻糖和1克/毫升蔗糖的溶液，使用无核酸酶水制备冷冻保护液。因此，冷冻这些检测样品的关键步骤是确定需向样品中添加多少海藻糖和蔗糖溶液，以确保完全且均匀的冷冻。将60 MN4 DNA每金纳米颗粒检测体系配制成终体积为200微升的溶液，其中含有19.2毫克/毫升海藻糖和4.8毫克/毫升蔗糖，置于1.5毫升微量离心管中。最终冷冻保护剂溶液的浓度需根据DNA覆盖度进行调整。使用-146摄氏度的超低温冰箱或液氮对样品进行速冻。将样品冷冻保存至使用前。本实验中，将样品置于 146 摄氏度冰箱中过夜，随后转移至 20 摄氏度冰箱进行长期保存。图中显示的是未经处理与经 DNA 适配体处理的金纳米颗粒的氯化钠滴定曲线的代表性结果。实验中所用的初始氯化钠浓度通过滴定法确定。此处展示了适配体-金纳米粒子比色法检测可卡因及对照分子的代表性结果。图表揭示了DNA覆盖密度的增加对可卡因检测假阳性反应率的影响。图中所示为通过比色法照片图像分析获得的可卡因检测校准曲线图。使用智能手机拍摄的照片。此处展示了适配体-金纳米粒子比色法对可卡因及对照分子的检测反应的代表性结果。数据比较了新鲜制备的样品与冷冻保存长达四周的样品。在进行该实验操作时，确定适当的氯化钠浓度以破坏金纳米颗粒的稳定性，并在加入目标物后引发典型的颜色变化，这一点至关重要。因此，在观看本视频后，您应能够充分理解如何开发基于金纳米颗粒适体的比色法检测体系，用于检测目标物质。您可以采用此处所述的方法来降低假阳性反应率，并确保您的检测体系在一个月以上的时间内保持有效。

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