Rapid Verification of Terminators Using the pGR-Blue Plasmid and Golden Gate Assembly

合成生物学方案的总体目标是在利用 Golden gate 组装的体外系统中快速确定终止子功能并量化终止子强度。该协议用于测试我们使用生物信息学在计算机中发现的终止子，并在生物环境中对其进行测试。这允许在实验室工作台设置中快速简单地确认生物信息学鉴定的终止子。

该协议的主要优点是它的速度。我们可以在不到一周的时间内从生物信息学鉴定到生物学确认。在此过程中，我们还可以验证终止符实际上是终止符，并且可以量化其终止强度。

通常，个人最初会对这种技术感到困难，因为在同一管中添加带有连接酶的限制性内切酶听起来有悖常理。然而，我们使用 2S 型限制性核酸内切酶，并且酶的识别位点与实际切割位点是分开的。一旦终止子连接到 pGR 蓝色质粒中，这就是永久连接。

然而，通过将限制性内切酶和连接酶放在同一管中，经过多个循环，我们可以实现高关闭效率。通过将单个寡核苷酸重新悬浮在浓度为 100 微摩尔的无核酸酶水中来开始此过程，然后制备 10x 退火缓冲液。接下来，为每个要测试的终止子标记 1.5 毫升微量离心管。

向每个试管中加入 16 微升超纯水、2 微升 10x 退火缓冲液以及来自所需终止子的顶部和底部链寡核苷酸各 1 微升。确保您订购的寡核苷酸具有正确的粘性末端非常重要。因为一旦它们一起退火，确保端接器处于正确的方向就很重要。

如果终止符的方向错误，pGR 蓝色将无法验证它是否是正常工作的终止符。接下来，将微量离心管放入浮子中，在水浴中煮沸 4 分钟。四分钟后，关闭加热板，但将管子在水中放置过夜以缓慢冷却。

将退火的终止器储存在 20 摄氏度。要对退火的终止剂进行 40 纳摩尔稀释，首先在冰上解冻，然后在新的 1.5 毫升微量离心管中，向 1 微升退火终止剂中加入 124 微升无核酸酶的水。将样品以 10， 000x g 离心 30 秒。

旋转后，将样品储存在冰上。在适合热循环仪的新试管中，加入 6 微升无核酸酶水。然后加入 1 μL 市售 DNA 连接酶缓冲液。

在 ice 上执行所有后续步骤。接下来，加入 1 微升，每微升含有 35 至 50 ng 的 pGR 蓝色目标质粒、1 微升的 40 纳摩尔退火终止子、0.5 微升商业高保真 BSA1 限制性核酸内切酶和 0.5 微升商业 DNA 连接酶。将反应混合物以 10， 000x g 离心 120 秒。

然后将试管直接放入热循环仪中并运行以下程序。20 个循环，每个循环 1 分钟，在 37 摄氏度下，然后 1 分钟在 16 摄氏度下，然后一个循环，每次 15 分钟，在 37 摄氏度下。运行后，将样品冷冻并储存在 20 摄氏度，或立即进行转化。

使用任何适当的转化方案将连接反应物转化到化学感受态大肠杆菌细胞中。在这里，使用 zippy 转换转换 JM109 细胞。

使用 L 形玻璃曲棍球棒，将 25 微升转化的细胞涂在含有 1 毫摩尔氨苄青霉素和 10 毫摩尔阿拉伯糖的预热 LB 琼脂平板上。将板在 37 摄氏度下孵育过夜。不要将它们孵育超过 24 小时。

氨苄青霉素降解迅速。第二天，检查菌落的颜色。成功的连接在可见光下应该是白色或黄色的，在蓝光或紫外光下会发出绿色荧光。

不成功的连接将产生在可见光下呈蓝色的菌落。对于每个终止剂和对照，准备一个含有 5 毫升无菌 LB 肉汤、1 毫摩尔氨苄青霉素和 10 毫摩尔阿拉伯糖的试管。在执行此协议时，使用 pGR 时，确保适当的控制措施到位非常重要。

第一个对照应该只是 LB 肉汤。下一个对照应该是对氨苄青霉素有抗性的细胞，但在蓝光下不发出荧光。这些将用作空白。

下一个对照是未切割的 pGR 质粒，因此它没有终止子，这将作为终止子强度的基线，最后一个试管将用于您的样品。在可见光下，使用无菌定量环挑选 2 到 3 个白色或黄色菌落，然后将它们转移到 LB 肉汤中。让样品在 37 摄氏度下以 160 rpm 的转速在摇床上孵育 16 至 18 小时。

第二天，使用分光光度计测定每个样品在 600 纳米处的光细胞密度。通常，在此时间之后，OD 600 预计为 0.8 至 1.0。将无菌 96 孔板放入通风橱中。

对于每个样品或对照，用 199 微升含氨苄青霉素和阿拉伯糖的无菌 LB 肉汤制备 3 个孔。接下来，从过夜肉汤中吸取 1 微升细胞溶液到 96 孔板的各个孔中。用透气的盖子装满板子，然后在 18 摄氏度和 20 rpm 下摇晃 37 到 160 小时。

第二天，使用读板器确定 OD 600，应约为 0.5。此外，在 395 纳米的激发波长和 509 纳米的发射波长下测量 P 荧光的 G。在 575 纳米的激发波长和 605 纳米的发射波长下测量 RFP 荧光。

使用 Excel，通过将荧光除以 OD 600 来标准化生长变化。归一化后，通过将 GFP 终止子荧光除以 RFP 终止子荧光超过 RFP 对照荧光来确定相对终止子强度。如本视频所述，分析了在微细菌噬菌体 bernal 13 中生物信息学鉴定的固定推定终止子 T1 到 6。

这些结果显示相对荧光。使用含有未切割、未修饰的 PGR 的细胞作为对照对所有结果进行归一化。发现 T3 是一种强终止子。

所有结果均表示一式三份生长的单个菌落，并取平均值以进行视觉表示。误差线表示平均数据点之间的偏差。为了确定定量终止子强度的最佳参考对照，比较了使用不含终止子的原始 pGR 质粒的原始数据，以及使用已知不是终止子的序列克隆的 pGR 蓝色。

从这里可以看出，两个对照显示出相似水平的 GFP 和 RFP 表达，更重要的是，产生了相似的 GFP 与 RFP 比率。所有这些结果都代表了一式三份生长的单个菌落，并进行了视觉表示的平均值。掌握后，这项技术可能只需要 72 小时，包括运输和订购时间。

需要注意的是，pGR blue 仅在大肠杆菌中起作用。此外，由于我们只研究了终止子的一小部分，我们真的不知道其他可能控制转录的调节元件。为了验证使用 pGR blue 的实验步骤获得的结果，可以使用其他方法，例如定量 PCR。

此外，可以切下 pGR 插入片段并连接到您选择的质粒中。