Name: 终结者使用PGR-蓝质粒和金门议会的快速验证 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: 了解如何使用金门组装法快速验证生物信息学预测的终止子功能并量化其强度。该方法利用PGR-蓝质粒系统在一周内完成从计算识别到实验确认的完整流程。

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作者谨此感谢基因组教学活动联盟（Genome Consortium for Active Teaching，GCAT）的Malcom Campbell和Todd Eckdahl，以及霍华德·休斯医学研究所科学教育联盟噬菌体猎手推进基因组学与进化科学项目（HHMI-Science Education Alliance - Phage Hunters Advancing Genomics and Evolutionary Science，SEA-PHAGES）的支持。
本项目获得了美国国立卫生研究院下属的国家研究资源中心（P20RR016460）和国家普通医学科学研究所（P20GM103429）的资助。本研究部分得到了美国国家科学基金会（资助号：IIA-1457888）的支持。此外，奥克城浸信会大学（Ouachita Baptist University）通过J.D. 帕特森暑期研究奖学金提供了机构资金支持。

1. 设计并订购具有合适黏性末端的寡核苷酸
<ol>
	<li>通过使用网上免费提供的程序进行基因组分析，鉴定潜在的ρ-非依赖性终止子。7</li>
	<li>处理双链DNA时，确定待测终止子的方向。7 pGR-Blue质粒仅能验证在顶部链（正向链）上以5'至3'方向连接的终止子。
	<ol>
		<li>对于底部链（反向链）的终止子，可使用免费的在线软件（例如，ApE）将其转换为其反向互补序列，以重新定向该序列，使其适用于pGR-Blue中的检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定方向正确后，在顶部链的5'端添加黏性末端“5'-CGAC-3'”，在底部链的5'端添加黏性末端“5'-CCGC-3'”。8 这将确保通过GGA方法连接的插入片段能以正确的方向插入。</li>
	<li>确定序列后，可作为单链寡核苷酸向商业公司订购。</li>
</ol>
2. 寡核苷酸退火（仅适用于冻干 DNA）
<ol>
	<li>用无核酸酶水将单个寡核苷酸重悬，使其浓度达到 100 µM。</li>
	<li>配制 10× 退火缓冲液：1 M NaCl 和 100 mM Tris-HCl（pH 7.4）。退火缓冲液可在 4 °C 下保存数周。退火缓冲液配制完成后，并完成寡核苷酸重悬后，即可开始退火8。</li>
	<li>针对每个待测试的终止子，向一个 1.5 ml 微离心管中加入 16 µl 超纯水。</li>
	<li>向每个微离心管中加入 2 µl 10× 退火缓冲液。</li>
	<li>加入 1 µl 目标终止子的上游链寡核苷酸（100 µM）。</li>
	<li>加入 1 µl 目标终止子的下游链寡核苷酸（100 µM）。</li>
	<li>使用一个盛有约 400 ml 自来水的 1,000 ml 烧杯制备沸水浴，并将其置于加热板上。</li>
	<li>将步骤 2.6 中的微离心管放入浮漂中，煮沸 4 分钟。4 分钟后关闭加热板，但将浮漂和管子保留在水浴中，缓慢冷却过夜（18 小时）8。将退火完成的终止子储存于 -20 °C。</li>
</ol>
3. 黄金门组装（标准混合体系——经济高效）
<ol>
	<li>制备退火终止子的 40 nM 稀释液。向 1 µl 退火终止子混合物（100 µM）中加入 124 µl 无核酸酶水。
	<ol>
		<li>将样品在 10,000 × g 条件下离心 30 秒，并置于冰上保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>取一个适用于所用热循环仪的新离心管，加入 6 µl 无核酸酶水。</li>
	<li>加入 1 µl 商业 DNA 连接酶缓冲液 [300 mM Tris-HCl (pH 7.7–7.8), 100 mM MgCl2, 100 mM DTT 和 10 mM ATP]。后续所有步骤均在冰上操作。</li>
	<li>向微量离心管中加入 1 µl pGR-Blue（35–50 ng/µl）目的质粒。</li>
	<li>向微量离心管中加入 1 µl 40 nM 的退火终止子。</li>
	<li>向微量离心管中加入 0.5 µl 商业高保真 BsaI 限制性内切酶。</li>
	<li>向微量离心管中加入 0.5 µl 商业 DNA 连接酶。</li>
	<li>将反应混合物在 10,000 × g 条件下离心 120 秒，然后直接将离心管放入热循环仪中。</li>
	<li>运行热循环程序：37 °C 孵育 1 分钟，随后 16 °C 孵育 1 分钟，重复 20 个循环；接着在 37 °C 孵育 15 分钟，进行 1 个循环。样品应立即使用，或冻存于 -20 °C 保存。8</li>
</ol>
4. 金门组装（商用预混液 — 节省时间）
<ol>
	<li>添加 124 µl 加入无核酸酶水至 1 µl 的 100 µM 在步骤2中制备的退火终止子。将终止子DNA浓度稀释至40 nM。此步骤需在新标记的1.5 ml微量离心管中进行。</li>
	<li>将适量样品加入适合PCR仪使用的新离心管中 14 µl 加入无核酸酶水。确保新试管已正确标记。</li>
	<li>添加 2 µl 将商用预混缓冲液加入微量离心管中。</li>
	<li>添加 1 µl pGR-蓝色质粒（35-50 ng/µl) 加入微量离心管中。</li>
	<li>添加 2 µl 将40 nM退火终止子加入微量离心管中。</li>
	<li>添加 1 µl 将商业预混液加入微量离心管中。</li>
	<li>以 10,000 × g 离心 40 nM 样品管 120 秒。随后将该管直接放入热循环仪中。</li>
	<li>运行热循环程序：60 分钟，1 个循环，温度为 37 °C 随后进行1个循环，15分钟，72°C 55 °C立即使用样品，或冷冻保存于 -20 °C.</li>
</ol>
5. 转化与菌落筛选
<ol>
	<li>制备含有1 mM氨苄青霉素（Amp）和10 mM阿拉伯糖（arb）的Luria肉汤（LB）琼脂培养皿。至少准备10 ml的1 M L-arabinose 储备液，因为后续步骤中将使用该储备液。</li>
	<li>使用任何高效（108 - 109 转化子/µg 化学感受态 E. coli 用于转化的JM109细胞9 为获得最佳结果，添加 3-5 µl 连接反应的 50 µl 感受态细胞的使用。当使用化学感受态游戏副本时，应遵循针对所用细胞类型的具体转化方案。</li>
	<li>铺开一半（25 µl) 用无菌的L形“涂布棒”将转化后的细胞涂布于预热的LB（Amp/arb）琼脂平板上，37°C过夜培养 37 °C由于氨苄青霉素降解速度较快，切勿在以下条件下孵育： 37 °C 超过24小时。</li>
	<li>根据颜色通过肉眼观察进行菌落筛选。成功的连接产物在可见光下呈白色或黄色，并在蓝光（450 nm）或紫外光下发出绿色荧光；连接不成功则在可见光下于18–20小时后形成蓝色菌落。</li>
</ol>
6. 终止子的验证与定量
<ol>
	<li>准备含有 1 mM 氨苄青霉素和 10 mM 阿拉伯糖的 5 ml 无菌 LB 液体培养基试管。所需试管数量取决于待测试终止子的数量，另需包括对照组（仅含氨苄青霉素抗性但不表达荧光的细胞，以及含有未切割 pGR-Blue 质粒的细胞）。</li>
	<li>在可见光下，使用无菌接种环挑取 2–3 个白色/黄色菌落（见步骤 5.4）。将样品置于摇床中，在 37 °C、160 rpm 条件下培养 16–18 小时。培养时间不得超过 24 小时。
	<ol>
		<li>可选：使用分光光度计测定 600 nm 处的细胞光密度（OD600），以确认细胞生长充分。通常在培养 16–18 小时后，OD600 值约为 0.8–1.0。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>剩余步骤使用无菌 96 孔板进行。所有操作均需在无菌环境中完成，并设三个重复。向每孔加入 199 µl 无菌 LB + Amp/阿拉伯糖培养基（含 1 mM 氨苄青霉素 / 10 mM 阿拉伯糖）。板上需预留三个独立对照孔的位置。
	<ol>
		<li>使用以下三种对照：一个孔（1）仅含 LB + Amp/阿拉伯糖培养基，另一个孔（2）加入未转化的感受态细胞（空白对照），作为背景空白；为定量分析终止子强度（3），应包括含有未切割原始 pGR 质粒或与非终止序列连接的 pGR-Blue 质粒的细胞（作为定量参考对照）。参见 图 1 中的酶标仪板布局。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用移液器将 1 µl 过夜培养物中的菌液分别加入 96 孔板的各个孔中。</li>
	<li>用透气封板膜密封 96 孔板，并在 37 °C、160 rpm 条件下振荡培养 18–20 小时。</li>
	<li>使用酶标仪测定 600 nm 处的吸光度以获得 OD600 值。GFP 荧光测定条件如下：激发波长 395，发射波长 509；RFP 荧光测定条件如下：激发波长 575，发射波长 605。培养 18–20 小时后，OD600 值应约为 0.5。</li>
	<li>为校正细胞生长差异，使用以下公式对 GFP 和 RFP 荧光值进行归一化处理：<img alt="荧光强度/光密度（OD600）公式；微生物数据分析；实验方程。" src="/files/ftp_upload/54064/54064eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 1"></li>
	<li>归一化后，使用以下公式计算相对终止子强度：<img alt="基因表达比值公式；GFP 与 RFP 合成平衡；分子生物学研究中的方程。" src="/files/ftp_upload/54064/54064eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 2"></li>
</ol>

<ol><li>Li, J., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+promoter+sequence+and+its+strength+in+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Phys+J+E+Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Relationship between promoter sequence and its strength in gene expression.</a> Eur Phys J E Soft Matter. 37 (9), (2014).</li>
<li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PLoS One. 3 (11), e3647(2008).</li>
<li>Lampropoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GreenGate---a+novel%2C+versatile%2C+and+efficient+cloning+system+for+plant+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis.</a> PLoS One. 8 (12), e83043(2013).</li>
<li>Chen, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+582+natural+and+synthetic+terminators+and+quantification+of+their+design+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints.</a> Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).</li>
<li>Woodin, T., Carter, V. C., Fletcher, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vision+and+change+in+biology+undergraduate+education%2C+a+call+for+action--initial+responses%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Vision and change in biology undergraduate education, a call for action--initial responses.</a> CBE Life Sci Educ. 9 (2), 71-73 (2010).</li>
<li>Vasaly, H. L., Feser, J., Lettrich, M. D., Correa, K., Denniston, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vision+and+change+in+the+biology+community%3A+snapshots+of+change%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">Vision and change in the biology community: snapshots of change.</a> CBE Life Sci Educ. 13 (1), 16-20 (2014).</li>
<li>Naville, M., Ghuillot-Gaudeffroy, A., Marchais, A., Gautheret, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARNold%3A+a+web+tool+for+the+prediction+of+Rho-independent+transcription+terminators%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">ARNold: a web tool for the prediction of Rho-independent transcription terminators.</a> RNA Biol. 8 (1), 11-13 (2011).</li>
<li>Campbell, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pClone%3A+Synthetic+Biology+Tool+Makes+Promoter+Research+Accessible+to+Beginning+Biology+Students%5BTitle%5D)+AND+%22CBE+Life+Sci+Educ%22%5BJournal%5D)">pClone: Synthetic Biology Tool Makes Promoter Research Accessible to Beginning Biology Students.</a> CBE Life Sci Educ. 13 (2), 285-296 (2014).</li>
<li>Rhee, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+the+medium+composition+and+plasmid+combination+on+the+growth+of+recombinant+Escherichia+coli+JM109+and+on+the+production+of+the+fusion+protein+EcoRI%3A%3ASPA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Influence of the medium composition and plasmid combination on the growth of recombinant Escherichia coli JM109 and on the production of the fusion protein EcoRI::SPA.</a> J Biotechnol. 55 (2), 69-83 (1997).</li>
<li>Dirla, S., Chien, J. Y., Schleif, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+mutations+in+the+Escherichia+coli+AraC+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Constitutive mutations in the Escherichia coli AraC protein.</a> J Bacteriol. 191 (8), 2668-2674 (2009).</li>
<li>Schleif, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+L-arabinose+operon+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulation of the L-arabinose operon of Escherichia coli.</a> Trends Genet. 16 (12), 559-565 (2000).</li>
<li>Kosuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composability+of+regulatory+sequences+controlling+transcription+and+translation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Composability of regulatory sequences controlling transcription and translation in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 14024-14029 (2013).</li>
<li>Sharon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+gene+regulatory+logic+from+high-throughput+measurements+of+thousands+of+systematically+designed+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Inferring gene regulatory logic from high-throughput measurements of thousands of systematically designed promoters.</a> Nat Biotechnol. 30 (6), 521-530 (2012).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案中最重要的步骤是在订购前进行正确的寡核苷酸设计。为了确保能够实现GGA插入，上下两条链的5'端都必须添加适当的黏性末端。此外，由于GFP和RFP的表达方向为向右（上链）方向，因此必须将朝左的终止子（即在下链上终止转录的终止子）转换为朝右的终止子（即在上链上终止转录的终止子）。
在 pGR-Blue 中测试终止子时，可使用两种独立的 GGA 方案和缓冲液体系。标准经济型体系由实验室自行采购各组分并混合配制8。第二种方案则采用商业预混的 GGA 主混合液。两种方法均具有良好效果；但商业主混合液更节省时间，成本相对较高。在教学环境中，提前配制标准 GGA 混合液并分装冻存，供学生 individually 使用，可能更具经济性。
由于对pGR质粒进行了GGA修饰，并反向插入amilCP以实现颜色筛选，未切割的pGR-Blue质粒中GFP和RFP的表达受到限制，因此在测定相对终止子强度时，不应将其作为参考对照。然而，所有这些修饰在克隆过程中均会被去除，从而能够准确量化相对终止子强度。尽管最好使用原始的未修饰...

大型合成生物学项目需要使用高效的转录终止子来帮助调控基因表达。鉴定新型终止子需要对新基因组进行生物信息学分析。然而，随着越来越多的生物信息学软件被开发出来，每种软件都采用独特的预测算法，导致假定结果之间的差异日益增加。由于这一过程具有一定的主观性，并且是在计算机上（in silico）完成的，因此这些预测需要通过生物学实验加以验证1。此外，通过计算机分析（in silico）鉴定出的大量假定终止子，要求采用能够在相对较短时间内完成的克隆策略。
PGR-Blue 质粒是 PGR 质粒的一种改良版本，经过重新设计以采用黄金门组装（Golden Gate Assembly, GGA）技术，使所有反应步骤可在同一微量离心管中同时进行，从而简化了克隆流程2,3。该质粒引入了颜色筛选机制，以更方便地识别阳性克隆。当在含有阿拉伯糖的培养板上生长时，成功连接的克隆在可见光下呈白色或黄色，在蓝光（450 nm）或紫外光（UV）照射下会发出绿色荧光。由于未切割的 pGR-blue 含有一种蓝色色素蛋白（amilCP），因此含有未修饰质粒的菌落在可见光下呈蓝色。这一简化设计结合优化的实验流程，使研究人员能够在 3 至 4 天内完成从生物信息学鉴定到生物学验证的全过程。该系统的模块化设计在科研实验室和教学环境中均具有重要应用价值。
pGR-Blue 质粒可用于定量终止子的强度。4 该质粒使用单一的阿拉伯糖诱导型启动子来表达绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP）。终止子被克隆至质粒中GFP序列之后、RFP序列之前，从而终止RFP蛋白的转录。终止子的强度通过所产生的GFP与RFP的比值来确定。
《愿景与变革》5报告建议，科学、技术、工程和数学（STEM）教育应将基于研究的实践经历纳入课堂教学中6。然而，这需要开发出适合技能水平有限的学生在规定时间内完成的实验方案。本方案最短可在三天内完成，同时也被设计为每个主要步骤可在独立的每周（2–3 小时）实验课中分步实施，从而构建一门课程研究实践（CRE）。以这种方式实施时，整个流程将持续三至六周，适用于遗传学、细胞生物学或生物信息学的入门及高级课程。

<table><tbody><tr><td>pGR-Blue 质粒</td><td>Addgene</td><td>68374</td><td></td></tr><tr><td>pGR-质粒</td><td>Addgene</td><td>46002</td><td></td></tr><tr><td>AeraSeal-（无菌片材）</td><td>Excel Scientific</td><td>BS-25</td><td>仅限无菌片材</td></tr><tr><td>10x T4 DNA 连接酶缓冲液</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF</td><td>NEB</td><td>R3535S</td><td>非 HF 酶也可使用，但热稳定性较差。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>NEB Golden Gate 组装混合液</td><td>NEB</td><td>E1600S</td><td>方案中提到的商用预混液。</td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>圆形微量离心浮置架</td><td>Nova Tech International</td><td>F18875-6401</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;L&lt;/em&gt;-(+)-阿拉伯糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-3256</td><td>D-阿拉伯糖不能诱导 pBAD 启动子</td></tr><tr><td>LB 培养基（Luria Base）- 肉汤，Miller 配方</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1900</td><td></td></tr><tr><td>LB 培养基（Luria Base）- 琼脂，Miller 配方</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2025</td><td></td></tr><tr><td>Tecan-Infinite M200 酶标仪</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mix &amp; Go 感受态细胞 - JM109 菌株</td><td>Zymo Research</td><td>T3005</td><td>使用公司推荐的转化方案</td></tr><tr><td>ApE：质粒编辑软件</td><td>http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl，分子生物学级</td><td>Promega</td><td>H5121</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（结晶/生物级，认证）</td><td>Fisher Chemical</td><td>S671</td><td></td></tr><tr><td>商业寡核苷酸合成</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td>http://www.idtdna.com/site</td></tr><tr><td>Microtest 组织培养板 - 96 孔（无菌）</td><td>Falcon</td><td>35-3072</td><td></td></tr><tr><td>分枝杆菌噬菌体 &quot;Bernal13&quot;</td><td>Genebank</td><td>KJ510413</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>IDT004</td><td></td></tr><tr><td>无菌 L 形刮菌棒</td><td>Life Science Products</td><td>6444-S1</td><td></td></tr><tr><td>Nano-Drop 2000c 紫外-可见分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td>2000c</td><td></td></tr><tr><td>ARNold：一种用于预测Rho非依赖型转录终止子的网络工具。</td><td>http://rna.igmors.u-psud.fr/</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用 pgr-blue 质粒和 golden gate 连接快速验证终止子

Rapid Verification of Terminators Using the pGR-Blue Plasmid and Golden Gate Assembly

本实验方案的目的是实现对生物信息学方法鉴定出的终止子进行快速验证。此外，本方案专门设计了质粒pGR-Blue，可用于定量测定终止子效率。作为概念验证，研究人员在分枝杆菌噬菌体Bernal13中通过生物信息学方法鉴定了六个终止子。鉴定完成后，将这些终止子序列合成为带有适当黏性末端的寡核苷酸，并进行退火连接。利用Golden Gate组装（GGA）技术，将终止子克隆至pGR-Blue质粒中。在可见光下，假阳性菌落呈蓝色，而成功转化的阳性菌落则为白色或黄色。通过阿拉伯糖诱导阿拉伯糖诱导型启动子（pBad）后，可通过检测绿色荧光蛋白（GFP）与红色荧光蛋白（RFP）的产生量之比来确定菌落的荧光强度。使用pGR-Blue质粒，该实验方案最短可在三天内完成，非常适合用于教学环境。此外，实验结果表明，该方案有助于理解与转录调控相关的终止子效率的in silico预测。

本方案将通过Golden Gate Assembly（图2）在GFP与RFP之间连接一个终止子，从而获得含有pGR-Blue质粒的细胞。可通过菌落颜色筛选含有连接插入片段的阳性克隆。在可见光下，阳性克隆呈白色/黄色，而假阳性克隆在37 °C培养18–20小时后将形成蓝色菌落（图3）。
菌落筛选后，可使用酶标仪测定终止子强度。作为概念验证，通过生物信息学方法在分枝杆菌噬菌体 Bernal13 中鉴定了六个潜在的终止子（T1-6）。图4中的结果显示了以表达未切割/未修饰质粒 pGR 的细胞作为对照的相对终止子强度。若预测的终止子其 GFP/RFP 比值接近 pGR 的比值（约 0.0）或低于 0.1，则判定该序列不具备终止子功能（T5 和 T6）。然而，数值上每增加 0.1，代表相对于对照终止子强度增加一倍。例如，T3 的 GFP 表达相对于 RFP 具有...

本方案利用 Golden Gate 组装技术和质粒 pGR-blue，快速定量 in silico 预测的终止子强度。

利用 pGR-Blue 质粒和 Golden Gate 连接快速验证终止子

本实验方案的目的是实现对生物信息学鉴定出的终止子进行快速验证。此外，质粒（pGR-Blue）的设计旨在……

合成生物学实验方案的总体目标是利用黄金门组装技术，在体外系统中快速确定终止子的功能并量化其强度。该方案用于验证我们通过生物信息学方法在计算机中预测发现的终止子，并在生物学环境中对其进行测试。这使得在实验室操作台条件下，能够快速、简便地确认经生物信息学鉴定的终止子功能。本方案的主要优势在于其快速性。我们可以在不到一周的时间内，从生物信息学鉴定完成到生物学验证。通过该方法，我们还能验证一个序列是否确实为终止子，并可定量其终止效率。通常情况下，人们最初会对这种技术感到困难，因为在同一个反应管中同时加入限制性内切酶和连接酶听起来有违直觉。然而，我们使用的是2S型限制性内切酶，其识别位点与实际切割位点是分开的。一旦终止子被连接到pGR blue质粒中，该连接即为永久性连接。然而，通过在同一个试管中同时加入限制性内切酶和连接酶，并经过多个循环，我们可以实现高效的克隆效率。开始此操作时，先将各个寡核苷酸在无核酸酶的水中重新悬浮，浓度为 100 微摩尔，然后配制 10 倍退火缓冲液。接下来，为每个待检测的终止子标记一个 1.5 毫升的微量离心管。向每个离心管中加入 16 µL 超纯水、2 µL 10x 退火缓冲液，以及各 1 µL 所需终止子的上游和下游链寡核苷酸。务必确保所订购的寡核苷酸具有正确的黏性末端，因为一旦两者退火结合，必须保证终止子处于正确的方向。如果终止子的方向不正确，pGR blue 将无法验证其是否为有功能的终止子。接下来，将微量离心管放入浮架中，并在水浴中煮沸四分钟。四分钟后，关闭加热板，但将离心管留在水中过夜，使其缓慢冷却。将退火后的终止子在 20 摄氏度下保存。为制备 40 纳摩尔的退火终止子稀释液，首先将其置于冰上解冻，然后在新的 1.5 毫升微量离心管中，向 1 微升退火终止子中加入 124 微升无核酸酶水。在 10,000×g 条件下离心样品 30 秒。离心后，将样品置于冰上保存。在新的适合的PCR仪管中，加入6 µL无核酸酶水，然后加入1 µL商用DNA连接酶缓冲液。后续所有步骤均需在冰上进行。接着，加入1微升含有35至50纳克/微升的pGR blue目的质粒、1微升40纳摩尔的退火终止子、0.5微升商用高保真BSA1限制性内切酶以及0.5微升商用DNA连接酶。将反应混合物在10,000×g离心120秒。然后将离心管直接放入热循环仪中，运行以下程序：37摄氏度孵育1分钟，16摄氏度孵育1分钟，共20个循环；随后在37摄氏度下孵育15分钟，1个循环。程序结束后，可将样品在20摄氏度下冷冻保存，或立即进行转化。使用任何合适的转化方案，将连接反应产物转化至化学感受态的大肠杆菌细胞中。此处使用Zippy转化法将连接产物转化至JM109细胞中。使用L形玻璃涂布棒，将25微升转化后的细胞均匀涂布于预先温育的含有1毫摩尔氨苄青霉素和10毫摩尔阿拉伯糖的LB琼脂平板上。在37摄氏度下倒置培养平板过夜，培养时间不得超过24小时。氨苄青霉素降解迅速。第二天，观察菌落的颜色。成功的连接产物在可见光下应呈白色或黄色，在蓝光或紫外光下会发出绿色荧光。连接失败的克隆在可见光下会呈现蓝色。针对每个终止子及对照组，准备一个试管，其中含有5毫升无菌LB培养基，添加1毫摩尔的氨苄青霉素和10毫摩尔的阿拉伯糖。在执行本实验方案时，使用pGR质粒必须确保设置正确的对照组。第一个对照应仅为LB肉汤。下一个对照应为具有氨苄青霉素抗性但在蓝光下不发荧光的细胞，用作空白对照。下一个对照是未被切割的 pGR 质粒，因此不含终止子，将作为终止子强度的基线；你试管中的最后一个样品则用于待测样本。在可见光下，用无菌接种环挑取 2 到 3 个白色或黄色菌落，并转移至 LB 液体培养基中。将样品置于摇床中，于 37 摄氏度、160 rpm 条件下培养 16 至 18 小时。第二天，使用分光光度计测定每个样品在 600 纳米处的光密度。通常，经过此培养时间后，OD 600 预期值为 0.8 至 1.0。将一个无菌的 96 孔板放入生物安全柜中。针对每个样本或对照，准备3个孔，每孔加入含氨苄青霉素和阿拉伯糖的199微升无菌LB培养基。随后，用移液器将过夜培养液中的1微升细胞溶液分别加入96孔板的各个孔中。用透气盖密封96孔板，然后在37摄氏度、160转/分钟的条件下振荡培养18至20小时。第二天，使用酶标仪测定 OD 600，其值应约为 0.5。同时，在激发波长 395 纳米、发射波长 509 纳米的条件下测定 G of P 荧光。在激发波长 575 纳米、发射波长 605 纳米的条件下测定 RFP 荧光。使用 Excel，通过将荧光值除以 OD 600 来校正生长差异。校正后，通过计算含GFP终止子的荧光值与GFP对照荧光值的比值，再除以含RFP终止子的荧光值与RFP对照荧光值的比值，来确定相对终止子强度。本视频中分析了通过生物信息学方法在微小噬菌体 bernal 13 中鉴定出的假定终止子 T1 至 T6。这些结果展示了相对荧光强度。所有结果均以含有未切割、未修饰PGR的细胞作为对照进行归一化处理。T3被证实是一个强效终止子。所有结果均代表以三份平行培养的单个菌落，取平均值进行可视化展示。误差线表示平均数据点之间的偏差。为了确定用于量化终止子强度的最佳参考对照，比较了使用原始 pGR 质粒（不含终止子）以及克隆了已知非终止子序列的 pGR blue 的原始数据。如图所示，两个对照组均表现出相似水平的GFP和RFP表达，更重要的是，其GFP与RFP的比值也相近。所有这些结果均代表独立的菌落，每个样本均设置三个重复，取平均值用于可视化展示。一旦掌握该技术，包括样品运输和订购时间在内，整个过程最短仅需72小时。需要注意的是，pGR blue 仅在大肠杆菌（e.coli）中有效。此外，由于我们仅观察了终止子的一小段序列，因此无法了解可能调控转录的其他调控元件。为了验证使用 pGR blue 协议所获得的结果，可采用其他方法进行验证，例如定量 PCR（qPCR）。此外，可将 pGR 插入片段切割下来，并连接至您选择的质粒中。

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