从海岸沉积物和16S量化的rRNA基因和转录同时DNA-RNA提取采用Real-time PCR检测
2016年6月11日
该程序的总体目标是从沿海海洋沉积物中提取高产量和高质量的 DNA 和 RNA，然后定量 16S 核糖体 RNA 基因和转录本。这种方法描述从海洋沉积物中提取 DNA 和 RNA，然后进行定量 PCR，这是对环境中微生物丰度和多样性进行分子分析的关键步骤。该技术的主要优点是可用于从同一样品中共提取 DNA 和 RNA，然后可用于下游分析，例如定量 PCR。
来自 NUI Galway 的 Enrico Tatti 博士和来自埃塞克斯大学的博士生 Duncan Sweeney 将演示该程序。在根据文本方案制备不含 RNA 的材料并收集沿海沉积物样品后，要从沿海沉积物中共提取 DNA 和 RNA，请将 0.5 克沉积物转移到 2 毫升珠子裂解管中。向试管中加入 500 微升 CTAB 磷酸盐缓冲液和 500 微升苯酚：氯仿：异戊醇，倒置 5 至 10 次以使样品均质化。
全速涡旋 2.5 分钟，然后以 16， 000 倍 g 和 4 摄氏度旋转 10 分钟。然后，在通风橱中，提取顶部水层并将其转移到新的无菌 1.5 ml 微量离心管中。接下来，将样品放在冰上，加入 500 微升冰冷的氯仿：异戊醇。
然后将试管倒置数次，直到看到乳剂，并像以前一样离心。在通风橱中，提取顶部水层并置于新的无菌 1.5 ml 试管中。然后，为了沉淀核酸，加入两倍体积的 30%PEG 氯化钠溶液并充分混合。
在冰上孵育 2 小时，或将样品在 4 摄氏度下放置过夜。孵育后，将样品在 4 摄氏度下以 16， 000 倍 g 离心 20 分钟。使用微量移液器轻轻去除上清液，确保不要干扰沉淀。
在试管中留下大约 10 微升 PEG 溶液，并加入 1 毫升冰冷的 70% 乙醇。旋转样品后，使用微量移液器缓慢除去乙醇，注意不要接触沉淀。然后离心 5 秒钟并去除残留的乙醇。
让沉淀风干 5 分钟，然后使用 50 微升 DEPC 处理过的水重悬。分装 15 μL DNA 样品和 30 μL RNA 样品。最关键的步骤是确保在去除上清液时 DNA/RNA 沉淀不会脱落，并且在将沉淀重悬于水中之前没有残留乙醇，这会抑制下游分子反应。
要消化 RNA 样品中的 DNA，向 30 μL 核酸等分试样中加入 3 μL DNase I 缓冲液和 1.5 μL DNase I。在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。涡旋混合 DNase 灭活试剂 30 秒。
然后向样品中加入 4.8 μL 溶液，在室温下孵育 5 分钟，偶尔敲击试管底部以混合溶液。离心样品后，将含有 RNA 的上清液转移到新试管中，注意不要转移沉淀物。为了检查 RNA 质量，通过添加 18 μL 无菌无 RNase 去离子水稀释 2 μL RNA，每 10 人中有 1 人。
在单独的 PCR 反应中，将 1 μL 纯 RNA 或 1/10 稀释的 RNA 加入无菌 0.5 mL PCR 管中。按照文本方案中的表格，添加 PCR 反应组分以扩增 16S 核糖体 RNA 基因。包括阳性对照、PCR 抑制剂对照和阴性对照。
然后使用以下扩增参数运行 PCR 反应。要从 RNA 生成第一链 cDNA，请根据文本方案将反应试剂添加到 0.2 mL PCR 管中。将样品在 65 摄氏度下孵育 5 分钟。
然后将样品放在冰上至少 1 分钟，然后在 25 摄氏度下孵育 10 分钟。孵育后，从文本方案中加入此处所列表格中的试剂，并在 55 摄氏度下孵育 50 分钟。然后在 72 摄氏度下灭活反应 10 分钟。
根据文本方案生成用于 qPCR 的 DNA 和 RNA 标准品后，在冰上解冻环境 DNA 和 cDNA 样品、标准品和 qPCR 试剂。稀释核酸标准品，并制备环境 DNA 和 cDNA 的 1/10 稀释液，从纯到 10 到负 3。制备反应总数加 10% 的预混液，并充分混合。
在 96 孔光学 qPCR 板中的每个孔中加入 19 μL 预混液和 1 μL 模板，一式三份。使用 qPCR 光学盖盖板。然后短暂离心板并将其加载到 qPCR 机器的加热块中。
接下来，打开 qPCR 管理器软件，然后单击 Protocol（实验方案）选项卡，单击 Create New（新建），并添加以下扩增条件。将样品体积设置为 20 μL，单击 OK（确定），然后保存实验方案。现在选择 Plate （板） 选项卡。
然后，在 Edit Selected（编辑选定项）下，单击 Select Fluorophore（选择荧光基团）。为适当的探针添加报告染料，然后单击 OK（确定）。突出显示包含标准品的孔，然后从 Sample Type（样品类型）菜单中选择 Standard（标准品）。选择 Replicate Series （复制序列） 以将 Replicate Size （复制大小） 更改为 3，然后单击 Apply （应用）。
选择 Dilution Series （稀释系列） 以添加标准品的起始浓度。将稀释因子指示为 10，根据标准曲线添加到板中的顺序选择 Reducing 或 Increasing ，然后单击 Apply。突出显示包含未知样品的孔位置，然后从 Sample Type 下拉菜单中选择 Unknown。
选择 Replicate Series （复制序列） 并将 Replicate Size （复制大小） 更改为 3，然后单击 Apply （应用）。在 Sample Name（样品名称）下，编辑样品名称，然后对 no template control wells（无模板对照孔）重复该过程。然后，在板编辑器框中，单击 OK 并保存文件。
然后单击 Start Run。运行完成后，选择 Quantification 选项卡以显示标准曲线、标准曲线描述符和扩增图。最后，为 Cp 值和未知样本基因的相应起始数量选择 Quantification Data（定量数据）选项卡。
根据文本方案确定每克湿重沉积物的基因拷贝数。如该凝胶图像所示，成功的核酸提取可产生清晰的 DNA 和 RNA 条带，其中除了存在高分子量基因组 DNA 条带外，还可见尖锐的 23S 和 16S 核糖体 RNA 条带。该图表明，当正确制备和扩增 10 倍稀释范围以生成用于 qPCR 反应的标准曲线时，每个标准品稀释之间会出现 3.3 个循环的差异。
请务必从无模板控件或 NTC（如果存在）报告交叉点或 Cp 值。如果发生这种情况，则如前所述，标准和未知样品的 Cp 截止值为 3.3 个周期或高于 NTC 的 Cp 值的对数折叠。在这里，进行了从纯、10 到负 1、10 到负 2 和 10 到负 3 稀释的环境样品扩增。
纯样品未扩增，Cp 值从 10 到负 1 到 10 到负 3 稀释度分别为 24.12、26.02 和 28.40。如图所示，需要标准曲线描述符，包括 0.99 的 R 平方值和 90% 至 110% 范围内的 PCR 效率。在本实验中，NTC Cp 为 30.5，负 Cp 临界值为 27.2。
将基因丰度转换为每克湿重沉积物的稀释度，分别导致 10 到 7 的 2.5 倍和 7.1 倍 10 到 7 的稀释，对于 10 到负 1 和 10 到负 2 的稀释。10 到负 3 稀释度的 Cp 大于 NTC 临界值。在这种情况下，选择 10 比负 2 作为最佳模板稀释度。
在尝试此过程时，重要的是要记住 RNA 会迅速降解，因此将样品保存在冰上并始终戴手套以避免 RNase 污染非常重要。不要忘记我们正在使用苯酚：氯仿和石安醇，这可能非常危险。执行此程序时，应始终采取预防措施，例如穿着实验室外套、手套和防护眼镜以及在化学罩下工作。
看完这个视频，你应该对如何提取 DNA 和 RNA 以及量化海洋沿海沉积物中的基因和转录本丰度有很好的了解。请记住，该程序可以很容易地用于提取 DNA 和 RNA，并从大多数环境样本（包括土壤）中定量一系列基因靶标。
概述
本文介绍了一种用于通过实时PCR定量分析沿海沉积物中细菌16S rRNA基因和转录本的协议。该方法包括DNA和RNA的共同提取、无DNA RNA的制备以及通过RT-q-PCR进行定量分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物生态学
- 分子生物学
- 环境微生物学
背景
- 了解微生物的丰度和多样性对环境研究至关重要。
- 16S rRNA基因是微生物群落的关键指标。
- DNA和RNA的共同提取允许进行全面分析。
- 实时PCR是一种用于定量分析的敏感方法。
研究目的
- 开发一种可靠的沿海沉积物中提取和定量核酸的协议。
- 促进微生物群落的下游分子分析。
- 加强对海洋环境中微生物动态的理解。
使用的方法
- 从沉积物样品中共同提取DNA和RNA。
- 制备无DNA RNA以进行准确定量分析。
- 定量PCR用于测量16S rRNA基因和转录本。
- 构建标准曲线以提高定量分析的准确性。
主要结果
- 成功从沉积物样品中提取高质量的DNA和RNA。
- 展示了16S rRNA基因和转录本的定量分析。
- 该协议允许同时分析微生物多样性。
- 结果有助于了解沿海环境中的微生物生态学。
结论
- 开发的协议对研究微生物群落有效。
- 共同提取方法提高了分子分析的效率。
- 研究结果支持环境微生物学的进一步研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Simultaneous extraction of DNA and RNA from environmental matrices enables robust quantification of microbial gene abundance and activity, supporting early-stage target validation in microbiome-driven discovery. Real-time PCR quantification of 16S rRNA genes and transcripts provides high-confidence, quantitative readouts essential for mechanistic de-risking and comparative analysis across conditions. This workflow underpins predictive confidence in microbial community profiling, informing translational research and portfolio triage in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct quantification of microbial gene abundance and transcriptional activity from the same sample.
- Supports functional target validation by distinguishing between gene presence and expression.
- Facilitates mechanistic de-risking through quantitative assessment of microbial community shifts.
- Provides high-fidelity data for hypothesis-driven interrogation of environmental or disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Delivers validated nucleic acid templates for downstream qPCR and RT-qPCR workflows.
- Standardizes assay conditions with DNA and RNA standards and controls for reproducibility.
- Enables quantitative, scalable screening of microbial targets across multiple samples and dilutions.
- Supports reliable detection of low-abundance targets through sensitive fluorescence-based quantification.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microbial gene and transcript quantification with translational biomarker strategies when relevant.
- Ensures continuity from environmental sampling to preclinical model validation by preserving nucleic acid integrity.
- Reduces risk of false positives by integrating negative controls and Cp cutoff thresholds.
- Provides quantitative benchmarks for advancing microbial targets into preclinical evaluation.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from environmental sampling through target validation and assay development, supporting lead identification and translational research when microbial community dynamics are relevant.
- Discovery Biology: Quantitative PCR outputs enable hypothesis testing and pathway clarification in complex microbial systems.
- Screening: Standardized nucleic acid extraction and quantification protocols ensure assay readiness and reproducibility.
- Analytics: Cp values, standard curve descriptors, and efficiency metrics provide robust statistical outputs for condition comparison.
- Translational Research: Quantitative gene and transcript data support biomarker alignment and preclinical continuity when applicable.
- Enterprise Reuse: The protocol is adaptable for a range of gene targets and environmental sample types, supporting platform scalability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microbial target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable nucleic acid extraction and quantification workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of microbiome-driven programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of microbial targets and translational biomarker candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid extraction, qPCR assay setup, and data interpretation.
- Demands access to qPCR instrumentation, fluorescence detection, and analytical software.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of controls, dilutions, and cutoff thresholds.
- Adaptable to various environmental and biological sample types with protocol optimization.
- RNA integrity and contamination control are critical for reliable transcript quantification.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:52
DNA and RNA Extraction from Marine Coastal Sediments
3:23
Preparation of RNA and Quality Check of DNA-free RNA
5:30
Real-time PCR
8:21
Results: Quantification of 16S rRNA Genes and Transcripts by Simultaneous DNA-RNA Extraction and Real-time PCR
10:35
Conclusion
