诱导多能干细胞使用成纤维样滑膜生成类风湿关节炎患者的关节分离

本实验的总体目标是从类风湿性关节炎发炎关节的滑膜组织中分离的成纤维细胞样滑膜细胞中产生诱导多能干细胞 （IPC）。目前，iPSC 可以从各种人类原代细胞中产生。我们成功地从人成纤维细胞样滑膜细胞中生成了 iPSC，这是类风湿关节的关键病理细胞。

这可能有助于调查类风湿性关节炎的病理学。本期刊可以帮助回答有关使用 RA-FLS 的 IPSC 退化的关键问题。首先将滑膜组织放入 100 毫米的培养皿中，然后用 5 毫升补充抗生素的 PBS 洗涤组织。

去除淡黄色的脂肪组织和骨渣。然后将修剪后的组织转移到含有 5 毫升补充有 FBS 的 DMEM 的六孔板的一个孔中，并使用剪刀将组织切碎，直到碎片足够小以穿透一次性移液器吸头。将培养基转移至 50 毫升锥形管中，然后向孔中加入 5 毫升新鲜 DMEM 和 FBS 以收集任何剩余组织并将整个孔内容物转移到管中。

接下来，将冰解的胶原酶添加到试管中，终浓度为 0.01%，并用封口膜密封试管，以便在 37 摄氏度的水浴中振荡孵育。4 小时后，用新鲜的 DMEM 和 FBS 填充试管，最终体积为 50 mL，并通过离心收集组织碎片。在不干扰沉淀的情况下去除上清液，然后将细胞重悬于 40 mL 新鲜培养基中进行另一次离心。

第二个沉淀重新悬浮在 25 miill 新鲜 DMEM 和 FBS 中，并让大块组织沉淀。然后将上清液转移到一个新的 100 毫米培养皿中，并在 37 摄氏度和 5% CO 2 下孵育滑膜细胞 14 天。为了扩增滑膜细胞培养物，丢弃用过的培养基，并在 5 毫升 PBS 中洗涤细胞。

去除 PBS，并在细胞培养箱中用 1 ml EDTA 解离细胞 2 分钟。孵育结束时，轻轻敲击培养皿以分离任何剩余的贴壁细胞，并将所得细胞悬液转移到 15 mL 锥形管中进行离心。将沉淀重悬于 30 mL DMEM 和 FBS 中，并将细胞分成 3 个新的 100 mm 培养皿中。

每 3 天用新鲜培养基喂养滑膜细胞，将细胞分成 3 个新培养物，汇合度为 80%，如刚才所示。在转导第 0 天，将每孔 3 x 10 至第 4 个 FLS 放在新鲜生长培养基中的 6 孔板上，在 37 摄氏度、5% CO2 中孵育过夜。第二天，在 4 摄氏度下解冻 1 瓶含有 4 种 Yamanaka 因子的慢病毒，并用补充有溴化己二甲啉和抗坏血酸的 FLS 生长培养基替换 FLS 培养基。

当小瓶内容物解冻后，向细胞中加入 30 μL 慢病毒，并轻轻混合以均匀分布病毒。为了改善感染，将板离心并将细胞放回培养箱中，每天用含有丁酸钠和抗坏血酸的新鲜 FLS 生长培养基替换培养基 3 天。第 4 天，用含有丁酸钠和抗坏血酸的 FLS 生长和 iPSC 培养基的混合物替换培养基。

第 5 天，将 60 微升玻连蛋白加入 6 毫升不含钙和镁的 PBS 中，并在 6 孔板的 3 个孔中涂上 2 毫升溶液，每个孔在室温下至少一小时。当玻连蛋白凝固时，用 PBS 洗涤转导的细胞，并用 EDTA 分离它们，如图所示。通过离心收集解离的细胞后，将沉淀重悬于 900 μL 新鲜培养基中。

从孔中去除多余的玻连蛋白，并将 300、150 和 100 μL 细胞添加到单个孔中。然后将细胞放回培养箱中，每天用新鲜的 iPSC 培养基更换培养基，直到出现菌落。要挑取菌落，首先向玻连蛋白包被的 48 孔板的每个孔中加入 500 μL 补充有 ROCK 抑制剂的 iPCS 培养基。

然后，将 FLS 培养物放在干净的工作台上的解剖显微镜下，并使用 10 微升移液器吸头切割感兴趣的菌落。使用 200 μL 移液器吸头，将挑选的菌落转移到 48 孔板的 1 个孔中。挑取所有菌落后，将板放入细胞培养箱中，直到菌落足够大以进行转移。

当集落超出显微镜的可见区域时分裂细胞，如 100 倍放大镜下所见。在这张图片中，可以观察到初始 14 天培养后分离的 FLS 的形态。细胞通常表现出成纤维细胞的特征，纤维化标志物波形蛋白和纤连蛋白的表达相似，以及巨噬细胞样滑膜细胞标志物 CD-68.8 的低表达 山中因子慢病毒转导后 11 天，开始出现小菌落，可以挑选和扩增 5 至 10 代。

这些类风湿性关节炎 iPSC 表达碱性磷酸酶，表明它们仍未分化。这些细胞还表达多能标志物，经 RT-PCR 和免疫荧光分析证实。类风湿性关节炎 iPCS 表现出 44+XY 的正常染色体模式，由核型分析确定。

此外，在注射到 SCID 小鼠体内 12 周后，类风湿性关节炎 iPSC 形成了畸胎瘤，表现出不同的组织表型。通过免疫荧光染色证实它们的胚层分化。一旦掌握，就可以从带有滑膜的 FLS 中生成 iPSC。

观看视频后，您应该对如何从滑膜组织中分离以及如何使用它们诱导重编程有了更好的了解。这些 RAF-FLS 来源的 iPSC 可用于研究风湿病学中的再生或药物筛选。一旦这些 iPSC 建立起来，就可以产生各种靶细胞或器官。

这可能对研究疾病或其他未来的应用（例如基因编辑等）有用。