Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mice

该程序的总体目标是提出一种监测活体动物中性粒细胞启动过程的技术。这种方法可以帮助回答免疫学领域的关键问题，例如在最罕见疾病和病症的动物模型中激发中性粒细胞的行为和功能的可视化。该技术的主要优点是它结合了三种成熟的方法，包括病毒标记和活体成像中的荧光报告基因。

用野生型 C57Black 六只小鼠繁殖杂合 pIL1-DsRed 小鼠。在 3 到 4 周时，对它们的幼崽进行表型分析。对于每只幼崽，准备一根 1.5 毫升的管子，里面有 20 微升肝素。

要采集血液，请抓住幼犬的颈部骷髅，并使用 5 毫米柳叶刀刺穿脸颊袋中的下颌下静脉。只需要一个小的穿刺。每管收集 3 到 5 滴血液。

采集后，请务必止血并观察动物 30 分钟，然后再将它们送回动物设施。向每个样品管中加入 500 μL 红细胞裂解缓冲液。然后，涡旋试管，并在冰上孵育 5 到 10 分钟。

孵育后，在每个试管的细胞悬液下缓慢加入 400 至 500 μL 胎牛血清。各层之间应形成一个清晰的界面。接下来，将样品以 1， 500 Gs 离心 5 分钟以收集细胞沉淀。

弃去上清液，将细胞重悬于 200 μL 完全 RPMI-1640 培养基中。然后，将每种悬浮液转移到流式细胞仪管中，并向每个管中加入 20 微升新鲜制备的 LPS 工作溶液。在进行流式细胞术之前，将样品孵育 4 小时。

首先，通过腹膜内注射麻醉剂混合物麻醉小鼠，并通过脚趾捏试验确认足够的镇静作用。接下来，将脱毛霜涂抹在双耳背侧，一分钟内擦掉，然后用水清洗皮肤。使用千分尺测量应用部位的耳朵厚度。

稍后，在小鼠从麻醉中恢复后，将鼠标放回自己的笼子中，并让鼠标休息至少三天，然后再进一步测试。三天后，重新麻醉鼠标并再次测量耳朵厚度，以确保它不会受到刺激。然后，将 12.5 微升 1.25% 恶唑啉酮涂抹在右耳的每一侧，并将 12.5 微升丙酮橄榄油载体溶液涂抹在左耳的每一侧。

与往常一样，观察小鼠从麻醉中恢复。24 小时后，在麻醉下再次测量耳朵的厚度，以确保发生了噁唑酮诱导的皮肤炎症。首先，将 100 微升抗裂解 XG 单克隆抗体转移到带有 100 号针头的 U28 胰岛素注射器中。

接下来，如前所述麻醉治疗过的小鼠。在小鼠腹部向下的情况下，对眼睛背侧和腹侧的皮肤施加轻微的向下压力，以部分突出眼球。然后，小心地放置针头，向下倾斜，与内眦成约 30 度角，然后小心地将针头插入眼眶后窦。

当针头进入鼻窦时，穿透压力会得到缓解。然后，弹出内容物并快速取出针头。少量出血表明注射成功。

现在，立即像以前一样将 1.25% 恶唑酮和载体溶液涂抹在左右鼠标耳朵上。8 小时后，向每只小鼠中施用第二剂相同的抗体。此外，为了可视化血管，逆眶施用 100 微升 fitc 葡聚糖。

对于此过程，首先像以前一样麻醉鼠标。然后，在眼睛上涂抹兽药膏以防止成像时干燥。接下来，将玻璃盖玻片放在成像台的中心，并用胶带固定盖玻片的边缘。

此外，在盖玻片中加入一滴 PVS。现在，将鼠标的耳朵放在盖玻片上，背侧朝下。接下来，用一滴 PVS 润湿小鼠耳朵的腹面。

然后，用玻璃滑轨安装在耳尖上，并用胶带固定滑轨。现在，打开多激光荧光共聚焦显微镜和相关设备。关闭房间灯以尽量减少环境光照射。

然后，使用共聚焦显微镜记录三维图像。对于延时成像实验，每 2 到 4 分钟记录一次 3D 图像，最长可达 8 小时。一直注意抽搐的胡须，这表明老鼠开始从麻醉中恢复过来。

在这种情况下，通过蝶形针施用 5 至 10 微升半剂量的麻醉混合物。通过流式细胞术筛选 pIL-1-DsRed 小鼠外周血白细胞中产生的表型 DsRed 荧光。来自野生型小鼠的循环髓系细胞最低限度地表达 DsRed，而来自 pIL1-DsRed 小鼠的相同细胞表达可区分的 DsRed 信号。

IL-1 β 启动子激活是中性粒细胞启动的标志物，在活的 pIL-1DsRed 小鼠中可以最好地观察到。接下来，将皮肤增敏剂 Ozazolone 局部涂抹在右耳上。后来，通过眼眶后注射第二次施用恶唑酮增敏剂之前和之后标记中性粒细胞。

同样，注射 fitc 葡聚糖以定位血管。在血管外间隙发现了许多双标记细胞，它们代表引发的中性粒细胞。少数细胞仅被裂解 XG 抗体标记，这些细胞可能是静息中性粒细胞。

此外，观察到少量 DsRed 阳性细胞群，其中可能包括炎性单核细胞和活化的巨噬细胞。追踪细胞迁移路径以比较两个中性粒细胞群体。一旦进入细胞外间隙，两个中性粒细胞种群都显示出随机迁移。

有趣的是，与推定的静止中性粒细胞相比，推定的中性粒细胞表现出明显更高的速度。开发后，这项技术为免疫学领域的研究人员铺平了道路。两项研究探讨了涉及不同 T 细胞的各种炎症状态下许多免疫细胞的行为和功能。

看完这个视频，你应该对如何监测活体动物体内中性粒细胞启动的动态过程有一个很好的了解。