Name: 快速扫描电子顺磁共振打开新的途径成像生理重要参数在体内 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 了解快速扫描电子顺磁共振成像技术，用于生物医学研究中定量检测氧气浓度、pH值和氧化还原状态。该方法比传统连续波技术更快获取数据，为肿瘤微环境研究开辟新途径。

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本研究工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 NIBIB EB002807 和 CA177744（GRE 和 SSE）以及授予 GRE、Howard J. Halpern（项目负责人）的 P41 EB002034 项目，以及丹佛大学的资助，特此致谢。Mark Tseytlin 获得了 NIH R21 EB022775、NIH K25 EB016040 和 NIH/NIGMS U54GM104942 的支持。作者感谢现就职于西弗吉尼亚大学的 Valery Khramtsov 和俄亥俄州立大学的 Illirian Dhimitruka 在合成 pH 敏感 TAM 自由基方面提供的帮助，以及马里兰大学的 Gerald Rosen 和 Joseph Kao 在合成 mHCTPO、proxyl、BMPO 和硝酰基自由基方面提供的帮助。

1. 250 MHz快速扫描线圈驱动器的设置
<ol>
	<li>快速扫描实验条件的计算 
	注意：RS-EPR 中最重要的参数是扫描速率 α，其为扫描频率与扫描宽度的乘积（公式 3）。对于较窄的扫描宽度，采用较快的扫描速率；而对于较宽的扫场范围，则采用较慢的扫描速率。以下步骤以较宽扫场范围的情况为例，说明如何确定实验中线圈驱动器的参数，即 7 mT 的扫场宽度和 6.8 kHz 的扫描频率。
	<ol>
		<li>确定谐振器带宽（BWRes). 
		<img alt="带宽计算公式与谐振频率和品质因数的关系。" src="/files/ftp_upload/54068/54068eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 1"> (1) 
		其中 vres 是谐振器的工作频率 Q 是品质因数。用于获取代表性结果数据的快速扫描谐振腔，其 Q 值通常为 90。</li>
		<li>确定快速扫描速率， α，由谐振器带宽所允许 <img alt="Alpha参数方程；光谱结果；带宽，分辨率计算公式" src="/files/ftp_upload/54068/54068eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 2"> (2) 
		<img alt="磁场方程：a = √3π(0.1 mT)(1.39 MHz)/5 = 150 T/s，公式计算，物理学" src="/files/ftp_upload/54068/54068eq3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 3"> 
		 
		其中 N 是一个常数，通常保守地选取为5-6， ΔBpp 是峰-峰导数线宽，单位为 mT，且 a 若线型为洛伦兹线型，则扫描速率为 T/s。 
		注意：代表性部分中自由基的常见取值为 <img alt="物理方程中用于分析B场偏移的Delta B_pp符号。" src="/files/ftp_upload/54068/54068eq4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程 4"> = 0.1 mT。与早期快速扫描文献相比，公式2是通过设定信号带宽（BW）信号) 等于体重（BW）Res.</li>
		<li>根据速率确定允许的最大快速扫描频率。 
		<img alt="转动运动方程 a=πwf，用于说明物理学中的角频率。" src="/files/ftp_upload/54068/54068eq5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 5"> (3) 
		<img alt="磁场方程 150 T/s=π(7 mT)f，阐释了电磁学概念。" src="/files/ftp_upload/54068/54068eq6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 6"> 
		其中 w 是扫描的宽度 f 是扫描频率。对于当前使用的探头，7 mT 的扫描宽度将覆盖整个谱图的 100% 体内使用该值和（公式2）中计算出的速率来确定扫描频率。 
		<img alt="频率计算公式，f=150T/s/(π(7mT))=6.8kHz，电磁分析。" src="/files/ftp_upload/54068/54068eq7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程 7"></li>
	</ol>
	</li>
	<li>调谐电容器的选择与快速扫描线圈驱动器的调谐 
	注意：快速扫描线圈驱动器通常在谐振模式下运行，产生正弦波。当感抗与容抗大小相等、符号相反，使得总电抗接近零时，即发生谐振，此时的扫描频率称为谐振频率。
	<ol>
		<li>根据1.1.3中确定的频率，利用电感值计算合适的电容。 L快速扫描线圈的，以及（公式4）。 
		<img alt="电容公式 \( C_{TOT} = \frac{1}{L(2\pi f)^2} \) 方程示意图，电子学研究" src="/files/ftp_upload/54068/54068eq8.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程 8"> 
		<img alt="静态平衡公式，\(C_{TOT}=4.8 \, \text{mF}\)，用于电路分析，电气工程。" src="/files/ftp_upload/54068/54068eq9.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 9"></li>
		<li>分割 CTOT 根据（公式 4）将数值减半，以确定线圈驱动电容箱每侧的电容值。 
		<img alt="电容公式，\(C_1 = C_2 = \frac{C_{TOT}}{2}\)，用于电路分析中的方程。" src="/files/ftp_upload/54068/54068eq10.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程 10"> 
		<img alt="并联电容器公式计算，C1=C2=4.8 mF/2=2.4 mF，电路概念。" src="/files/ftp_upload/54068/54068eq11.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程 11"> 
		注意：快速扫描线圈驱动器有两个放大器。选择电容器时，电容箱两侧需用相等的电容进行平衡。两侧为串联连接。</li>
		<li>拧下电容器盒的顶盖，并在两侧插入与步骤 1.2.2 中确定的数值相等的电容器。</li>
		<li>更换电容器盒的顶盖并拧紧螺丝，以确保其固定到位。</li>
		<li>使用谐振线圈驱动器的前面板，调节输出频率，直至正弦波形达到最大振幅。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 试剂与仿体的制备
<ol>
	<li>自由基的制备
	<ol>
		<li>从冷冻箱中取出15N-PDT，并让容器恢复至室温（10–15 分钟）。</li>
		<li>使用分析天平称取 1.4 mg 的15N-PDT。</li>
		<li>将 1.4 mg 的15N-PDT 加入 15 ml 去离子（DI）H2O 中，终浓度为 0.5 mM。 
		注：15N-PDT（4-氧代-2,2,6,6-四（2H3）甲基-1-(3,3,5,5-2H4,1-15N)哌啶氮氧自由基）、15N-mHCTPO（4-1H-3-羰氨甲基-2,2,5,5-四（2H3）甲基-3-吡咯啉氮氧自由基）和15N-Proxyl（3-羧基-2,2,5,5-四（2H3）甲基-1-(3,4,4-2H3,1-15N)吡咯烷氮氧自由基）25（图 1E–G）在水溶液中和室温下具有长期稳定性（2 年）。其固态形式通常保存在冷冻箱或冰箱中，以维持多年的稳定性。氮氧自由基的稳定性通常使其无毒，当溶剂为水时，可在普通实验台面上进行配制。若使用有机溶剂，则应在通风橱内操作，并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>pH 敏感型三苯甲基自由基的制备
	<ol>
		<li>称取 0.7 mg 三芳基甲基自由基（aTAM4）26（分子量 1,400 g/mol），溶于 200 µl 无水乙醇中。</li>
		<li>称取 0.00681 g KH2PO4（分子量 136.1 g/mol），溶于 50 ml 去离子水中，终浓度为 1 mM。</li>
		<li>称取 2.8 g KOH（分子量 56 g/mol），溶于 50 ml 去离子水中，终浓度为 1 M。</li>
		<li>逐滴加入 KOH 至磷酸盐缓冲液（步骤 2.2.2）中，调节 pH 至 7.0。</li>
		<li>加入 800 µl 1 mM 磷酸盐缓冲液和 200 µl 溶于无水乙醇的 aTAM4，终浓度为 0.5 mM，溶剂比例为 80:20 缓冲液:乙醇。</li>
		<li>重复步骤 2.2.1–2.2.5，制备 pH = 7.2 的 aTAM4 样品。</li>
		<li>将 aTAM4（pH = 7.0）和 aTAM4（pH = 7.2）分别装入两个独立的 6 mm 石英样品管中。</li>
		<li>将两个 6 mm 石英电子顺磁共振（EPR）管放入一个 16 mm 石英 EPR 管中，中间用 2 mm 厚的泡沫塑料隔开。 
		注：石英样品管管壁厚度为 0.5 mm，加上 2 mm 隔片，使两个 aTAM 样品之间保持 3 mm 的间距。所用的 pH 敏感型三苯甲基自由基由俄亥俄州立大学合成26，用于成像的示例为 aTAM4。其 pH 敏感反应如图 1A所示。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>BMPO-OH 的生成
	<ol>
		<li>称取 680 mg KH2PO4，溶于 100 ml 去离子水中，终浓度为 50 mM。</li>
		<li>逐滴加入 1 M KOH 至磷酸盐缓冲液中，调节 pH 至 7.3。</li>
		<li>称取 50 mg BMPO（分子量 199.25 g/mol）。</li>
		<li>将 50 mg BMPO 与 5 ml 磷酸盐缓冲液混合，置于 16 mm 石英辐照管中。</li>
		<li>加入 100 µl 300 mM 过氧化氢。</li>
		<li>使用中压 450 W 紫外灯对 16 mm 石英辐照管中的混合物辐照 5 分钟。</li>
		<li>使用玻璃移液管，将 2.5 ml 辐照后的 BMPO-OH 溶液从石英辐照管转移至带有 3 mm 分隔的 16 mm 石英样品管的一侧。</li>
		<li>将剩余的 2.5 ml 辐照后 BMPO-OH 溶液转移至该 16 mm 石英样品管的另一侧。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>二硝基自由基的制备
	<ol>
		<li>称取 24.7 mg 2H,15N-二硫化物二硝基自由基（图 1C），溶于 1 ml DMSO 中，配制成 47.5 mM 的储备液。</li>
		<li>配制 10 mM Tris 缓冲液，并调节 pH 至 7.2。</li>
		<li>取 40 µl 二硝基自由基储备液，用 Tris 缓冲液稀释至终浓度为 1 mM。</li>
		<li>将 250 µl 缓冲液中的二硝基自由基溶液加入中心带有 10 mm 分隔的 16 mm 石英样品管中。</li>
		<li>称取 154 mg 谷胱甘肽，加入 5 ml Tris 缓冲液中，终浓度为 100 mM。</li>
		<li>取 5 µl 100 mM 谷胱甘肽溶液，加入 10 mm 分隔一侧的 250 µl 1 mM 二硝基自由基溶液中，将双自由基转化为单自由基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>亚硝基硝基自由基的制备
	<ol>
		<li>从冷冻箱中取出自由基，并让容器恢复至室温（10–15 分钟）。</li>
		<li>称取 1.9 mg 亚硝基硝基自由基（分子量 390 g/mol）。</li>
		<li>称取 0.56 mg KOH，溶于 10 ml 去离子水中，终浓度为 1 mM。</li>
		<li>将 1.9 mg 亚硝基硝基自由基加入 10 ml 1 mM KOH 溶液中，终浓度为 0.5 mM。 
		注：如有需要，可使用涡旋振荡器或超声仪加速亚硝基硝基自由基的溶解。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 250 MHz 快速扫描仪器的设置
注意：使用硝基氧化物自由基的水溶液对谐振器进行调谐（其对谐振器Q值和调谐的影响与缓冲液相似），是为待成像样品进行系统设置的有效方法
<ol>
	<li>使用含氮氧自由基的水溶液样品调节谐振器。
	<ol>
		<li>将15 ml浓度为0.5 mM的水溶液样品（含15N-PDT）装入一支16 mm石英EPR管中。</li>
		<li>将石英管插入交叉环路RS-EPR谐振器的检测端。</li>
		<li>调节仪器源的频率，使其与含有样品的检测端频率一致。通过软件输入所需数值，手动调节250 MHz源的载波频率。</li>
		<li>调节激发端的频率，使其与实验源和谐振器检测端的频率相匹配。根据制造商的操作规程，调节谐振腔内的可变电容器来改变激发端的频率。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置仪器控制台和主磁体
	<ol>
		<li>开启波谱仪，并选择一个以时间为横坐标的瞬态数据记录实验。</li>
		<li>在软件中设置采样点数为65,536，时间基线为10 nsec。</li>
		<li>对于强信号或窄线信号，设置累加次数为10,000；对于宽线信号或弱信号，设置累加次数为45,000。</li>
		<li>在软件中按下“engage”按钮，将实验参数从软件发送至控制台，并启动主磁场磁体。</li>
		<li>将主磁场强度设为9 mT。</li>
		<li>将功率衰减旋钮设为50 dB，并开启7 W的高功率放大器。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 快速扫描实验的执行
注意：有关含BMPO-OH24、pH敏感型TAM自由基19,27和氧化还原敏感型二硝基氧化物28的模型样品分析的具体说明，已在相关文献中提供。
<ol style="margin-left: 40px;">
	<li>标准硝基氧化物样品的功率饱和 
	注意：在相同的实验条件下，对标准的氮氧自由基样品进行功率饱和曲线测定，有助于后续对pH或氧化还原状态敏感的自由基进行检测。
	<ol>
		<li>打开快速扫描线圈驱动器，设置参数为第1节中的数值（扫描频率6.8 kHz，扫描宽度7 mT）。</li>
		<li>从 50 dB 开始，采集具有 100,000 次平均的快速扫描谱图。将衰减降低 3 dB 后重复测量。持续进行，直至衰减器设置为 0 dB，或直至电桥读数中的隔离测量值达到 &lt; 0.</li>
		<li>将原始快速扫描数据导入反卷积程序（例如使用Matlab编写的程序），并将原始数据处理为吸收光谱。</li>
		<li>输入扫描频率、扫描宽度、数据点数和时基至程序中，并运行程序以将原始快速扫描信号处理为吸收信号。</li>
		<li>将吸收信号的幅度作为入射到谐振器上的功率平方根（单位：瓦特）的函数进行绘图。在非饱和 regime 下，信号幅度与入射功率的平方根呈线性关系。</li>
		<li>从 (0,0) 开始拟合一条趋势线，并包含所有落在线性响应区域内的数据点。在线性响应区域内，信号幅度随微波功率的平方根成正比增加。</li>
		<li>将该趋势外推至更高功率，并比较电子顺磁共振（EPR）信号强度。选择信号幅度与外推趋势线偏差不超过3%的最高功率。为了确保快速扫描信号的解卷积能够正常进行，信号仍须处于相对于入射功率的线性响应区域。 
		注意：原始快速扫描数据的传输可通过网络连接或U盘进行。在此情况下，数据传输是必要的，因为用于处理原始数据的程序（Matlab）并未安装在运行数据采集软件的同一台计算机上。用于处理原始数据的解卷积算法在下文中有所描述。 29.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bobko, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+monitoring+of+pH%2C+redox+status%2C+and+glutathione+using+L-band+EPR+for+assessment+of+therapeutic+effectiveness+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors.</a> Magn. Reson. Med. 67 (6), 1827-1836 (2012).</li>
<li>Utsumi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+molecular+imaging+of+redox+reactions+monitored+by+overhauser-enhanced+MRI+with+14N-and+15N-labeled+nitroxyl+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Simultaneous molecular imaging of redox reactions monitored by overhauser-enhanced MRI with 14N-and 15N-labeled nitroxyl radicals.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1463-1468 (2006).</li>
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<li>Redler, G., Barth, E. D., Bauer, K. S., Kao, J. P. Y., Rosen, G. M., Halpern, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electron+paramagnetic+resonance+imaging+of+differential+tumor+targeting+using+cis-3%2C4-di%28acetoxymethoxycarbonyl%29-2%2C2%2C5%2C5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxyl%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo electron paramagnetic resonance imaging of differential tumor targeting using cis-3,4-di(acetoxymethoxycarbonyl)-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxyl.</a> Magn. Reson. Med. 71 (4), 1650-1656 (2013).</li>
</ol>

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快速扫描信号相较于连续波（CW）信号具有更高频率的组分，其所需的谐振器带宽更大，具体取决于谱线宽度、弛豫时间以及快速扫描的速度。特定实验所需的带宽由谱线宽度和磁场扫描速率共同决定（公式2）。该带宽需求还取决于所研究探针的弛豫时间（T2 和 T2*），且扫描速率较快时，信号的拖尾部分可能出现振荡。对于具有 T 的氮氧自由基2 ~500 纳秒，250 MHz（57th 落基山磁共振会议，Epel B 等，2015年），实验扫描速率通常不足以观察到任何振荡现象。
实验带宽通常受限于谐振腔带宽。快速扫描实验的每个半周期均在磁场/频率递减或递增的情况下记录，因此实验带宽为谐振腔带宽的½，如（公式1）所示。如果由于参数选择导致实验带宽超过谐振腔带宽，并且振荡被阻尼，则反卷积谱线将出现展宽。由于实验带宽由所研究自由基的扫描速率和线宽决定，因此理解这些特性是快速扫描实验的关键组成部分。
本方案展示了在250 MHz下对含有对氧气、黏度、p...

与其他医学成像方式相比，电子顺磁共振成像（EPRI）能够 uniquely 定量成像包括 pH 在内的生理特性1-3pO24-7温度8组织的灌注与活性9微粘度及小分子扩散的难易程度10 和氧化应激11谷胱甘肽（GSH）在组织和细胞中裂解二硫键难易程度的评估12,13 可报告氧化还原状态。对于 体内 成像，选择250 MHz至1 GHz频率范围内的电子顺磁共振（EPR），因为这些频率能够提供足够的组织穿透深度（可达数厘米），从而在小动物中生成图像，且信号强度不会因介电损耗效应而显著减弱。更高的频率，例如9.5 GHz14 （X波段）和17 GHz（Ku-带15,16 可用于皮肤和毛发或单个细胞的成像。电子顺磁共振成像在所有频率下的成功应用均依赖于针对组织特异性的顺磁性自旋探针，以便对其位置和去向进行成像。
如果电子自旋探针所处的环境在空间上具有异质性，则电子顺磁共振（EPR）谱是来自所有位置贡献的总和。谱-空间成像将样品的体积划分为一系列微小的空间单元，并计算每个单元的EPR谱17。这使得可以通过测量EPR谱在空间上的变化来描绘局部环境的分布。利用磁场梯度将空间信息编码到EPR谱中，这些编码后的谱称为投影。谱-空间图像由这些投影重建而成18,19。
在快速扫描电子顺磁共振（RS-EPR）中，磁场在相对于电子自旋弛豫时间较短的时间内扫描通过共振点（图2）20,21。对快速扫描信号进行解卷积可得到吸收谱，该吸收谱等同于传统的一阶导数连续波（CW）谱的一阶积分。快速扫描信号采用正交检测，因此可同时测量自旋系统响应的吸收分量和色散分量，这实质上相当于单位时间内采集了两倍的数据量。在快速扫描实验中，信号饱和发生的功率高于连续波方法，因此可使用更高功率而无需担心饱和问题20,22。与连续波相比，单位时间内可进行更多次信号平均。更高的微波功率、直接正交检测以及单位时间内更多的信号平均次数共同使快速扫描具有更优的信噪比（SNR），尤其是在决定空间分辨的高梯度投影条件下，从而获得更高品质的图像。为获得一个模型样品图像相近的信噪比，连续波所需时间约为快速扫描的10倍23。
信噪比的提高还使得在250 MHz下对OH与5-叔丁氧羰基-5-甲基-1-吡咯啉反应生成的低浓度自旋捕获加合物进行实验成为可能N-氧化物（BMPO-OH），该物质在连续波方法中无法被检测到24二硝基氧化物通过二硫键连接，可被谷胱甘肽裂解，因此可用于报告细胞内的氧化还原状态。其双自由基与单自由基形式之间存在依赖于谷胱甘肽浓度的平衡。观察这些变化需要采集整个宽度为5 mT的谱图，而快速扫描电子顺磁共振（EPR）技术相比连续波（CW）实验中逐点扫描磁场的方式，可显著加快数据采集速度。
一个完整的快速扫描系统由四个部分组成：光谱仪、主磁场磁体、快速扫描线圈驱动器和快速扫描交叉环谐振器。光谱仪和主磁场磁体的功能与连续波（CW）实验中的相同，用于设定主塞曼磁场并从谐振器收集数据。快速扫描线圈驱动器产生正弦扫描电流，并输入到快速扫描交叉环谐振器上特制的快速扫描线圈中。快速扫描交叉环谐振器上的快速扫描线圈产生一个大而均匀的磁场，该磁场以3至15 kHz之间的频率进行扫描。

<table><tbody><tr><td>4-氧代-2,2,6,6-四(&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)甲基-1-(3,3,5,5-&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;H&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;,1-&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N)哌啶基氮氧自由基 (&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N-PDT)</td><td>CDN Isotopes&amp;nbsp;</td><td>M-2327</td><td>98% 原子 &lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N，98% 原子 D，魁北克，加拿大</td></tr><tr><td>4-&lt;sup&gt;1&lt;/sup&gt;H-3-氨基甲酰基-2,2,5,5-四(&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)甲基-3-吡咯烷基氮氧自由基 (&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N-mHCTPO)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>在美国马里兰大学合成，详见参考文献29</td></tr><tr><td>3-羧基-2,2,5,5-四(&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)甲基-1-(3,4,4-&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;,1-&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N)吡咯烷基氮氧自由基 (&lt;sup&gt;15&lt;/sup&gt;N-Proxyl)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>在美国马里兰大学合成，详见参考文献25</td></tr><tr><td>4 mm 石英 EPR 管</td><td>Wilmad Glass</td><td>707-SQ-100M</td><td></td></tr><tr><td>4-氧代-2,2,6,6-四(&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)甲基-1-(3,3,5,5-&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;H&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)哌啶基氮氧自由基 (&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;N-PDT)</td><td>CDN Isotopes</td><td>D-2328</td><td>98% 原子 D，魁北克，加拿大</td></tr><tr><td>pH 敏感三苯甲基自由基 (aTAM&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>俄亥俄州立大学</td><td>N/A</td><td>在俄亥俄州立大学合成，详见参考文献26</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>J.T. Baker Chemicals</td><td>1-3246</td><td></td></tr><tr><td>6 mm 石英 EPR 管</td><td>Wilmad Glass</td><td>Q-5M-6M-0-250/RB</td><td></td></tr><tr><td>8 mm 石英 EPR 管</td><td>Wilmad Glass</td><td>Q-7M-8M-0-250/RB</td><td></td></tr><tr><td>5-叔丁氧羰基-5-甲基-1-吡咯啉-&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-氧化物 (BMPO)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>在美国马里兰大学合成，详见参考文献30</td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>H1009 SIGMA</td><td>30%</td></tr><tr><td>16 mm 石英 EPR 管</td><td>Wilmad Glass</td><td>16-7PP-11QTZ</td><td></td></tr><tr><td>中压 450 W 紫外灯</td><td>Hanovia</td><td>679-A36</td><td>新泽西州费尔菲尔德</td></tr><tr><td>L-谷胱甘肽（还原型）</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>G470-5</td><td></td></tr><tr><td>亚硝基</td><td>NA</td><td>N/A</td><td>在美国马里兰大学合成，详见参考文献31</td></tr><tr><td>氢氧化钠&amp;nbsp;</td><td>J.T. Baker Chemicals</td><td>1-3146</td><td></td></tr></tbody></table>

快速扫描电子顺磁共振为生理重要参数的成像开辟了新途径 体内

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

我们展示了一种在250 MHz下利用快速扫描电子顺磁共振（RS-EPR）对稳定自由基报告分子进行二维光谱-空间成像的优越方法，该方法可在 体内 氧气浓度、pH、氧化还原状态及信号分子浓度的条件即， OH•，一氧化氮•RS-EPR 技术相比标准的连续波（CW）技术具有更高的灵敏度、更优的空间分辨率（1 mm）以及更短的采集时间。已测试多种模体构型，其空间分辨率范围为 1 至 6 mm，报告分子的谱宽范围为 16 µT（160 mG）至 5 mT（50 G）。交叉环双模谐振器实现了激发与检测的解耦，降低了噪声；同时，快速扫描效应允许在饱和前向自旋系统输入更多功率，从而增强 EPR 信号。这使得信噪比显著高于传统的 CW EPR 实验。

实验的产物是一组投影数据，这些数据被重建为二维图像（一个为光谱维度，一个为空间维度），并采用伪彩色标度来表示信号强度。深蓝色表示基线，即无信号区域；绿色表示低强度信号，红色表示最高强度信号。沿x轴（光谱维度）的切片在磁场轴上显示电子顺磁共振信号（EPR跃迁）；沿y轴（空间维度）的信号间距对应于谐振器中样品之间的实际物理空间距离。
图3展示了使用连续波（图3B）或快速扫描（图3A）方法对含有三种不同类型15N标记的氮氧自由基的模体所获得的两幅图像的比较（图3D）。其中谱线最宽的信号来自15N-Proxyl，这是一种在生理pH下带负电荷的五元吡咯烷环结构，可能有助于将分子靶向特定的细胞区室。双重峰信号属于15N-mHCTPO，其产生原因是分子中除一个氢原子外...

一种新的电子顺磁共振（EPR）方法——快速扫描EPR（RS-EPR）被用于二维光谱空间成像，该方法优于传统的连续波（CW）技术，并为相关研究开辟了新的途径 体内 成像。结果在250 MHz下展示，但该技术适用于任何频率。

我们展示了一种在250 MHz下利用快速扫描技术对稳定自由基报告分子进行二维光谱-空间成像的优越方法...

快速扫描电子顺磁共振成像（RSEPRI）的总体目标是提供关于氧浓度、pH值、氧化还原状态以及信号分子浓度的定量信息，这些信息对生物医学研究具有重要价值。EPRI是一种可用于回答癌症研究中有关肿瘤微环境关键问题的工具。快速扫描EPR成像的主要优势在于，与连续波（CW）EPR成像相比，它能够在更短的时间内获取更多信息，并可使用更广泛的探针分子。对氧化还原状态或 pH 值敏感的分子是快速扫描电子顺磁共振成像（EPRI）技术优势的典型示例。开始本实验前，需根据文本方案中的说明计算快速扫描的实验条件。快速扫描技术的一个关键点是理解信号对谐振器带宽以及扫描频率范围等实验条件的依赖性。为了真正优化实验，您需要理解这三个方面。快速扫描线圈驱动器包含两个放大器。在选择电容器时，电容箱需要在箱体两侧保持相等的电容以实现平衡。两侧串联。拧下电容器盒的顶盖，在两侧插入等于确定值的电容器。重新装上电容器盒的顶盖并拧紧，以确保其固定牢固。使用谐振线圈驱动器的前面板，调节输出频率，直至正弦波形达到最大振幅。为制备自由基，从冷冻柜中取出N-15 PDT，并让容器恢复至室温。使用分析天平称取1.4毫克的N-15 PDT。将1.4毫克N-15 PDT加入15毫升去离子水中，得到终浓度为0.5毫摩尔的溶液。接下来，将50毫克BMPO与5毫升水混合于16毫米石英辐照管中，再加入100微升300毫摩尔的过氧化氢。使用中压450瓦紫外灯，将16毫米石英辐照管中的混合物照射五分钟。用玻璃移液管将2.5毫升经辐照的BMPO-OH溶液从石英辐照管中转移至带有3毫米隔板的16毫米石英样品管的一侧。再将剩余的2.5毫升经辐照的BMPO-OH溶液转移至该石英样品管另一侧的隔板中。第二个关键步骤是理解功率饱和曲线。随着扫描速率的增加，在信号达到饱和之前，可以达到更高的功率和更大的信号幅度。更大的信号幅度是缩短采集时间的另一种方法。首先，将15毫升浓度为0.5毫摩尔的水溶液N-15 PDT（氮-15标记的吡咯啶自由基）注入16毫米石英电子顺磁共振管中，然后将其插入交叉环快速扫描电子顺磁共振（RSEPR）谐振器的检测端，以含硝roxide自由基的水样调节谐振器。调节仪器源的频率，直至其与含有样品的检测端频率相匹配。现在，调节激发端的频率，使其与谐振器的实验源频率和检测端频率相匹配。通过调节谐振腔内的可变电容器来改变激发端的频率。为设置仪器控制台和主磁体，请开启波谱仪，并选择一个以时间作为横坐标的瞬态数据记录实验。在相同的实验条件下，对标准的氮氧自由基样品进行功率饱和曲线测定，这些条件将用于检测对pH或氧化还原状态敏感的自由基。系统设置完成后，通过手动或计算机程序施加梯度，以进行成像实验。电子顺磁共振（EPR）信号强度与谐振腔中的微波场强成正比，该微波场促使自旋从一个能级跃迁至下一个能级。该微波场被称为B1。B1与微波功率的平方根成正比。当微波功率增至四倍时，B1加倍。在本图中，功率从8毫瓦增至32毫瓦（四倍），B1则从18毫高斯增至36毫高斯（加倍）。通过绘制相对振幅与微波功率平方根的关系，或在已知谐振腔效率的情况下绘制与B1的关系，可以构建功率饱和曲线。该曲线上呈线性的区域表明电子顺磁共振（EPR）信号未发生饱和或畸变的功率范围。快速扫描实验的一个优势在于，与用黑色圆点表示的传统连续波（CW）实验相比，其线性功率范围得到扩展，如图中彩色圆点所示。此处展示的是由浓度为5 µM、相距三毫米的BMPO-OH加合物构成的模型样品的二维光谱空间图像。图像的一个切片显示了在 250 兆赫时的谱线形状。该图像显示了 N-14 亚硝酰基自由基，可用于在体模中捕获一氧化氮，其中两个样品室由一个 1.5 毫米厚的壁分隔。此处展示了在 250 兆赫时的谱线形状。磷酸盐缓冲液的 pH 为 7.0 或 pH 为 7.4 时，pH 敏感性三芳基甲基自由基的二维图像反映了其光谱特征的差异。该图像显示了含有 10 毫米隔片的双室模型中 N-15 二硝基氧化物的分布。初始状态下，两个室均含有 0.5 毫摩尔的探针。将谷胱甘肽加入二硝基氧化物后，会断裂还原型连接区域，生成两个单硝基氧化物，这一变化在二维图像中得以体现。快速扫描电子顺磁共振（EPR）技术的发展彻底改变了我们研究含未成对电子分子的能力。今天您已看到其在活体EPR中的应用，但它在低温下研究含金属化合物以及其他多种体系方面也具有广阔的应用前景。对于我们迄今为止研究的所有样品，信号噪声比至少提高了一个数量级，有时甚至更高。

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生物工程

快速扫描电子顺磁共振打开新的途径成像生理重要参数<em&gt;在体内</em

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采用可溶性硝酰基和三苯甲基探针，利用低场（L波段，1.2...

体内 EPR 评估肿瘤微环境中的 pH、pO2、氧化还原状态以及磷酸盐和谷胱甘肽浓度

本文描述了获取去垢剂溶解的TRPV1生化量以进行光谱分析的具体方法。这些联合方案提供了生物化学和生物物理工具，可经适当调整后用于在膜环境可控条件下开展哺乳动物离子通道的结构与功能研究。...

用于光谱分析的TRPV1纯化与重组

受激拉曼散射（SRS）显微技术能够基于特定化学键的固有振动，实现对生物分子的无标记成像。本实验方案描述了一种集成式受激拉曼散射与双光子荧光显微镜的仪器装置，用于在活体小鼠脊髓中可视化细胞结构。...

体内 生物组织成像：双光子荧光与受激拉曼散射显微技术结合

我们介绍一种利用氘代水（重水...

芳香族氨基酸调控的细胞代谢生物正交化学成像

采用脉冲电子顺磁共振技术对小鼠肿瘤的定量三维氧分布图进行了无创成像。利用超声B型成像和能量多普勒成像获取解剖结构和血管结构信息。将两种模态的图像叠加，实现多参数肿瘤分析。...

肿瘤缺氧评估：通过电子顺磁共振进行体内三维氧成像

利用结合无标记光学成像模式的多模态平台，我们开发了一种用于可视化和定量分析细胞动态与代谢的方案。通过多光子荧光、二次谐波生成和受激拉曼散射显微成像，我们能够获得细胞和分子环境的整体概览。...

用于研究细胞代谢的多模态光学成像平台

了解快速扫描电子顺磁共振成像技术，用于生物医学研究中定量检测氧气浓度、pH值和氧化还原状态。该方法比传统连续波技术更快获取数据，为肿瘤微环境研究开辟新途径。

快速扫描电子顺磁共振为生理重要参数的成像开辟了新途径体内

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