从迷你猪滑膜液和骨髓中分离间充质干细胞及其细胞表型分析

本实验的主要目标是从小型猪无创采集滑膜液和骨髓，以获取间充质干细胞，用于组织再生和免疫调节研究。该方法有助于解答耳科学间充质干细胞治疗领域中的关键问题，例如如何建立滑膜液来源的间充质干细胞，以及如何将其与骨髓来源的间充质干细胞进行表征比较。该技术的主要优势在于能够有效建立小型猪滑膜液和骨髓来源间充质干细胞的关键特性，为未来临床应用提供支持。

该技术对于多种关节疾病的治疗具有重要意义，因为在运动员患者中，滑膜腔内滑液来源的间充质干细胞（MSC）数量显著增加。尽管该方法可为再生医学研究提供重要见解，亦可应用于其他研究领域，例如自身免疫性疾病的研究。由于小型猪的间充质干细胞为自体来源，其免疫抑制特性可能对人类具有研究价值。

除其他科研人员外，本次操作演示将由我实验室的 Hyeon-Jeong Lee 和 Won-Jae Lee 完成。首先，将麻醉后的迷你猪体位调整至便于接触髂嵴的位置。接着，使用剃刀或电推剪对髂嵴区域约 15 平方厘米的范围进行脱毛处理。

然后，用聚维酮碘和70%乙醇交替擦拭暴露的皮肤三次。待皮肤完全干燥后，铺上无菌巾。现在，用3至4毫升肝素溶液冲洗一支10毫升注射器，以预先包被。

这可以防止骨髓在提取过程中凝固。然后，在髂骨嵴处，将骨髓抽取器紧密连接至涂有肝素的注射器上，准确抽取至少五毫升骨髓。为了从提取的骨髓中分离细胞，首先在室温下将骨髓与等体积的DPBS在15毫升锥形管中稀释。

然后，将3毫升密度梯度离心液加入另一个15毫升锥形管中。接着，小心地将4毫升稀释后的骨髓液转移至密度梯度离心液上层，形成两层液体。现在，将该管在室温下以400 ×g离心40分钟。

目标单个核细胞位于中间白色层中。吸取该层液体，将其转移至15毫升锥形离心管中，并用7至8毫升DPBS稀释。

然后，在室温下以 500 ×g 离心细胞 10 分钟。弃去上清液，并用 10 毫升 DPBS 重悬细胞沉淀，洗涤两次，每次均重复上述离心步骤。两次洗涤后，将单个核细胞（MNCs）重悬于 2 毫升 ADMEM 中。

然后，将细胞接种至35毫米的组织培养皿中，在38.5摄氏度、含5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育。48小时后，吸除培养基及未贴壁的单个核细胞。随后，重新加入2毫升新鲜ADMEM培养基，继续孵育，并每三天更换一次培养基。

当细胞融合度达到70%至80%时，用新鲜DPBS洗涤培养物。随后，在37摄氏度条件下，使用1毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA消化3至5分钟。用10毫升ADMEM收集细胞，并转移至15毫升圆锥形离心管中。

然后，在室温下以300 ×g离心5分钟，沉淀细胞，并弃去上清液。接着，将收集的单个核细胞（MNCs）重悬于1毫升新鲜ADMEM培养基中，并测定细胞密度。最后，将每半百万至七十五万个细胞接种至含有4毫升ADMEM培养基的T25培养瓶中。

将培养瓶与培养板同样孵育，并每隔三天更换一次培养基。在股骨关节处准备一块15×10厘米的皮肤区域，操作方式与采集骨髓前的准备相同。然后，在皮肤下触诊以定位髌骨和胫骨嵴，确定滑膜关节位置，随后将一支3毫升注射器（配23号针头）准确插入关节腔内。

使用轻柔的负压抽吸，抽取0.5至1毫升液体，随后立即拔出针头。若滑膜液量过少，则用DPBS冲洗关节腔，以收集与DPBS混合的滑膜液。DPBS的使用体积应根据滑膜腔的大小而定。

健康关节中滑膜液的最佳体积有限，其体积随关节的大小和病理状况而变化。为从滑膜液中分离细胞，需在室温下将滑膜液与等体积的DPBS加入15毫升锥形管中进行稀释。

接下来，通过40微米的尼龙细胞滤网过滤稀释液，以去除碎片。然后加入10毫升DPBS，将细胞悬液在室温下以400 × g离心10分钟。随后弃去上清液，并用DPBS洗涤细胞两次。

将洗涤后的细胞沉淀重悬于2 mL ADMEM中，随后按照间充质干细胞（MSCs）的培养方法进行细胞培养。间充质干细胞已成功从小型猪的骨髓和关节滑膜组织中分离，并在体外扩增。

滑膜液来源的间充质干细胞（MSCs）形态与骨髓来源的间充质干细胞相似：两者均呈成纤维细胞样梭形，且均匀贴壁生长。在完成第三次传代培养后，MSCs 显示出碱性磷酸酶染色阳性表达。接下来，对两种培养物中的表面标志物进行了分析。

与预期一致，两种类型的MSC均显著表达CD29、CD44和波形蛋白（Vimentin）。相比之下，CD34和CD45的表达呈阴性或低表达。这些结果与其他来源的典型MSC结果相同，包括从滑膜液中分离的细胞。

观看本视频后，您应能够充分掌握如何以非侵入性方式从小型猪中抽吸滑膜液和骨髓以分离其间充质干细胞（MSC），并了解如何对这些MSC进行比较分析和表型鉴定。在实施该操作时，需特别注意通过仔细触诊准确定位髂嵴和滑膜的目标穿刺点。在完成本操作后，可进一步开展其他研究，例如在骨关节炎或类风湿关节炎模型中，探究不仅骨髓来源的MSC，滑膜液来源的MSC是否同样具备软骨或成骨分化能力以及免疫抑制功能，以回答更多相关科学问题。

该技术在开发后，通过帮助表征关节炎患者受累或发炎关节中分离的间充质干细胞（MSCs），推动了关节疾病的自体治疗发展。