从小型猪关节液和骨髓间充质干细胞的分离和细胞表型
2016年7月2日
提出了一种建立间充质干细胞 （MSCs） 的方案，该细胞从小型猪的滑液和骨髓中分离出来，并使用注射器抽吸无创收集。在细胞分离和体外培养来自 MSC 的骨髓和滑液后，使用流式细胞术进行细胞表型分析。
该程序的总体目标是无创收集小型猪的滑液和骨髓，以收集间充质干细胞用于再生和免疫调节研究。这种方法可以帮助回答耳科医生 MSC 治疗领域的关键问题，例如如何在 MSC 中建立滑液，以及如何将它们与骨髓 MSC 进行比较。该技术的主要优点是有效地确定了来自小型猪的滑液和骨髓来源的 MSC 的关键特性，这将有助于在患者身上应用。
这项技术的影响延伸到各种关节疾病的治疗，因为在运动患者中，滑液衍生的 MSC 在滑膜腔中的种群显着增加。虽然这种方法可以提供对再生医学的见解，但它也可以应用于其他研究，例如自身免疫性疾病研究。由于小型猪 MSC 是自体的，因此免疫抑制可能会引起人类的兴趣。
除了其他科学家之外，演示该程序的还有我三级的 Hyeon-Jeong Lee 和 Won-Jae Lee。首先，定位麻醉的迷你猪以进入髂嵴。接下来，使用剃须刀或剪刀在髂嵴上剥离 15 平方厘米的区域。
然后，交替用聚维酮碘和 70% 乙醇擦洗裸露的皮肤 3 次。完全干燥后，贴上无菌窗帘。现在，使用 3 到 4 毫升的冲洗液在 10 毫升注射器上预涂肝素。
这将防止骨髓在提取时凝固。然后，精确地在髂骨嵴处，将骨髓提取器紧紧地连接到肝素涂层注射器上，并提取至少 5 毫升骨髓。为了从提取的骨髓中分离细胞，首先在室温下用等体积的 DPBS 在 15 毫升锥形管中稀释。
然后，将 3 mL 密度离心填料加载到第二个 15 mL 锥形管中。接下来，小心地将 4 毫升稀释的骨髓转移到密度离心培养基上，以形成两层溶液。现在，在室温下以 400 Gs 离心试管 40 分钟。
所需的 MNC 收集在中央白色层中。只吸出这一层。将 MNC 层弹出到 15 毫升锥形管中，并用 7 到 8 毫升 DPBS 稀释。
然后，在室温下以 500 G 离心细胞 10 分钟。弃去上清液，用 10 毫升 DPBS 洗涤托盘细胞两次，重复之前的离心循环。两次洗涤后，我们将 MNC 悬浮在 2 毫升 ADMEM 中。
然后，将细胞加载到 35 毫米的组织培养皿上，并在 38.5 摄氏度下在加湿的 5% 二氧化碳培养箱中孵育。48 小时后，吸出培养基以及未附着的 MNC。然后，加回 2 毫升新鲜 ADMEM，继续孵育，每三天更换一次培养基。
当细胞达到 70% 至 80% 汇合时，用新鲜的 DPBS 洗涤培养物。然后，在 37 摄氏度下使用 1 毫升 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 解离细胞 3 到 5 分钟。将细胞收集在 10 毫升 ADMEM 中，并将它们转移到 15 毫升锥形管中。
然后，在室温下以 300 G 的浓度离心细胞 5 分钟，并弃去上清液。现在，将收获的 MNC 悬浮在一毫升新鲜的 ADMEM 中，并测量它们的密度。最后将 1/2 到 3/400 万个细胞接种到 T25 培养瓶中，加入 4 毫升 ADMEM。
像培养板一样孵育培养瓶，每三天更换一次培养基。在股骨关节上准备一块 15x10 厘米的皮肤，就像准备骨髓采集时所做的那样。然后，触诊皮肤下的髌骨和胫骨嵴以识别滑膜关节，并将带有 23 号针头的 3 毫升注射器精确地插入关节。
轻轻抽吸，提取 1/2 到 1 毫升液体，然后立即抽出针头。如果滑液量太小，则用 DPBS 冲洗腔，以用 DPBS 收集滑液。要使用的 DPBS 体积随滑膜腔的大小而变化。
健康关节的最佳滑液量是有限的。体积随其关节的大小和病理状况而变化。为了从滑液中分离细胞，在室温下在 15 毫升锥形管中用等体积的 DPBS 稀释液体。
接下来，我们通过 40 微米尼龙细胞过滤器过滤稀释液来移动碎片。然后，再加入 10 毫升 DPBS，并在室温下以 400 Gs 离心悬浮液 10 分钟。接下来，弃去上清液，并使用 DPBS 洗涤细胞两次。
我们将洗涤过的细胞托盘悬浮在 2 毫升 ADMEM 中。然后，按照 MSC 证明的那样继续培养细胞。从小型猪的骨髓和关节滑膜关节中成功分离出 MSC 并在体外扩增。
滑液来源的 MSC 的形态与骨髓来源的 MSC 相似：两者都具有成纤维细胞纺锤形并且均匀粘附。第三次传代培养完成后，MSCs 的碱性磷酸酶染色呈阳性表达。接下来，分析两种培养物中的表面标志物。
正如预期的那样，两种类型的 MSC 都显著表达 CD29 、 CD44 和 Vimentin。相比之下，CD34 和 CD45 的表达为阴性且较低。这些结果与通过独特的 MSC 获得的结果相同，包括从滑液中分离的细胞。
看完这个视频，你应该对如何无创抽吸滑液和骨髓有一个很好的了解，以便从小型猪中分离出它们的 MSC，以及如何对这种 MSC 进行比较和表型分析。在尝试此程序时，重要的是要记住将目标点定位在髂嵴和滑膜上，通过仔细触诊来确定。在此程序之后，可以执行其他方法，例如在骨关节炎或类风湿性关节炎模型中，以回答其他问题，例如是否不仅来自骨髓 MSC，而且滑液 MSC 是否具有相同的软骨或骨骼起始和免疫抑制能力。
开发后，该技术通过帮助表征关节炎患者受攻击或发炎关节的 MSC，推进了关节疾病的自体治疗。
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概述
本文介绍了一种从小型猪的滑液和骨髓中非侵入性收集间充质干细胞（MSCs）的协议。该研究强调了对这些细胞进行表征对于再生医学和免疫调节应用的重要性。
关键研究组成部分
科学领域
- 再生医学
- 干细胞研究
- 免疫调节
背景
- 间充质干细胞（MSCs）具有潜在的治疗应用。
- 小型猪是研究人类疾病的宝贵模型。
- 滑液来源的MSCs可能与骨髓来源的MSCs不同。
- 了解这些差异可以增强关节疾病的治疗策略。
研究目的
- 建立从小型猪非侵入性收集MSCs的方法。
- 比较滑液和骨髓来源MSCs的特性。
- 探索关节疾病治疗和自身免疫研究的影响。
使用的方法
- 使用注射器抽吸非侵入性收集滑液和骨髓。
- MSCs的分离和体外培养。
- 使用流式细胞术进行细胞表型分析。
- 比较不同来源MSCs的特性。
主要结果
- 成功从滑液和骨髓中分离出MSCs。
- MSCs的表征显示基于其来源的不同特性。
- 研究结果支持MSCs在治疗关节疾病中的潜力。
- 所获得的见解可能为未来的自身免疫疾病研究提供信息。
结论
- 该协议提供了从小型猪收集MSCs的可靠方法。
- 对不同来源的MSCs进行表征对于治疗应用至关重要。
- 本研究有助于理解MSCs在再生医学中的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Non-invasive isolation and phenotyping of mesenchymal stem cells (MSCs) from minipig synovial fluid and bone marrow enables robust comparative analysis of cell sources for regenerative and immunomodulatory research. This workflow supports early-stage target validation and de-risks translational studies by providing standardized, reproducible MSC populations for downstream applications. The approach enhances predictive confidence in preclinical model selection and portfolio advancement for cell-based therapies targeting joint and autoimmune diseases.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct comparison of MSCs from distinct tissue sources for functional target validation.
- Supports biological de-risking by confirming phenotypic equivalence of synovial and marrow-derived MSCs.
- Facilitates hypothesis testing on MSC immunomodulatory and regenerative properties.
- Provides a foundation for mechanistic studies in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Delivers validated MSC populations for assay standardization and reproducibility.
- Enables quantitative flow cytometry-based phenotyping for robust screening outputs.
- Supports preparation of scalable, homogeneous cell systems for compound evaluation.
- Improves readiness for high-content screening and platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Aligns MSC sourcing with disease-relevant preclinical models for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement of autologous cell therapy candidates.
- Supports biomarker alignment through surface marker analysis and functional assays.
- De-risks preclinical studies by confirming cell identity and comparability across sources.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by supplying standardized MSCs for target validation, assay development, and translational research in joint and autoimmune disease models.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis testing and pathway clarification using well-characterized MSCs.
- Screening: Enables reproducible, quantitative phenotyping for assay development and compound screening.
- Analytics: Delivers flow cytometry-based surface marker data for comparative analysis of cell populations.
- Translational Research: Supports continuity from early discovery through preclinical validation in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for MSC isolation and characterization across multiple studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in MSC-based research.
- Operational Value: Standardizes cell isolation and phenotyping for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency in cell therapy pipelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of MSC-based therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile tissue handling and flow cytometry analysis.
- Needs access to centrifugation, cell culture, and analytical instrumentation.
- Demands cross-team standardization of isolation and phenotyping protocols.
- Adaptable to various preclinical models with attention to joint size and fluid volume.
- Limited by synovial fluid availability in healthy versus diseased joints.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:39
Collecting Bone Marrow from Minipigs
2:47
Isolation of Cells and In Vitro Cultivation
4:42
In Vitro Cultivation of Cells Isolated from Bone Marrow
6:18
Collecting Synovial Fluid and Cultivating Isolated Cells
8:19
Results: Bone Marrow- and Synovial Fluid-derived MSC Morphology and Cell Surface Marker Expression
9:23
Conclusion
