Name: 视网膜缺血再灌注损伤的小鼠模型通过眼压升高 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 学习通过升高眼压建立小鼠视网膜缺血再灌注损伤模型的方法。该技术可精准靶向眼部结构，用于研究炎症、氧化应激及神经血管功能障碍机制，为评估视网膜疾病治疗策略提供重要实验基础。

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本工作得到了美国国立卫生研究院研究基金（EY022383 和 EY022683；EJD）以及核心基金（P30EY001765）、成像与显微镜核心模块的资助。

伦理声明：所有操作均严格遵循约翰斯·霍普金斯大学机构动物护理和使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee）制定的指南进行。
注意：拍摄过程中使用的小鼠为杰克逊实验室提供的 C57BL/6 小鼠，但也可使用其他品系或种类的啮齿动物。当使用其他品系或种类时，需注意麻醉剂量和损伤时间进程可能存在差异。应根据品系、物种及实验条件的变化，对缺血/再灌注（I/R）条件进行相应调整。
1. 准备麻醉混合液
<ol>
	<li>在50 ml离心管中加入1.25 ml氯胺酮、0.625 ml赛拉嗪、0.375 ml乙酰丙嗪和22.75 ml磷酸盐缓冲液。 
	注意：在本论文其余部分中，该溶液将被称为麻醉混合液。</li>
	<li>使用60 ml注射器和0.20 µm滤器将混合液过滤至新的无菌50 ml离心管中。标记并注明此新管的日期。</li>
	<li>用铝箔完全包裹混合液管，以防止麻醉剂因光照而降解。&#160; 
	注意：该混合液可在室温下保存，并可重复使用，直至其最早过期成分的有效期为止。</li>
</ol>
2. 准备麻醉增强剂
<ol>
	<li>在50 ml离心管中，加入4 ml氯胺酮和16 ml磷酸盐缓冲液。 
	注意：此溶液后续将称为加强剂。</li>
	<li>使用60 ml注射器和0.20 µm滤器将加强剂过滤至新的无菌50 ml离心管中。标记并注明该新管的日期。&#160; 
	注意：加强剂可在室温下保存，并可重复使用，直至其最早过期成分的有效期为止。</li>
</ol>
3. 准备手术室
<ol>
	<li>将室温设置在 18 °C 至 21 °C 之间。</li>
	<li>打开手术台，并将其表面加热调至最高温度。</li>
	<li>用手术垫覆盖所有工作台面。</li>
	<li>在手术台上放置一个空笼子或其他容器以预热。</li>
	<li>在工作台上放置一台电子天平和一个耳标钳。</li>
</ol>
4. 准备含肝素钠的平衡盐溶液
<ol>
	<li>向500 ml静脉输液瓶的平衡盐溶液（HBSS）中加入0.5 ml肝素钠。</li>
	<li>将输液器主管路预穿刺Y型管的尖端插入0.1%肝素钠瓶中。</li>
</ol>
5. 安装输液架
<ol>
	<li>将0.1%肝素钠瓶悬挂在输液架延长杆上，并打开主输液管预穿刺Y型接口处的空气过滤帽。</li>
	<li>将0.1%肝素钠瓶抬升至163 cm（120 mm Hg）高度。测量从台面到肝素钠滴注液最高点的垂直距离。</li>
	<li>通过手动轻弹主输液管预穿刺Y型接口处的输液管，排除输液管中的所有气泡。</li>
</ol>
6. 建立肝素钠输注
<ol>
	<li>将预穿刺Y型连接管的主套装连接至五通阀分流器。</li>
	<li>使用公鲁尔接头对公鲁尔接头管件，将30号规格½英寸针头连接至五通分流器的各个接口。</li>
	<li>将每根30号规格½英寸针头分别插入一段10英寸长的30号规格导管中。</li>
	<li>使用止血钳折断新的30号规格½英寸针头的针尖，将钝端插入30号规格导管中。&#160;第8.3步中需对针尖进行无菌处理或消毒。</li>
	<li>使用胶带将带针头的30号规格导管进行排列，使连接内侧接口的导管位于连接外侧接口的导管上方。此排列方式可防止前房穿刺过程中导管缠绕。</li>
	<li>开启0.1%肝素钠溶液至五通阀分流器及各个独立接口的流动。
	<ol>
		<li>确保每个接口均有较强的0.1%肝素钠溶液流动。若某一接口流速较弱，应更换该接口或用无菌注射器注入空气清除堵塞。</li>
		<li>让0.1%肝素钠溶液持续流动2–3分钟，以排除30号规格导管及五通阀分流器中的气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>关闭五通阀分流器上的所有接口。</li>
</ol>
7. 准备小鼠以进行手术
<ol>
	<li>将小鼠带入手术室。为每只笼子提供水瓶，以防止动物在手术期间脱水。</li>
	<li>记录每只小鼠的体重。</li>
	<li>每只小鼠腹腔注射&#160;每克体重给予0.02 ml混合液。</li>
	<li>标记并记录每只小鼠的数量。</li>
	<li>将所有小鼠放入手术台上无盖的容器中。麻醉5-10分钟，直至小鼠对脚趾夹捏无足底回缩反应，确认进入深度麻醉状态。</li>
	<li>每只小鼠双眼各滴一滴托吡卡胺，以实现瞳孔扩张和短期润滑。</li>
	<li>每只小鼠双眼各滴一滴丙帕卡因，用于局部麻醉和短期润滑。</li>
	<li>将小鼠按照麻醉顺序排列，使首只被麻醉的小鼠即为首只进行插管的小鼠。</li>
	<li>让眼药水起效约需 2 分钟。</li>
	<li>通过用力拉紧胶带，裁剪出4英寸长的直条。为每只小鼠预留一段胶带。     
	注意：未用力拉紧胶带会导致胶带卷曲。</li>
</ol>
8. 前房穿刺插管
<ol>
	<li>将第一只小鼠置于手术显微镜下，并将显微镜对准选定的角膜。			 
	注意：插管操作可在任一眼进行。惯用右手的手术者可能发现插管左眼更为方便，而惯用左手的手术者则可能更倾向于选择右眼。</li>
	<li>打开五阀歧管上的第一个0.1%肝素钠端口。</li>
	<li>在手术显微镜下，使用一对镊子轻轻突出眼球。将30号规格的套管针插入前房，位置大约位于悬韧带纤维与角膜顶点之间的中点处。
	<ol>
		<li>注意避免划伤或穿刺虹膜、晶状体或角膜内表面。</li>
		<li>避免二次穿透角膜。</li>
		<li>采用轻柔的旋转动作以克服套管与角膜之间的摩擦力，将套管深入插入前房。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用一段胶带将30号规格的管路固定在桌面上。为尽量减少已插入套管的移动，在取胶带时应将30号规格的管路紧压在桌面上。</li>
	<li>记录手术开始时间。</li>
	<li>通过显微镜观察，确认无液体渗漏现象。若存在渗漏，则可在眼球附近观察到液体流动。</li>
	<li>通过视觉确认眼球膨胀，表现为缺血/再灌注（I/R）眼较对侧眼更大。无渗漏且出现眼球膨胀共同表明眼内压已成功升高。</li>
	<li>在双眼表面涂抹羟丙基甲基纤维素（hypromellose）。该物质可润滑角膜并封闭微小渗漏。根据需要（约每30分钟）重复涂抹，以维持持续润滑效果。</li>
	<li>重复步骤8，直至所有动物均完成插管。</li>
</ol>
9. 监测麻醉状态
<ol>
	<li>通过脚趾夹捏、观察胡须或观察尾巴来确认每只小鼠仍处于麻醉状态。若小鼠出现足底回缩反应、胡须抽动或尾巴移动，应立即进入步骤 9.2。</li>
	<li>若小鼠在手术过程中开始苏醒，提起尾巴，在小鼠后方将其下腹部进行 0.05 ml 的腹腔追加注射。等待 1 - 2 分钟，使追加剂量发挥作用。</li>
	<li>若小鼠&#160;需要额外镇静，可根据需要重复步骤 9。</li>
</ol>
10. 从前房移除套管针&#160;
<ol>
	<li>每只动物在90分钟后，轻轻将导管从前房中抽出。</li>
	<li>将小鼠从手术台上解开胶带固定，注意不要触碰相邻动物的导管管路。</li>
	<li>用润滑凝胶涂抹双眼以保护角膜。</li>
	<li>随着后续导管的移除，将小鼠依次放入手术台上的空容器中，使其在加热的手术台上恢复。请勿关闭手术台的加热功能。</li>
	<li>至少让小鼠在加热的手术台上恢复2 - 3小时。&#160;在小鼠完全从麻醉中恢复之前，需频繁观察其状态。</li>
</ol>
11. 清洁设备
<ol>
	<li>消毒&#160;使用酒精棉片清洁套管。&#160; 
	注意：可使用其他消毒或灭菌方法，例如高压蒸汽灭菌，以替代本法。</li>
	<li>使用装有空气的60 ml注射器，将5阀歧管、30号针头、30号导管和套管中的0.1%肝素钠排出。</li>
	<li>使用装有蒸馏水的60 ml注射器冲洗五通阀、30号针头、30号导管和套管。</li>
	<li>使用装有空气的60 ml注射器，将蒸馏水从五通歧管、30号针头、30号导管和套管中排出。</li>
	<li>消毒后&#160;将套管和冲洗管路装置清洗后，妥善保存以备重复使用。</li>
	<li>储存、丢弃或关闭所有其他设备。保持手术台的加热功能开启。</li>
</ol>
12. 将所有小鼠放回其原代饲养笼
<ol>
	<li>小鼠术后苏醒后（术后2 - 3小时），将每只动物放回其原有饲养笼。为每个笼子提供凝胶食物。&#160;将所有饲养笼送回指定房间。</li>
	<li>关闭手术台的加热装置。丢弃所有废弃物，并清洁手术区域。</li>
</ol>
13. 进行视网膜评估
<ol>
	<li>根据需要，收集视网膜进行组织学分析，或使小鼠暗适应以记录视网膜电图。</li>
</ol>

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</ol>

作者无披露信息。

通过升高眼内压（IOP）诱导的视网膜缺血/再灌注&#160;损伤，已被证实可用于模拟啮齿动物视网膜神经血管单元中的细胞损伤与功能障碍，尤其是神经退行性病变。该方法可提供可靠的对照组织，且在技术操作上易于实现。已有研究指出，在本模型及其他缺血/再灌注损伤模型中，增加缺血压力和持续时间可能会加重损伤程度24。因此，部分研究者选择采用与本文所述不同的缺血压力和持续时间4,6-10,12。正因如此，相较于其他视网膜缺血/再灌注技术，通过升高IOP诱导视网膜缺血/再灌注损伤的优势在于，允许研究者根据特定的实验目标调整手术参数。
尽管如此，已有其他技术被用于在啮齿类动物中诱导视网膜缺血/再灌注（I/R）损伤。通过结扎视神经束25,26或仅结扎中央视网膜动脉27，可暂时阻断视网膜血流。针对全身性条件的类似策略则需结扎脑动脉28或头臂动脉29，以减少血流而不完全阻断。另一种较少使用的方法是利用两端带有重物的线绳对眼球进行环形压迫30。尽管这些方法...

视网膜缺血-再灌注（I/R）是多种人类视网膜疾病的重要特征，包括青光眼、糖尿病性视网膜病变以及视网膜血管阻塞1。在视网膜I/R过程中，视网膜血管系统血流减少（缺血）会导致视网膜对氧气及其他营养物质出现超敏状态，当血流随后恢复（再灌注）时，会引发严重的氧化应激和炎症损伤2。神经视网膜对这些变化尤为敏感，其中视网膜神经变性可能是I/R所致损伤中最显著的特征。本文介绍一种在小鼠中建立视网膜I/R损伤模型的实验方案。该技术可帮助研究人员探究人类视网膜神经血管单元疾病的潜在机制及治疗策略。
1952年，外科医生为研究手术性贫血的神经退行性后果，首次建立了通过升高眼内压（IOP）诱导啮齿类动物视网膜缺血/再灌注（I/R）的模型3。1991年，该模型被重新确立，旨在标准化缺血损伤后的神经退行性终点指标4。这些研究利用生理盐水储液器滴注以升高IOP至超过收缩压，证明加压性眼部灌注足以中断视网膜血液循环，从而引发神经元退变。近年来，利用升高IOP诱导视网膜I/R的研究进一步阐明了I/R所致视网膜神经退行性变的潜在机制5-12。多个研究团队已报道了其他病理变化，包括炎症反应13,14、血管通透性增加15,16以及毛细血管退变14,17。综上所述，这些研究确立了通过升高IOP诱导的视网膜I/R损伤作为更广泛意义上的视网膜神经血管疾病的模型。
阐明缺血/再灌注（I/R）损伤的机制对于血管疾病的研究至关重要。通过升高眼内压（IOP）诱导的视网膜I/R损伤是多种缺氧相关损伤模型之一，其他类似模型还包括肺18、心脏19、脑20、肝21、肾22和肠23的I/R损伤。这些模型在推动我们对血管性疾病及其临床治疗策略的理解方面起到了关键作用。将I/R过程的研究拓展至眼部组织，有助于通过升高IOP引起的视网膜I/R损伤，更全面地揭示这些相关疾病的病理机制。
视网膜缺血/再灌注（I/R）损伤通过升高眼内压（IOP）模拟临床神经退行性疾病，为研究缺血性发病机制的科研人员提供了有价值的工具。本文所述的实验方案具有针对性、可操作性和易用性，并可通过多种终点指标评估神经元退变，例如视网膜神经元数量的定量分析、视网膜厚度的测量以及视网膜神经元功能的电生理记录。该模型已在推动神经血管研究方面证明其有效性，并有望成为视觉医学研究中的基础性实验方案。

<table><tbody><tr><td>肝素钠注射液，USP</td><td>Abraxis Pharmaceutical Products</td><td></td><td>1,000 USP/ml</td></tr><tr><td>BSS 无菌灌注液</td><td>Alcon Laboratories, Inc.</td><td>9007754-0212</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>SC-2 kg 数字便携式天平</td><td>American Weigh Scales, Inc.</td><td>SC-2 kg</td><td></td></tr><tr><td>托吡卡胺眼用溶液 USP 1%</td><td>Bausch + Lomb</td><td></td><td>1% (10 mg/ml)</td></tr><tr><td>盐酸丙帕他卡因眼用溶液 USP，0.5%</td><td>Bausch + Lomb</td><td></td><td>0.5% (5 mg/ml)</td></tr><tr><td>INTRAMEDIC 聚乙烯导管</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>427400</td><td>内径：427400</td></tr><tr><td>30 G 1/2 PrecisionGlide 针头</td><td>Benton Dickinson and Company</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>BC 1 ml TB 注射器，细尖端带皮内斜面针头，26 G × 3/8</td><td>Benton Dickinson and Company</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>BD 60 ml 注射器，鲁尔锁扣式尖端</td><td>Benton Dickinson and Company</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>蔡司 OPMI Visu 200/S8 显微镜</td><td>Carl Zeiss AG</td><td>000000-1179-101</td><td></td></tr><tr><td>无菌注射器滤器</td><td>Corning Inc.</td><td>CLS431224</td><td>0.20 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>Durasorb 吸水垫</td><td>Covidien</td><td>1038</td><td>23 × 24 英寸</td></tr><tr><td>酒精棉片</td><td>Covidien</td><td>6818</td><td>双层，中号</td></tr><tr><td>学生型 Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>哈特曼止血钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>13002-10</td><td></td></tr><tr><td>初级输液管路，大孔径，预穿刺 Y 型接口，80 英寸</td><td>Hospira</td><td>12672-28</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲盐水 pH 7.4 (1x)</td><td>Invitrogen</td><td>10010-049</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td>Invitrogen</td><td>15230-204</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>AnaSed 注射液：无菌赛拉嗪溶液</td><td>LLOYD, Inc.</td><td></td><td>20 mg/ml</td></tr><tr><td>润滑胶，水溶性抑菌型</td><td>MediChoice</td><td></td><td>3 克/袋</td></tr><tr><td>NAMIC 血管造影压力监测三通阀</td><td>Navilyst Medical, Inc.</td><td>70039355</td><td>五阀三通，带七个母端接口</td></tr><tr><td>Goniosoft，羟丙基甲基纤维素 2.5% 眼用润肤溶液：羟丙基甲基纤维素</td><td>OCuSOFT, Inc.</td><td></td><td>2.5% (25 mg/ml)</td></tr><tr><td>Ketaset CIII：盐酸氯胺酮</td><td>Pfizer, Inc.</td><td></td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Trans-Pal I.V. 输液架&amp;nbsp;</td><td>Pryor Products</td><td>372</td><td>配备自制的 60 厘米不锈钢延长杆</td></tr><tr><td>乙酰丙嗪：马来酸乙酰丙嗪注射液，USP</td><td>Vet One</td><td></td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>V-Top 手术台/液压可调式</td><td>VSSI</td><td>100-4041-21</td><td></td></tr><tr><td>管路接头，鲁尔公头转鲁尔公头</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1579</td><td></td></tr></tbody></table>

通过升高眼内压建立小鼠视网膜缺血-再灌注损伤模型

A Mouse Model of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury Through Elevation of Intraocular Pressure

视网膜缺血-再灌注（I/R）是一种病理生理过程，参与多种眼部疾病中的细胞损伤，包括青光眼、糖尿病性视网膜病变以及视网膜血管阻塞。啮齿类动物的I/R损伤模型为人类I/R损伤的机制及治疗策略提供了重要见解，尤其在视网膜神经血管单元的神经退行性损伤方面。本文介绍一种通过升高眼内压（IOP）在小鼠中诱导视网膜I/R损伤的实验方案。该方案通过针头穿刺眼球前房，并连接一个抬高的生理盐水储液装置进行滴注。利用此滴注系统将IOP升高至超过动脉收缩压水平，操作者可暂时阻断视网膜内层的血流（缺血）。当拔除穿刺针恢复血液循环（再灌注）时，将引发严重的细胞损伤，最终导致视网膜神经退行性变。近期研究表明，炎症反应、血管通透性增加以及毛细血管退化也是该模型的附加特征。与视网膜动脉结扎等其他视网膜I/R建模方法相比，通过升高IOP诱导视网膜I/R损伤具有以下优势：&#160;解剖特异性、实验可操作性和技术可及性，使其成为研究视网膜神经血管单元中神经病理发生机制及治疗的重要工具。

通过升高眼内压（IOP）引起的视网膜缺血/再灌注（I/R）的神经退行性效应通常采用两种标准方法进行评估。神经元核的NeuN免疫标记显示，I/R损伤后神经元细胞显著丢失（图1）。简言之，在I/R术后7天摘除眼球，用多聚甲醛固定，以神经元细胞标志物NeuN进行标记，并制备整体装片。使用共聚焦显微镜采集图像，并通过计数11对NeuN标记的细胞进行定量。神经节细胞层神经元数量的减少表明I/R诱导的细胞死亡。
视网膜神经元功能的损伤已通过视网膜电图记录得到证实（图2）。简言之，在缺血/再灌注（I/R）7天后，于不同闪光强度下记录暗适应视网膜电图。a波和b波的振幅通过图像分析软件进行量化12。此处，a波和b波振幅的降低表明I/R导致的视网膜神经元功能受损。在这些及其他I/R相关检测指标中，未受I/R处理的眼作为I/R诱导损伤的可靠阴性对照。
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本文介绍了一种通过升高眼内压在小鼠中诱导视网膜缺血-再灌注损伤的方法。通过升高眼内压造成视网膜缺血-再灌注损伤，可模拟人类视网膜因氧气和营养供应受损所导致的病理状态，使研究人员能够探究视网膜神经血管单元相关人类疾病的潜在细胞机制及治疗方法。

视网膜缺血-再灌注（I/R）是一种病理生理过程，可导致多种眼部疾病中的细胞损伤，包括青光眼、……

该技术的总体目标是提供一种视网膜缺血-再灌注损伤及其病理后果的实验模型。该方法常用于研究视网膜缺血-再灌注的潜在机制，以及评估治疗相关病理的潜在治疗策略。该技术的主要优势在于，它能够高度特异性地损伤眼部结构，同时对周围组织造成最小程度的损害。该技术的实用性可延伸至对视网膜缺血-再灌注损伤多种表现形式的理解，包括：视网膜神经血管单元中的炎症、氧化应激以及星形胶质细胞功能障碍。该方法的视频演示至关重要，因为导管置入的手术技术若无视觉指导可能难以重现。在开始操作前，先将一个空的笼子在桌面上预热。然后将输液器预穿刺Y型管的尖端插入一瓶0.1%肝素钠溶液中，并将肝素钠瓶悬挂在静脉输液架的延长杆上。打开管路上的空气过滤帽。随后将肝素钠瓶抬高至距离实验台面163厘米的高度，使肝素钠滴液最高点达到该高度，从而产生相当于120毫米汞柱的肝素钠流体压力。打开预穿刺Y型侧管的一级管路，使肝素钠充满管路，将预穿刺Y型侧管的一级管路连接至五通阀分流器。然后，使用鲁尔公对鲁尔公接头，将30号半英寸针头连接至五通分流器的各个接口。将每根针头分别插入一段10英寸长的30号管路中。然后，使用止血钳折断新的30号半英寸针头尖端，并将其钝端插入30号导管的开口端。接下来，使用胶带将针管排列好，使连接内侧管口的导管位于连接外侧管口的导管上方，以防止前房灌注过程中导管缠绕。随后，打开0.1%肝素钠溶液至五通阀 manifold 及各个独立管口的流路，持续两到三分钟，以排除任何气泡。然后，关闭五通阀的所有端口。进行插管操作时，在给予麻醉后，将所有小鼠放入手术台上的保温笼中，五到十分钟内通过脚趾夹捏无反应确认已达到深度麻醉状态。随后，向每只动物的眼睛各滴一滴托吡卡胺以扩大瞳孔，再滴一滴丙美卡因进行局部麻醉，并按照麻醉顺序排列小鼠，使最先麻醉的小鼠最先接受插管。在等待眼药水起效的同时，准备四英寸长的直条状胶带，在撕断前用力拉紧，并为每只动物预留一段胶带。请注意，若未充分拉紧胶带，会导致胶带卷曲。当第一只小鼠准备就绪后，将其置于手术显微镜下。然后，打开五阀歧管上的第一个0.1%肝素钠端口，用镊子轻轻将一只眼睛突出。接着，将30号套管针插入前房，位置大约位于悬韧带纤维与角膜顶点之间的中点处，注意避免再次穿透角膜。请注意，插入套管至前房深处时应使用轻柔的旋转动作。现在，将30号规格的导管轻压在桌面上，以尽量减少在取胶带时已插入套管的移动，然后用胶带将导管固定在桌面上。导管固定后，记录手术的开始时间。使用显微镜确认无渗漏，并观察缺血-再灌注眼是否大于对侧眼，以确定是否存在眼球扩张。每30分钟在双眼滴加羟丙基甲基纤维素（Hypromellose），直至实验结束，以润滑角膜并封闭任何微小渗漏。若动物在操作过程中出现躁动，可提起尾巴并经腹腔注射追加一次氯胺酮（Ketamine）加强剂量。在对第一只动物插管90分钟后，轻

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