Name: 使用IL-1β启动子驱动的红色荧光蛋白记者小鼠中性粒细胞引发的活体成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 学习利用荧光报告基因、体内标记和活体成像技术监测小鼠中性粒细胞活化过程。该方法结合三种成熟技术，可实时可视化中性粒细胞在免疫反应中的动态行为，为罕见疾病研究提供新工具。

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作者没有致谢。

所有动物实验均按照美国国立卫生研究院的指南进行，并经托莱多大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. pIL1-DsRed 小鼠的表型分析
注意：后代小鼠通过将杂合子 pIL1-DsRed 小鼠与野生型（WT）C57BL6 小鼠交配获得。3 至 4 周龄的幼鼠即可用于表型分析。小鼠下颌下出血操作遵循已有方案，仅作轻微修改23。
<ol>
	<li>从小鼠幼崽全血中分离白细胞
	<ol>
		<li>向每个 1.5 ml 微量离心管中加入 20 µl 肝素。</li>
		<li>从笼中取出一只幼崽，记录幼崽的标识标签。采集下颌静脉血液前无需对幼崽进行麻醉。</li>
		<li>抓住幼崽颈部皮肤，使用 5 mm 采血针刺穿颊囊中的下颌静脉。施加适当力度形成小穿刺口，使血液从穿刺点渗出成滴。每只幼崽使用新的采血针。</li>
		<li>将每只幼崽的 3–5 滴血液收集至含肝素的微量离心管中。清洁穿刺部位并施加压力以促进止血。</li>
		<li>将幼崽放入新笼中，观察 30 分钟后再送回动物房。</li>
		<li>采集已知表型的成年小鼠血液作为阳性和阴性对照。</li>
		<li>向每管中加入 500 µl 红细胞裂解缓冲液，涡旋混匀，并在冰上孵育 5–10 分钟。</li>
		<li>在每管细胞悬液下方缓慢加入 400–500 µl 胎牛血清（FBS）。可在上层细胞悬液与下层 FBS 之间观察到清晰的界面。</li>
		<li>盖紧管盖，以 1,500 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>重复步骤 1.1.7–1.1.9 以进一步去除红细胞。若首次裂解已充分，则无需重复。离心后沉淀应难以辨识。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脂多糖（LPS）刺激与培养
	<ol>
		<li>用 200 µl 完全 Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640 培养基重悬细胞。</li>
		<li>将细胞悬液转移至流式细胞仪检测管中。</li>
		<li>通过将 10 µl LPS 储存液（1 mg/ml）与 990 µl 完全 RPMI 1640 培养基混合，配制 LPS 工作液。</li>
		<li>向 200 µl&#160;细胞悬液中加入 20 µl 10 µg/ml 的 LPS 工作液。</li>
		<li>管盖稍松，于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 4 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>流式细胞术分析
	<ol>
		<li>打开流式细胞术数据采集程序。在采集样本前设置好采集模板。</li>
		<li>点击工具面板中的“点图”工具，绘制前向散射光（FSC）对侧向散射光（SSC）的散点图。将 FSC 和 SSC 的电压参数设置为线性刻度。</li>
		<li>选择流式细胞仪允许的 FSC 和 SSC 最低阈值。分别将 FSC 和 SSC 的阈值设为 200 和 50。</li>
		<li>在 FSC 对 SSC 的散点图中绘制门控 G1，包含单核细胞、粒细胞和树突状细胞，排除碎片、红细胞和淋巴细胞。</li>
		<li>点击工具面板中的“直方图”工具，绘制 FL2（红色荧光通道）直方图。使用阴性对照样本设定 FL2 信号基线，使用阳性对照样本绘制门控以包含所有 DsRed 阳性事件。</li>
		<li>在流式细胞仪的流体控制面板上，将流体模式设为 &#34;RUN&#34;，流速设为 &#34;HI&#34;（约 60 µl/min）。每样本采集 10,000 个事件。</li>
		<li>通过测量 G1 门控内 DsRed 阳性细胞的百分比确定幼崽表型。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 在pIL1-DsRed小鼠中诱导皮肤炎症
<ol>
	<li>通过腹腔（i.p.）注射麻醉剂混合物麻醉小鼠，混合物包含 100 mg/kg 氯胺酮、10 mg/kg 赛拉嗪和 1 mg/kg 乙酰丙嗪。充分麻醉的小鼠在脚趾夹捏时不会出现后肢回缩反应。</li>
	<li>将脱毛膏涂抹于小鼠双耳的背侧表面，等待 30 秒至 1 分钟。用蘸水的棉签擦拭耳部表面，并使其自然风干。</li>
	<li>使用千分尺测量耳部厚度，并将小鼠放回单独的笼子中。观察直至其从麻醉中恢复（约 15–30 分钟）。为消除脱毛产品引起的皮肤炎症，需让小鼠休息 3 天后再进行后续实验。</li>
	<li>通过将 16.7 mg OX 溶解于 1 ml 丙酮中，再取 750 µl OX/丙酮溶液与 250 µl 橄榄油混合，配制 1.25%（w/v）的 OX 溶液。通过将 750 µl 丙酮与 250 µl 橄榄油混合，制备对照溶剂溶液。</li>
	<li>再次通过腹腔注射麻醉剂混合物（2.1）对小鼠进行麻醉。&#160;按之前方法测量耳部厚度。</li>
	<li>在右耳的两侧各涂抹 12.5 µl 的 1.25% OX 溶液。在左耳的两侧各涂抹 12.5 µl 的丙酮/橄榄油对照溶剂溶液。</li>
	<li>在小鼠完全恢复前，将其与同笼小鼠隔离，以防止其他小鼠对其耳部造成损伤，之后将小鼠放回原笼并送回动物饲养设施。 
	注意：脱毛可能导致轻微皮肤炎症，并伴随耳部厚度变化。该轻微炎症在 3 天后消退，耳部厚度恢复正常。局部给药 24 小时后，OX 处理的耳部相较于仅使用对照溶剂的耳部表现出显著肿胀（p &#60; 0.01）。</li>
</ol>
3. pIL1-DsRed 小鼠中中性粒细胞的标记
注意：体内通过低剂量荧光标记的中性粒细胞特异性单克隆抗体对中性粒细胞进行标记，遵循最近建立的方案19。眶后注射操作根据已有方案进行，仅作少量修改24。
<ol>
	<li>将10 µl浓度为0.5 mg/ml的Alexa Fluor 647标记抗Ly6G单克隆抗体（克隆号1A8）用90 µl磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，配制成抗Ly6G单抗工作液。</li>
	<li>取100 µl抗Ly6G单抗工作液（50 µg/ml）加入一支带有28号针头的U-100胰岛素注射器中。</li>
	<li>通过腹腔注射前述麻醉剂混合液（2.1）对成年pIL1-DsRed小鼠进行麻醉。将麻醉后的小鼠腹部朝下置于洁净的操作板上。</li>
	<li>对一只小鼠眼睛的背侧和腹侧皮肤施加轻柔向下的压力，使眼球部分突出于眼窝外。</li>
	<li>将针头斜面朝下，以约30°角从内眦插入眶后窦。 
	注意：当针头进入窦腔时，操作者可感受到压力、穿透感及阻力突然减轻。</li>
	<li>缓慢而平稳地向小鼠体内注射100 µl抗Ly6G单抗工作液（每只小鼠每次注射含5 µg单抗）。迅速拔出针头。少量出血提示注射成功。</li>
	<li>立即在小鼠左右耳分别涂抹1.25% OX及溶剂对照溶液。</li>
	<li>8小时后，通过眶后静脉注射向同一只小鼠给予100 µl freshly prepared的抗Ly6G单抗工作液（每只小鼠每次注射含5 µg单抗）。</li>
	<li>为观察血管结构，在成像前立即通过眶后静脉注射100 µl新鲜配制的30 mg/ml异硫氰酸荧光素（FITC）标记葡聚糖（150 kDa）。</li>
</ol>
4. 在pIL-1-DsRed小鼠中对中性粒细胞活化的活体成像
<ol>
	<li>通过腹腔注射麻醉剂混合物麻醉小鼠（2.1）。&#160;成像过程中对小鼠眼睛涂抹兽医用眼膏，以防止麻醉状态下眼睛干涩。
	<ol>
		<li>通过将500 µl原始麻醉剂混合液与等体积的PBS稀释，配制1 ml半剂量麻醉剂混合液。</li>
		<li>将半剂量麻醉混合液转移至带有27号蝶形针头的1 ml注射器中。</li>
		<li>将蝴蝶针头经皮下插入小鼠腹腔，并用胶带将蝴蝶针的翼片固定在腹部。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将一块玻璃盖玻片置于成像载物台中央，用胶带固定盖玻片边缘以使其保持位置。</li>
	<li>在小鼠耳腹面以及盖玻片上各加一滴 PBS。</li>
	<li>将麻醉后的小鼠耳部置于盖玻片上方，固定耳尖背部&#160;将耳片夹在盖玻片和载玻片之间，载玻片也用胶带固定，倒置放置。</li>
	<li>打开多激光共聚焦荧光显微镜及所有相关设备。关闭室内灯光以尽量减少环境光暴露。</li>
	<li>打开图像采集软件。在染料列表菜单中选择用于检测荧光染料的激光通道。</li>
	<li>通过观察血管的绿色信号和DsRed的红色信号，调整炎症耳部皮肤的焦距+ 通过目镜观察细胞。</li>
	<li>以2 µs/像素的扫描速度和512 × 512像素的分辨率进行快速扫描。在实时成像菜单中为每个通道选择伪彩。调节聚焦旋钮以设定扫描的起始和终止位置。</li>
	<li>以4–8 µsec/像素的扫描速度和800 × 800或1,024 × 1,024像素的分辨率进行慢速扫描。调节每个单独通道的高压、增益和偏移，以在避免信号饱和（红色像素）的前提下最大化信号强度。每个通道中应仅有少量红色像素。</li>
	<li>通过从耳部皮肤表层的角质层开始并逐步向下扫描，生成三维图像集，扫描范围分别为：317 µm × 317 µm × 30 µm（使用40X物镜）、635 µm × 635 µm × 30 µm（使用20X物镜）或1,270 µm × 1,270 µm × 50 µm（使用10X物镜），z轴步进为2 µm。 
	注意：角质层是表皮的最外层，可根据其强烈的自发荧光信号进行清晰定位。</li>
	<li>在延时成像实验中，每隔2或4分钟采集一次三维图像，持续长达8小时。</li>
	<li>间歇性地，当观察到小鼠胡须抽动表明其开始从麻醉中恢复时，通过蝶形针头追加给予5–10 µl半剂量麻醉混合液。 
	注意：需谨慎控制麻醉剂量——过量可能导致小鼠死亡。&#160;或者，可将小鼠置于麻醉罐中进行吸入麻醉以实现短期麻醉，而对于长期成像，则可使用鼻罩进行吸入麻醉。&#160;</li>
	<li>成像完成后，将麻醉的小鼠从载物台上取下。撕下胶带，从小鼠腹部移除蝶形针。将小鼠送回动物饲养设施中的独立笼具中。 
	注意：对于短期成像（&#60;1小时），小鼠通常在1-3小时内迅速从麻醉中完全恢复。对于长时间成像（约8小时），小鼠恢复较慢，典型恢复期为12-16小时。因此，建议在恢复期间至少多次给予口服补水，以防止严重脱水。</li>
	<li>处理成像数据集，追踪单个细胞，生成细胞迁移路径，并利用图像分析软件计算细胞迁移的方向性和速度25.</li>
</ol>

<ol><li>Nauseef, W. M., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+at+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils at work.</a> Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).</li>
<li>Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+the+innate+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Immunol.+Ther.+Exp.+%28Warsz%29%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in the innate immune response.</a> Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).</li>
<li>Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+priming%3A+pathophysiological+consequences+and+underlying+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Sci.+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms.</a> Clin. Sci. (Lond). 94 (5), 461-471 (1998).</li>
<li>El-Benna, J., Dang, P. M., Gougerot-Pocidalo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming+of+the+neutrophil+NADPH+oxidase+activation%3A+role+of+p47phox+phosphorylation+and+NOX2+mobilization+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane.</a> Semin. Immunopathol. 30 (3), 279-289 (2008).</li>
<li>Benson, R. A., McInnes, I. B., Brewer, J. M., Garside, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+imaging+in+rheumatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">Cellular imaging in rheumatic diseases.</a> Nat. Rev. Rheumatol. 11 (6), 357-367 (2015).</li>
<li>Herz, J., Zinselmeyer, B. H., McGavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+microbial+immunity+in+living+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of microbial immunity in living tissues.</a> Microsc. Microanal. 18 (4), 730-741 (2012).</li>
<li>Tang, J., van Panhuys, N., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+immunoimaging--deeper%2C+bigger%2C+more+precise%2C+and+definitively+more+colorful%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The future of immunoimaging--deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful.</a> Eur. J. Immunol. 43 (6), 1407-1412 (2013).</li>
<li>Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cell+biology+in+live+animals%3A+ready+for+prime+time%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Imaging cell biology in live animals: ready for prime time.</a> J. Cell. Biol. 201 (7), 969-979 (2013).</li>
<li>Ng, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+neutrophil+response+to+sterile+tissue+injury+in+mouse+dermis+reveals+a+three-phase+cascade+of+events%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events.</a> J. Invest. Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).</li>
<li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li>
<li>Finsterbusch, M., Voisin, M. B., Beyrau, M., Williams, T. J., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+recruited+by+chemoattractants+in+vivo+induce+microvascular+plasma+protein+leakage+through+secretion+of+TNF%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophils recruited by chemoattractants in vivo induce microvascular plasma protein leakage through secretion of TNF.</a> J. Exp. Med. 211 (7), 1307-1314 (2014).</li>
<li>Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptolysin+S+inhibits+neutrophil+recruitment+during+the+early+stages+of+Streptococcus+pyogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection.</a> Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).</li>
<li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> J. Neuroinflammation. 9 (50), (2012).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multi-modal+imaging+of+experimental+autoimmune+uveoretinitis+in+transgenic+reporter+mice+reveals+the+dynamic+nature+of+inflammatory+changes+during+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">In vivo multi-modal imaging of experimental autoimmune uveoretinitis in transgenic reporter mice reveals the dynamic nature of inflammatory changes during disease progression.</a> J. Neuroinflammation. 12 (17), (2015).</li>
<li>Slaba, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+Dynamic+Platelet-Neutrophil+Response+in+Sterile+Liver+Injury+and+Repair+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Imaging the Dynamic Platelet-Neutrophil Response in Sterile Liver Injury and Repair in Mice.</a> Hepatology. , (2015).</li>
<li>Mizuno, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+reveals+PKA+regulation+of+ERK+activity+during+neutrophil+recruitment+to+inflamed+intestines%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines.</a> J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).</li>
<li>Hasenberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catchup%3A+a+mouse+model+for+imaging-based+tracking+and+modulation+of+neutrophil+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes.</a> Nat. Methods. 12 (5), 445-452 (2015).</li>
<li>Matsushima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+IL-1beta+production+in+skin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of IL-1beta production in skin.</a> J. Invest. Dermatol. 130 (6), 1571-1580 (2010).</li>
<li>Yipp, B. G., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+against+neutrophil+LY6G+do+not+inhibit+leukocyte+recruitment+in+mice+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo.</a> Blood. 121 (1), 241-242 (2013).</li>
<li>Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-invasive+imaging+for+the+in+vivo+tracking+of+high-speed+vesicle+transport+in+mouse+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils.</a> Sci. Rep. 3, (1913).</li>
<li>Sreeramkumar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+scan+for+activated+platelets+to+initiate+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neutrophils scan for activated platelets to initiate inflammation.</a> Science. 346 (6214), 1234-1238 (2014).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+priming+occurs+in+a+sequential+manner+and+can+be+visualized+in+living+animals+by+monitoring+IL-1beta+promoter+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil priming occurs in a sequential manner and can be visualized in living animals by monitoring IL-1beta promoter activation.</a> J. Immunol. 194 (3), 1211-1224 (2015).</li>
<li>Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+simple%2C+and+humane+method+for+submandibular+bleeding+of+mice+using+a+lancet%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim.+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet.</a> Lab Anim. (NY). 34 (9), 39-43 (2005).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Anim.+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice).</a> Lab. Anim. (NY). 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Fotos, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+time-lapse+microscopy+and+high-resolution+tracking+of+cell+migration%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration).</a> Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).</li>
<li>Mizumoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+novel+immunostimulants+by+dendritic-cell-based+functional+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening.</a> Blood. 106 (9), 3082-3089 (2005).</li>
<li>Cassatella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-derived+proteins%3A+selling+cytokines+by+the+pound%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound.</a> Adv. Immunol. 73, 369-509 (1999).</li>
<li>Grahames, C. B., Michel, A. D., Chessell, I. P., Humphrey, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+characterization+of+ATP-+and+LPS-induced+IL-1beta+release+in+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological characterization of ATP- and LPS-induced IL-1beta release in human monocytes.</a> Br. J. Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).</li>
<li>Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+effects+of+domoic+acid+differ+between+in+vivo+and+in+vitro+exposure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mar.+Drugs%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice.</a> Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).</li>
<li>Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+role+of+G-CSF+in+the+production%2C+survival%2C+and+release+of+neutrophils+from+bone+marrow+into+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Evaluation of role of G-CSF in the production, survival, and release of neutrophils from bone marrow into circulation.</a> Blood. 100 (3), 854-861 (2002).</li>
<li>Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focus-drift+correction+in+time-lapse+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048, 321-330 (2005).</li>
<li>Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+assessment+of+confocal+microscopy+slide-based+systems%3A+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability.</a> Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).</li>
<li>Hogan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+on+the+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics.+Int%22%5BJournal%5D)">Focusing on the experiment.</a> Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).</li>
<li>Kabashima, K., Egawa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+imaging+of+cutaneous+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses.</a> J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).</li>
<li>Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+epidermal+keratinocytes+and+dermal+vasculatures+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dermatol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy.</a> J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).</li>
<li>Kedrin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+2-photon+imaging+of+blood+flow+in+the+neocortex+through+a+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li>
<li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).</li>
<li>Looney, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).</li>
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作者无经济利益冲突。

本研究旨在开发一种用于在活体动物中监测中性粒细胞启动过程的技术，而目前现有的技术尚未实现这一目标。为实现该目标，采用三种已建立的方法：1）在由IL-1β启动子驱动的DsRed报告基因小鼠中诱导皮肤炎症，以评估启动状态；2）使用低剂量荧光标记的抗Ly6G单克隆抗体对中性粒细胞进行体内标记；3）活体共聚焦显微成像。这三种方法的结合使得启动态中性粒细胞（DsRed+/Ly6G+）在炎症性皮肤病灶中的运动行为得以可视化。通过迁移路径追踪，进一步量化启动态中性粒细胞的迁移方向和速度。通过记录一系列延时视频，可实时监测炎症部位启动态中性粒细胞的出现动力学，并观察到单个中性粒细胞在血管外空间获得DsRed表达的过程。因此，利用本研究提出的技术，首次成功实现了在活体动物中对中性粒细胞启动动态过程的可视化。
该技术应用于多个关键步骤。首先，皮肤组织是活体成像中最方便的部位。将OX外用于小鼠耳部，可在共聚焦显微镜下直接观察炎症皮肤中免疫细胞的行为。其次，成像过程中必须持续对小鼠进行镇静，因此需要重复注射麻醉剂。然而，过度镇静可能导致小鼠在成...

中性粒细胞是循环中最丰富且寿命最短的白细胞。它们可迅速被募集至感染或损伤部位，通过释放活性氧和氮中间产物，以及含有抗菌肽和蛋白酶的颗粒，发挥专职吞噬细胞的功能。1在募集过程中，中性粒细胞是 &#34;预处理&#34; 由多种因子（包括微生物产物、趋化因子和炎性细胞因子）诱导，导致吞噬细胞到达炎症部位后其功能显著增强2中性粒细胞预激活的机制已被广泛研究 体外3,4；然而，该过程的动态监测 体内 迄今为止尚无法实现。
近年来，活体成像已成为可视化和量化活体生物体内细胞动态过程的重要技术。活体成像可通过传统的单光子激发显微镜（例如，共聚焦显微镜）或多光子显微镜技术实现5。随着时间推移，该技术取得了显著进步，实现了更高的图像分辨率、更深的成像深度、更少的组织光损伤以及更优的图像稳定性6,7。由于其能够长时间动态观察细胞迁移与相互作用，活体显微镜已被广泛应用于免疫学的多个研究领域8。活体成像使免疫学家能够在活体动物模型中更深入地理解并阐明免疫反应在细胞和分子水平上的机制。
转基因和基因敲入报告小鼠的最新进展为在活体动物中监测中性粒细胞的动态行为提供了有用的工具。溶菌酶M启动子驱动的增强型绿色荧光蛋白基因敲入小鼠已被广泛用于表征中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞在多种炎症过程中的运动性，包括血管外渗、细菌感染和无菌性炎症9-15。此外，表达细胞质荧光共振能量转移生物传感器的转基因小鼠已被用于研究中性粒细胞在炎症肠道中细胞外调节的丝裂原活化蛋白激酶和蛋白激酶A的活性16。一种对中性粒细胞荧光表达具有高特异性的鼠模型是Catchup基因敲入小鼠，该模型可产生Cre重组酶以及荧光蛋白tdTomato，而tdTomato的表达本身与淋巴细胞抗原6G（Ly6G）的表达相偶联17。通过该模型对Ly6G缺陷型中性粒细胞的可视化研究表明，这些细胞在多种无菌性或感染性体内炎症环境中均表现出正常功能。在小鼠白细胞介素-1β（IL-1β）启动子（pIL1-DsRed）控制下表达DsRed荧光蛋白基因的转基因小鼠已被用于可视化IL-1β产生细胞的运动行为——这些细胞被认为包括中性粒细胞、炎性单核细胞和活化的巨噬细胞——在炎症皮肤中出现的情况18。
体内 标记可作为追踪中性粒细胞在炎症组织中细胞与分子行为的替代方法。静脉注射低剂量荧光标记的抗Gr-1单克隆抗体（mAb）后，可观察Gr-1阳性细胞的募集级联过程。+ 中性粒细胞已在感染的小鼠皮肤病变部位被观察到 金黄色葡萄球菌19. 体内 注射含有链霉亲和素偶联的705 nm量子点和生物素标记的抗Ly6G单克隆抗体的复合物可特异性标记循环中的中性粒细胞20此外，此类偶联物在中性粒细胞囊泡中的内吞作用，使得能够追踪中性粒细胞向间质迁移过程中囊泡的高速运输。 体内 在TNFα诱导的炎症模型中，使用荧光标记的抗体针对P-选择素糖蛋白配体-1（PSGL-1）、L-选择素（CD62L）、整合素αM（CD11b）和趋化因子（C-X-C模体）受体2（CXCR2）进行标记，揭示了早期炎症过程中发挥调控作用的机制21极化中性粒细胞伸出富含PSGL-1的尾突，与活化血小板表面的CD62L相互作用，导致驱动中性粒细胞迁移并启动炎症反应的受体CD11b和CXCR2发生重新分布。
IL-1β 是在致敏中性粒细胞中表达升高的标志性基因之一22。在 pIL1-DsRed 报告基因小鼠中，DsRed 荧光信号（即 IL-1β 启动子的激活）与 IL-1β mRNA 表达及 IL-1β 蛋白的产生呈正相关18。为了监测中性粒细胞致敏过程，研究人员建立了一种活体显微成像方法：在 pIL1-DsRed 小鼠模型中，先通过荧光标记的抗 Ly6G 单克隆抗体对中性粒细胞进行体内标记，随后使用氧化唑酮（OX）诱导皮肤炎症。利用该模型，可在多种疾病和病理状态的动物模型中研究致敏中性粒细胞的行为与功能。

<table><tbody><tr><td>肝素钠</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>NDC 63323-540-31</td><td></td></tr><tr><td>ACK裂解缓冲液</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>脂多糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4391</td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>LLOYD Laboratory</td><td>NADA #139-236</td><td></td></tr><tr><td>乙酰丙嗪</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>ANADA 200-361</td><td></td></tr><tr><td>脱毛膏</td><td>Church &amp; Dwight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16P4</td><td></td></tr><tr><td>氧化唑酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0753</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 抗小鼠 Ly6G 抗体</td><td>BioLegend</td><td>127610</td><td></td></tr><tr><td>U-100 胰岛素注射器（带28G针头）</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>荧光素异硫氰酸酯-羧基甲基-葡聚糖（FITC-CM-Dextran），150 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74817</td><td></td></tr><tr><td>蝶形输液套件（27G针头）</td><td>BD</td><td>387312</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur 流式细胞仪</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellQuest Pro 软件</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph 软件</td><td>Universal Imaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用il-1β启动子驱动的dsred报告小鼠进行中性粒细胞活化的活体成像

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

中性粒细胞是人体血液循环中最丰富的白细胞，可迅速被募集至炎症部位。启动（priming）是增强中性粒细胞吞噬功能的关键事件。尽管已有大量研究揭示了中性粒细胞启动在感染与损伤过程中的存在及其重要性，但可视化这一过程的方法仍有限。 体内 一直无法获得。本方案通过结合三种方法，实现了在活体动物中监测中性粒细胞预激活的动态过程：1）DsRed 报告信号——用于评估预激活水平；2） 体内 中性粒细胞标记——通过注射荧光标记的抗淋巴细胞抗原6G（Ly6G）单克隆抗体（mAb）实现，以及3）活体共聚焦成像。本方案包含多个关键步骤：氧化唑酮诱导的小鼠耳部皮肤炎症、动物的适当麻醉、重复注射抗Ly6G单克隆抗体，以及成像过程中防止焦平面漂移。尽管观察到一些局限性，例如单只小鼠连续成像时间有限（约8小时）以及在炎症状态下异硫氰酸荧光素-葡聚糖从血管中渗漏，该方案仍为活体成像观察致敏中性粒细胞的行为与功能提供了基本框架，且可轻松扩展应用于小鼠炎症模型中其他免疫细胞的研究。

pIL1-DsRed 小鼠的筛选基于其外周血白细胞通过流式细胞术检测到的表型 DsRed 荧光信号。已知 LPS 刺激可诱导髓系细胞（包括中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞）产生 IL-1β26-28。因此，在进行流式细胞术分析前，分离的白细胞需先与 LPS 共孵育 4 小时。随后，根据细胞大小（FSC）和内部复杂性（SSC）对循环中的髓系细胞设门（图 1A）29，并在该设门群体中检测 DsRed 信号。来自野生型（WT）小鼠的循环髓系细胞几乎不表达 DsRed，而来自 pIL1-DsRed 小鼠的相同细胞则表现出可区分的 DsRed 信号（图 1B）。通过此表型鉴定方法确认的 pIL1-DsRed 小鼠将用于后续实验。需要注意的是，整个表型鉴定过程仅需数小时，远短于传统的基因分型方法（包括组织采集、酶消化、DNA 提取、PCR 及电泳）。
I...

本实验方案采用荧光报告基因、体内标记和活体成像技术，以实现对活体动物中中性粒细胞预激活动态过程的监测。

利用IL-1β启动子驱动的DsRed报告小鼠进行中性粒细胞活化的活体成像

中性粒细胞是人体血液循环中最丰富的白细胞，可迅速被募集至炎症部位。启动（Priming）是一个关键事件，……

本实验的总体目标是介绍一种用于在活体动物中监测中性粒细胞启动过程的技术。该方法有助于回答免疫学领域中的关键问题，例如在罕见疾病和障碍的动物模型中可视化中性粒细胞启动后的行为与功能。该技术的主要优势在于结合了三种成熟的方法，包括荧光报告分子、病毒标记以及活体成像技术。将杂合的 pIL1-DsRed 小鼠与野生型 C57Black six 小鼠杂交。在出生后三至四周，对仔鼠进行表型鉴定。每只仔鼠准备一个含有 20 微升肝素的 1.5 毫升离心管。采集血液时，抓住幼鼠颈部的皮肤并用5毫米采血针刺入颊囊的下颌静脉。仅需进行微小穿刺。每管收集三到五滴血液。采集完成后，务必止血，并在将动物送回动物房之前观察30分钟。向每管样品中加入500 µL红细胞裂解缓冲液，然后涡旋混匀，并在冰上孵育5至10分钟。孵育后，缓慢向每根试管中的细胞悬液下方加入 400 至 500 微升胎牛血清。各层之间应形成清晰的界面。接着，以 1,500 ×g 离心 5 分钟，以收集细胞沉淀。弃去上清液，将细胞重悬于 200 µL 完全 RPMI-1640 培养基中。然后将每种悬液转移至流式细胞术检测管中，并向每根管中加入 20 µL 新鲜配制的 LPS 工作液。在进行流式细胞术检测前，将样品孵育 4 小时。首先，通过腹腔注射麻醉混合剂对小鼠进行麻醉，并通过脚趾夹捏试验确认麻醉效果充分。接着，将脱毛膏涂抹于双耳的背侧表面，一分钟后擦去，并用水清洗皮肤。使用千分尺测量涂抹部位耳部的厚度。之后，待小鼠从麻醉中恢复后，将其放回自己的笼子，并让小鼠至少休息三天后再进行进一步测试。三天后，再次对小鼠进行麻醉，重新测量耳部厚度，以确保耳部未受刺激。然后，将 12.5 µL 的 1.25% 奥沙唑酮溶液涂抹于右耳的两侧，将 12.5 µL 的丙酮橄榄油溶剂溶液涂抹于左耳的两侧。与往常一样，观察小鼠从麻醉中恢复。24小时后，在麻醉状态下再次测量耳朵厚度，以确认已成功诱导氧化唑酮所致的皮肤炎症。首先，将100 µL抗lyse XG单克隆抗体转移至带有28号针头的U100胰岛素注射器中。接下来，按照先前所述方法麻醉一只经处理的小鼠。将小鼠腹部朝下放置，轻轻向下按压眼球周围皮肤的背侧和腹侧，使眼球部分突出。然后，将针头斜面向下，与内眦呈约30度角，小心地将针头插入眶后窦。当针头进入窦腔时，穿刺压力将得到释放。随后注入内容物，并迅速拔出针头。少量出血提示注射成功。现在，立即将1.25%氧化唑酮和对照溶剂溶液分别涂抹于小鼠右侧和左侧耳部，操作方法同前。8小时后，向每只小鼠给予第二次相同抗体剂量。同时，为观察血管，经眼后静脉注射100 µL FITC葡聚糖。进行此操作时，首先如前所述对小鼠进行麻醉。然后，在其眼睛上涂抹兽医用眼膏，以防止成像过程中眼睛干涩。接着，将玻璃盖玻片置于成像平台的中央，并用胶带固定盖玻片的边缘。同时，在盖

intravital-imaging-neutrophil-priming-using-il-1-promoter-driven

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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我们描述了一种用于在中性粒细胞趋化因子刺激下，中性粒细胞募集过程中动态测量中性粒细胞与内皮细胞相互作用的明场活体显微镜技术方案。...

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活体小鼠血管炎症和血栓形成过程中活化内皮上血小板-中性粒细胞异型相互作用的实时成像

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一种白细胞介素-8瞬时转基因小鼠模型用于 体内 长期监测炎症反应

本文展示了如何对小鼠提睾肌的毛细血管后微静脉进行活体显微观察。该技术常用于研究不同类型的炎症和脓毒症模型，尤其是由趋化因子和细胞因子诱导的模型，本文强调了其在研究伴有显著肌肉白细胞浸润的肌病中的重要性。...

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