Name: 诱导多能干细胞使用成纤维样滑膜生成类风湿关节炎患者的关节分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 了解如何使用慢病毒系统从类风湿关节炎患者的成纤维样滑膜细胞生成诱导多能干细胞。该方法无需饲养层细胞，有助于研究类风湿关节炎的病理机制并推动再生医学应用。

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本工作由韩国疾病预防控制中心资助的研究项目（HI13D2188）支持。

伦理声明：本研究方案已获得韩国天主教大学机构审查委员会批准（KC12TISI0861）。
1. 滑膜细胞的分离与扩增
<ol>
	<li>滑膜细胞的分离
	<ol>
		<li>将两把手术剪和一把镊子进行灭菌处理。</li>
		<li>将滑膜组织转移至一个100 mm培养皿中，并用5 ml含1%青霉素/链霉素的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗。</li>
		<li>切除黄色脂肪组织和骨残留物。将修整后的组织转移至6孔板的一个孔中，并加入5 ml含20%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。</li>
		<li>用剪刀将组织剪碎，直至碎片足够小，能够通过一次性移液管。</li>
		<li>将含有组织的培养基转移至一个50 ml锥形管中。向6孔板中加入5 ml含20% FBS的DMEM，收集残留材料，然后转移至同一管中。</li>
		<li>在冰上解冻胶原酶。加入胶原酶至终浓度为0.01%，用封口膜密封管口。在37 °C水浴中振荡孵育4小时。</li>
		<li>孵育结束后，用含20% FBS的DMEM补足体积至50 ml，于室温下以300 × g离心10分钟。</li>
		<li>小心移除上清液，避免扰动沉淀，加入40 ml培养基重悬沉淀。</li>
		<li>重复步骤1.1.10–1.1.11。</li>
		<li>将沉淀重悬于25 ml含20% FBS的DMEM中，静置，待较大的组织团块沉降至管底。</li>
		<li>将上清液转移至一个100 mm培养皿中，在37 °C、5% CO2条件下孵育14天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>滑膜细胞的维持与扩增
	<ol>
		<li>弃去培养皿中的旧培养基，用5 ml PBS洗涤细胞。</li>
		<li>加入1 ml PBS/1 mM EDTA，于37 °C、5% CO2条件下孵育2分钟。</li>
		<li>轻轻敲击培养皿，将细胞转移至15 ml锥形管中。于室温下以250 × g离心2分钟。</li>
		<li>小心移除上清液，避免扰动沉淀，用30 ml含20% FBS的DMEM重悬沉淀。</li>
		<li>将细胞转移至3个100 mm培养皿中，确保无可见残留物。</li>
		<li>每3天更换一次新鲜培养基。当细胞融合度达到80%时，使用1 ml PBS/1 mM EDTA进行传代。使用前维持培养至第3代。每次传代时将每皿细胞分至3个新培养皿中。 
		注：达到第3代后，暂不使用的细胞可进行冻存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用编码山中因子的慢病毒重编程滑膜成纤维细胞
<ol>
	<li>转导（第0天）
	<ol>
		<li>在6孔板中每孔接种3 × 104个细胞，培养基为生长培养基（500 ml DMEM，添加10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素）。于37 °C、5% CO2条件下过夜培养细胞。</li>
		<li>次日，从冰箱中取出一管含有4种Yamanaka因子（Oct4、Klf4、Sox2和c-Myc）的慢病毒，置于4 °C解冻。注：慢病毒的制备方法见我们之前的研究11。</li>
		<li>在病毒解冻的同时，更换为FLS生长培养基（含20%胎牛血清和抗生素的DMEM），并添加10 µg/ml六亚甲基溴化铵和50 µg/ml抗坏血酸。</li>
		<li>更换培养基后，向每孔加入30 µl慢病毒，并轻柔混匀。为提高感染效率，将培养板在35 °C、680 × g条件下离心30分钟。</li>
		<li>离心后，将细胞置于37 °C、5% CO2条件下继续培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>维持培养直至重编程现象可见
	<ol>
		<li>连续3天，每天更换一次含0.1 mM丁酸钠和50 µg/ml抗坏血酸的FLS生长培养基。</li>
		<li>次日，更换为FLS生长培养基与iPSC培养基（1:1比例）的混合液，其中含0.1 mM丁酸钠和50 µg/ml抗坏血酸。 
		注：iPSC培养基的组分见材料/设备列表。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞传代以促进克隆形成
	<ol>
		<li>准备经玻连蛋白包被的6孔板。
		<ol>
			<li>将60 µl玻连蛋白加入6 ml不含Ca2+和Mg2+的PBS中，每孔加入2 ml混合液，室温孵育至少1小时。注：玻连蛋白的工作浓度为5 µg/mL。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>第5天（D5），用PBS洗涤细胞。</li>
		<li>加入1 ml PBS/1 mM EDTA以解离细胞，在37 °C、5% CO2条件下孵育2分钟。</li>
		<li>收集细胞，并在室温下以250 × g离心2分钟。</li>
		<li>按三种不同比例（1:3、1:6和1:9）进行传代，以获得不同的细胞密度。向细胞沉淀中加入900 µl培养基并重悬，分别向6孔板每孔加入300 µl、150 µl和100 µl细胞悬液，对应传代比例分别为1:3、1:6和1:9。</li>
		<li>每天更换iPSC培养基，直至克隆出现，通常在第18天左右可见克隆。注：此阶段iPSC克隆与未重编程的FLS共存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>克隆挑取
	<ol>
		<li>通过向48孔板每孔加入500 µl玻连蛋白溶液，室温孵育至少1小时，制备玻连蛋白包被的48孔板。</li>
		<li>将显微镜置于洁净台内，从培养箱中取出6孔板。</li>
		<li>吸除48孔板中的玻连蛋白溶液，每孔加入500 µl含10 mM Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）抑制剂的iPSC培养基。</li>
		<li>使用10 µl移液枪头围绕克隆进行切割，将挑取的克隆转移至48孔板的一个孔中。</li>
		<li>挑取多个克隆后，将细胞置于37 °C、5% CO2条件下培养。</li>
		<li>继续培养细胞直至克隆足够大以便传代。注：通常当克隆超出100倍放大倍数下显微镜视野范围时，我们进行传代。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 免疫荧光染色
<ol>
	<li>细胞准备
	<ol>
		<li>将一个无菌的 18 mm 盖玻片放入 12 孔板中。</li>
		<li>加入 1 ml PBS 以冷却并冲洗盖玻片。</li>
		<li>更换为 1 ml 浓度为 10 µg/ml 的玻璃粘连蛋白（vitronectin）溶液。</li>
		<li>在室温下孵育至少 1 小时。</li>
		<li>弃去玻璃粘连蛋白溶液，将诱导多能干细胞（iPSCs）接种至经玻璃粘连蛋白包被的 12 孔板中，在 37 °C、5% CO2 条件下培养 7 天，每天更换培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞染色
	<ol>
		<li>弃去培养基，用 PBS 洗涤细胞一次。</li>
		<li>用 0.4% 多聚甲醛（PFA）在室温下固定细胞 30 分钟。</li>
		<li>用 0.1% Triton X-100 在室温下对细胞进行通透处理 5 分钟。</li>
		<li>移除通透液，加入含 2% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS 在室温下封闭 30 分钟。</li>
		<li>根据表 1将一抗抗体用含 2% BSA 的 PBS 稀释，并在室温下与细胞孵育 2 小时。</li>
		<li>加入二抗抗体（按 1:200 稀释），在室温下避光孵育 1 小时。</li>
		<li>用终浓度为 1 µl/mL 的 DAPI 处理细胞 10 分钟。</li>
		<li>将盖玻片置于载玻片上，加入抗荧光淬灭剂，在室温下避光孵育 24 小时。</li>
		<li>使用荧光显微镜检测表达情况。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 实时聚合酶链式反应（RT-PCR）
<ol>
	<li>采用硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取法从细胞沉淀中提取 mRNA11。</li>
	<li>以 2 µg 总 mRNA 为模板，通过逆转录扩增 cDNA11。</li>
	<li>使用 2 µl cDNA 模板混合 PCR 所需组分11。</li>
	<li>进行 RT-PCR 并通过凝胶电泳验证结果11。</li>
</ol>
5. 碱性磷酸酶（AP）染色
<ol>
	<li>在染色前，将iPSCs在37 °C、5% CO2条件下培养5-7天。</li>
	<li>吸除培养基，并用4%多聚甲醛（PFA）固定细胞1分钟。</li>
	<li>弃去固定液，用1X漂洗缓冲液冲洗细胞。</li>
	<li>配制碱性磷酸酶（AP）染色试剂。按以下比例混合试剂：Fast Red Violet : Naphthol AS-BI 磷酸盐溶液 : 水 = 2:1:1。</li>
	<li>将细胞与染色液在室温下避光孵育15分钟。</li>
	<li>弃去染色液，用漂洗缓冲液冲洗细胞。</li>
	<li>用PBS覆盖细胞以防止干燥，并使用明场显微镜检测表达情况。</li>
</ol>

<ol><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+urine+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples.</a> Nat Protoc. 7 (12), 2080-2089 (2012).</li>
<li>Haase, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood.</a> Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human blood.</a> Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).</li>
<li>Aasen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+rapid+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes.</a> Nat Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).</li>
<li>Scott, D. L., Wolfe, F., Huizinga, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Rheumatoid arthritis.</a> Lancet. 376 (9746), 1094-1108 (2010).</li>
<li>Chang, S. K., Gu, Z., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-like+synoviocytes+in+inflammatory+arthritis+pathology%3A+the+emerging+role+of+cadherin-11%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-like synoviocytes in inflammatory arthritis pathology: the emerging role of cadherin-11.</a> Immunol Rev. 233 (1), 256-266 (2010).</li>
<li>Bartok, B., Firestein, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast-like+synoviocytes%3A+key+effector+cells+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Fibroblast-like synoviocytes: key effector cells in rheumatoid arthritis.</a> Immunol Rev. 233 (1), 233-255 (2010).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells+from+patients+with+rheumatoid+arthritis+and+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Generation of disease-specific induced pluripotent stem cells from patients with rheumatoid arthritis and osteoarthritis.</a> Arthritis Res Ther. 16 (1), R41(2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在诱导多能干细胞（iPSCs）被发现之前，科学家主要利用胚胎干细胞（ESCs）通过分化来研究干细胞生物学及其他细胞谱系。然而，ESCs来源于囊胚的内细胞团，而囊胚属于早期胚胎。为了分离ESCs，不可避免地需要破坏囊胚，这引发了难以克服的伦理问题。此外，尽管ESCs具有干性特征和多能性，但它们无法从特定个体中获取，因此有时并不适合作为个性化分析和疾病筛选的理想工具。
2007年，Takahashi 等由人成纤维细胞生成的诱导多能干细胞2理论上，与胚胎干细胞（ESCs）不同，诱导多能干细胞（iPSCs）可由任何成体体细胞产生。凭借这一优势，iPSCs 被认为是自体细胞移植的理想工具。此外，基于表观遗传记忆的概念，iPSCs 被视为模拟致病条件的理想细胞材料。 即 疾病建模。已有许多研究利用多种类型的细胞（如血细胞、尿液细胞等）开展。然而，仍有许多细胞类型（如滑膜成纤维样细胞，FLSs）尚未进行重编程研究。
关节炎类疾病是主要的免疫系统疾病，可导致永久性残疾。类风湿关节炎（R...

多能干细胞是多种临床和生物学领域的下一代技术平台。它们是一种极具前景的工具，可用于疾病建模、药物筛选以及再生医学治疗。人类胚胎干细胞（hESCs）曾主要用于研究和理解多能性细胞。然而，由于hESCs的获取需要破坏人类囊胚，因而涉及诸多伦理问题。2007年，山中伸弥博士及其团队逆转了细胞编程过程，成功利用人类成体体细胞培育出干细胞1,2。因此，与hESCs不同，诱导性多能干细胞（iPSCs）可由成熟的体细胞生成，从而避免了伦理障碍。
通常，诱导多能干细胞（iPSCs）是通过导入四个外源基因生成的：Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc。这些山中因子最初是利用慢病毒和逆转录病毒系统递送的。首批 iPSCs 是从小鼠体细胞中获得的3。随后，该技术被应用于人皮肤成纤维细胞1,2。后续研究成功地从多种来源获得了 iPSCs，例如尿液4、血液5,6、角质形成细胞7 以及其他多种细胞类型。然而，仍有一些体细胞尚未用于重编程，且仍需对疾病状态下特定组织来源的不同细胞类型的重编程能力进行筛选。
类风湿关节炎（RA）是一种可累及全身所有关节并导致其他器官发生自身免疫性病变的疾病。在发达国家，约有1%的成年人受此病影响。该病较为常见，且其发病率每年持续上升8。然而，RA在早期阶段难以识别，一旦发生骨质破坏，目前尚无治疗方法能够修复已造成的损伤。此外，药物疗效因患者而异，难以预测适合个体的药物。因此，亟需建立一种药物筛选方法，并需要一种能够反映RA病理状态的细胞材料。
成纤维样滑膜细胞（FLSs）是类风湿关节炎（RA）发病机制中的重要细胞参与者9,10滑膜衬里细胞（FLS）存在于关节囊与关节腔之间的滑膜内层，该结构也被称为滑膜组织。FLS通常在关节结构支持及为周围软骨提供营养方面发挥关键作用，对关节功能和维持至关重要。然而，在类风湿关节炎（RA）中，FLS表现出侵袭性表型。RA患者的FLS具有类似癌症的表型，可通过无限增殖最终破坏周围骨组织。10凭借这一独特特性，FLS 可作为一种极具前景的材料，用于反映类风湿关节炎的病理生物学特征。然而，这些细胞很少被大量制备，且在多次传代过程中细胞表型会发生改变。 体外 因此，使用类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（RA FLSs）作为反映患者病情的工具可能会比较复杂。
理论上，类风湿关节炎（RA）患者来源的诱导多能干细胞（RA-iPSCs）可成为药物筛选及进一步研究的理想工具。所获得的iPSCs具有自我更新能力，可在体外进行维持和扩增in vitro。由于具有多能性，这些细胞可分化为成熟的软骨细胞和成骨细胞谱系，从而为RA及其他骨骼相关疾病的特定研究提供细胞材料11。
本研究中，我们演示了如何从手术切除的滑膜组织中分离并扩增滑膜成纤维样细胞（FLSs），以及如何利用含有山中因子的慢病毒从FLSs诱导生成类风湿关节炎诱导性多能干细胞（RA-iPSCs）。

<table><tbody><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 一次性移液管</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 一次性移液管</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td>12 孔板</td><td>TPP</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;FLS 分离材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术剪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术镊</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6885-100MG</td><td></td></tr><tr><td>封口膜（Parafilm）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>54956</td><td></td></tr><tr><td>PBS/1 mM EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;iPSC 生成材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11885</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸溶液（100×）</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>聚凝胺（Polybrene）</td><td>Chemicon</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>慢病毒（Lentivirus）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12，含 HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>11330-057</td><td>iPSC 培养基成分（500 ml）</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Life Technologies</td><td>25080-094</td><td>iPSC 培养基成分（浓度：543 &amp;mu;g/ml）</td></tr><tr><td>亚硒酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5261</td><td>iPSC 培养基成分&amp;nbsp;（浓度：14 ng/mL）</td></tr><tr><td>人转铁蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3705</td><td>iPSC 培养基成分（浓度：10.7 &amp;mu;g/ml）</td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子 2（bFGF2）</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>iPSC 培养基成分&amp;nbsp;（浓度：100 ng/ml）</td></tr><tr><td>人胰岛素</td><td>Life Technologies</td><td>12585-014</td><td>iPSC 培养基成分（浓度：20 &amp;mu;g/ml）</td></tr><tr><td>人 TGF&amp;beta;1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>iPSC 培养基成分（浓度：2 ng/ml）</td></tr><tr><td>抗坏血酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>iPSC 培养基成分&amp;nbsp;（浓度：64 &amp;mu;g/ml）</td></tr><tr><td>聚凝胺（Polybrene）</td><td>Chemicon</td><td>TR-1003</td><td></td></tr><tr><td>丁酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白（Vitronectin）</td><td>Life Technologies</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 抑制剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;质量控制材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>18 mm 盖玻片</td><td>Superior</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛（PFA）</td><td>Tech &amp;amp; Innovation</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100（Triton X-100）</td><td>BIOSESANG</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Vector Lab</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>抗 SSEA4 抗体</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>抗 Oct4 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>SC9081</td><td></td></tr><tr><td>抗 TRA-1-60 抗体</td><td>Millipore</td><td>MAB4360</td><td></td></tr><tr><td>抗 Sox2 抗体</td><td>Biolegend</td><td>630801</td><td></td></tr><tr><td>抗 TRA-1-81 抗体</td><td>Millipore</td><td>MAB4381</td><td></td></tr><tr><td>抗 Klf4 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab151733</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG（H+L）抗体</td><td>Molecular Probe</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 山羊抗兔 IgG（H+L）抗体</td><td>Molecular Probe</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probe</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>载玻片（涂层）</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Millipore</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid 第一链 cDNA 合成试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>i-Taq DNA 聚合酶</td><td>iNtRON BIOTECH</td><td>25021</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10× TBE 缓冲液</td><td>Life Technologies</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>上样染料（loading star）</td><td>Dyne Bio</td><td>A750</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>1 kb (+) DNA 梯度标记物</td><td>Enzynomics</td><td>DM003</td><td></td></tr><tr><td>碱性磷酸酶</td><td>Millipore</td><td>SCR004</td><td></td></tr></tbody></table>

利用类风湿关节炎患者关节中分离的成纤维样滑膜细胞生成诱导性多能干细胞

Generation of Induced-pluripotent Stem Cells Using Fibroblast-like Synoviocytes Isolated from Joints of Rheumatoid Arthritis Patients

通过一组特定的重编程因子，成熟的体细胞可以被逆转为一种多能干细胞样的状态。许多研究已通过转导四种山中（Yamanaka）转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，从多种体细胞类型中成功生成了诱导性多能干细胞（iPSCs）。iPSCs的研究目前仍处于生物学和临床研究的前沿领域。特别是，患者特异性的iPSCs可作为研究疾病病理生物学的开创性工具，因为iPSCs可以从任何个体的组织中诱导获得。类风湿关节炎（RA）是一种慢性炎症性疾病，其特征是关节内软骨和骨结构的破坏。滑膜增生是导致RA出现这些结果的主要原因或症状之一。成纤维细胞样滑膜细胞（FLSs）是增生性滑膜中的主要组成细胞。关节内的FLSs会无限增殖，最终侵袭邻近的软骨和骨组织。目前，增生的滑膜只能通过外科手术方式切除。切除的滑膜被用作RA研究的材料，以反映关节的炎症状态。作为RA发病机制中的关键参与者，FLSs可被用作生成和研究RA患者iPSCs的材料。在本研究中，我们利用一名RA患者的FLSs生成了iPSCs。通过慢病毒系统，我们发现FLSs能够生成该RA患者特异性的iPSC。由FLSs生成的iPSCs未来可进一步作为研究RA病理生理学的工具。

本研究中，我们描述了一种利用慢病毒系统从滑膜成纤维样细胞（FLSs）生成诱导多能干细胞（iPSCs）的实验方案。图1A展示了滑膜成纤维样细胞分离方案的简要流程。在手术切除滑膜组织后，使用手术剪将组织剪切成小块，随后加入胶原酶以从组织团块中分离细胞。细胞培养14天后进行后续处理。图1B展示了分离获得的FLSs的形态特征。细胞在使用前共传代3次。FLSs具有与普通成纤维细胞相似的特性。我们分离得到的FLSs表达纤维化标志物波形蛋白（Vimentin）和纤连蛋白（Fibronectin）。此外，分离自类风湿关节炎患者的FLSs对巨噬细胞样滑膜细胞标志物CD68呈低表达（图1C）。
FLSs 经收获后，用含有4种山中因子的慢病毒进行转导以诱导重编程。在以不同比例传代细胞后（第7天），开始出现小的克隆。可见的克隆如图所示 图2A...

本文介绍一种利用无饲养层细胞的慢病毒系统，从患者来源的成纤维样滑膜细胞生成人诱导性多能干细胞的实验方案。

成熟的体细胞可通过一组特定的重编程因子被逆转为具有多能性的干细胞样状态。已有大量研究成功生成了……

本实验的总体目标是从类风湿关节炎炎症关节的滑膜组织中分离出的成纤维样滑膜细胞诱导生成诱导性多能干细胞（iPSCs）。目前，iPSCs 可由多种人体原代细胞获得。我们已成功从人成纤维样滑膜细胞中生成了 iPSCs，这类细胞正是类风湿关节炎关节中的关键致病细胞。这有助于研究类风湿性关节炎的病理机制。本实验方案可帮助回答有关使用类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（RA-FLSs）诱导多能干细胞（iPSCs）退变的关键问题。首先将滑膜组织置于一个100毫米培养皿中，并用5毫升添加了抗生素的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗组织。去除黄色脂肪组织和骨残留物。将修整后的组织转移至六孔板的一个孔中，孔内含有5毫升添加了FBS的DMEM培养基，用剪刀将组织剪碎，直至碎片足够小，能够通过一次性移液器吸头。将培养基转移至50毫升锥形管中，然后向孔中加入5毫升新鲜DMEM加FBS，以收集任何残留的组织，并将孔内全部内容物转移至该管中。接下来，将冰上解冻的胶原酶加入离心管中，使其终浓度为 0.01%，用封口膜密封后，在 37 °C 水浴中振荡孵育。四小时后，加入新鲜 DMEM 培养基（含 FBS）至终体积为 50 mL，通过离心收集组织碎片。弃去上清液，注意不要扰动沉淀，然后将细胞重悬于 40 mL 新鲜培养基中，再次进行离心。将第二次获得的沉淀物重悬于25毫升新鲜DMEM加FBS中，静置使较大的组织团块沉降。随后将上清液转移至新的100毫米培养皿中，在37摄氏度和5%CO2条件下培养滑膜细胞14天。为扩增滑膜细胞培养物，弃去用过的培养基，并用5毫升PBS洗涤细胞。吸除 PBS，加入 1 毫升 EDTA，在细胞培养孵箱中孵育 2 分钟以解离细胞。孵育结束后，轻轻敲击培养皿，使残留的贴壁细胞脱落，并将所得细胞悬液转移至 15 毫升锥形离心管中进行离心。将沉淀重悬于 30 毫升 DMEM 和 FBS 中，并将细胞分种至 3 个新的 100 毫米培养皿中。每3天更换一次新鲜培养基，在细胞融合度达到80%时，按前述方法将细胞分种至3个新的培养瓶中。转导第0天，将3 × 10⁴个滑膜成纤维样细胞（FLS）接种于6孔板中，每孔加入新鲜生长培养基，于37°C、5% CO₂条件下过夜培养。次日，将一管含有4种Yamanaka因子的慢病毒在4°C条件下解冻，并将FLS培养基更换为添加了六亚甲基溴化铵（hexadimethrine bromide）和抗坏血酸（ascorbic acid）的FLS生长培养基。待冻存管内物质完全解冻后，向细胞中加入30微升慢病毒液，并轻轻混匀，使病毒均匀分布。为提高感染效率，将培养板离心后放回培养箱，并每天更换含有丁酸钠和抗坏血酸的新鲜FLS生长培养基，持续3天。第4天时，将培养基更换为含丁酸钠和抗坏血酸的FLS生长培养基与iPSC培养基的混合液。第5天，将60微升的玻连蛋白加入6毫升不含钙和镁的PBS中，混匀后每孔加入2毫升该溶液，对6孔板中的3个孔进行包被，室温孵育至少1小时。在玻连蛋白孵育的同时，用PBS洗涤转导后的细胞，并按所示方法用EDTA将其消化解离。离心收集解离的细胞后，将细胞沉淀重悬于900微升新鲜培养基中。吸去孔中多余的玻璃粘连蛋白，将300、150和100微升的细胞分别加入不同的孔中。然后将细胞放回培养箱，每天更换新鲜的iPSC培养基，直至克隆出现。挑选克隆时，首先在已包被玻璃粘连蛋白的48孔板的每个孔中加入500微升含有ROCK抑制剂的iPSC培养基。然后，将 FLS 培养物置于洁净台上的解剖显微镜下，使用 10 微升移液器吸头围绕目标菌落进行切割。用 200 微升移液器吸头将挑取的菌落转移至 48 孔板中的一个孔内。待所有菌落均被挑取后，将该板放入细胞培养箱中孵育，直至菌落生长至适合转移的大小。当细胞集落超出显微镜100倍放大下的可视视野时进行传代。在此图像中，可观察到初始培养14天后分离得到的滑膜成纤维样细胞（FLS）的形态。这些细胞总体上表现出成纤维细胞的特征，表达纤维化标志物波形蛋白（vimentin）和纤连蛋白（fibronectin），并对巨噬细胞样滑膜细胞标志物CD-68呈低表达。在Yamanaka因子慢病毒转导后8至11天，开始出现小的细胞集落，可将其挑取并进行5至10次传代扩增。这些类风湿关节炎诱导多能干细胞表达碱性磷酸酶，表明其仍处于未分化状态。通过RT-PCR和免疫荧光分析证实，这些细胞还表达多能性标志物。核型分析结果显示，类风湿关节炎诱导多能干细胞具有正常的染色体核型44+XY。此外，在注射到SCID小鼠体内12周后，类风湿关节炎诱导多能干细胞（iPSC）形成了畸胎瘤，表现出多种组织表型。通过免疫荧光染色证实了其三胚层分化能力。一旦掌握该技术，即可从滑膜来源的成纤维样滑膜细胞（FLSs）中生成iPSC。观看视频后，您应能更好地理解如何从滑膜组织中分离细胞以及如何利用这些细胞诱导重编程。这些由RAF-FLS衍生的iPSC可用于风湿病学领域的再生研究或药物筛选。一旦建立这些iPSC，便可生成多种类型的靶细胞或器官。这些可能对研究该疾病或其他未来应用（如基因编辑等）具有重要意义。

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科研

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发育生物学

诱导多能干细胞使用成纤维样滑膜生成类风湿关节炎患者的关节分离

本视频展示了使用可诱导的慢病毒表达Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4来生成诱导性多能干细胞的实验步骤。...

通过强制表达 Sox-2、Oct-4、c-Myc 和 Klf4 从小鼠胚胎成纤维细胞生成诱导多能干细胞

我们展示了利用慢病毒介导递送人源因子Oct4、Sox2、Nanog和Lin28，将人体体细胞重编程为诱导性多能干细胞的实验方案。通过细胞形态及胚胎干细胞（ES）特异性标志物的表达，证实了细胞的多能性。...

利用Stemgent人转录因子慢病毒套装重编程人成纤维细胞以生成诱导性多能干细胞

我们介绍一种利用编码Oct3/4、Sox2、Klf4和c-myc（OSKM）的逆转录病毒载体，将人类体细胞高效重编程为人类诱导性多能干细胞（hiPSC），并通过Tra-1-81抗体活细胞染色鉴定正确重编程的hiPSC的实验方案。...

从成人成纤维细胞重编程获得的人诱导性多能干细胞克隆的筛选与分离

本视频展示了一种用于小鼠自身免疫性关节炎的细胞治疗法。将表达卵清蛋白特异性受体的诱导多能干细胞（iPSC）来源的调节性T细胞，与乳化于佐剂中的甲基化牛血清白蛋白（mBSA）共同注射。小鼠抗原呈递细胞（APCs）对mBSA进行加工并将其呈递给T细胞，从而促进T细胞活化并迁移至膝关节滑膜。后续注射在左膝关节仅使用mBSA，而在右膝关节则联合使用mBSA和卵清蛋白。在左膝关节，针对mBSA的免疫反应引发关节炎；而在右膝关节，调节性T细胞与卵清蛋白相互作用，减轻炎症反应，从而改善关节炎症状。...

一种用于小鼠模型中自身免疫性关节炎的细胞疗法

诱导多能干细胞的生成为自体移植的获取提供了广阔的前景。然而，经历多能性状态以及繁琐的再分化过程仍然阻碍着其临床转化。本文描述了成人人类成纤维细胞的获取及其直接转化为诱导性神经前体细胞，并进一步分化为神经谱系细胞的方法。...

成年成人成纤维细胞的分离及其直接转化为可扩增的神经前体细胞

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开发源自干细胞的抗自身免疫抗原特异性调节性T细胞

本文介绍了一种在化学成分明确的条件下将人诱导性多能干细胞分化为每种体节衍生物（肌节、生骨节、生皮节和生腱节）的实验方案，该方法在未来骨科手术的疾病建模和细胞治疗中具有应用价值。...

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从小鼠关节炎组织中分离和培养原代滑膜巨噬细胞与成纤维细胞

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诱导多能干细胞来源的诱导型肌腱细胞的生成 通过 联合Scleraxis过表达与二维单轴拉伸

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了解如何使用慢病毒系统从类风湿关节炎患者的成纤维样滑膜细胞生成诱导多能干细胞。该方法无需饲养层细胞，有助于研究类风湿关节炎的病理机制并推动再生医学应用。

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