Name: 在C2C12肌细胞造型强直性肌营养不良1 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 了解如何使用质粒转染、逆转录病毒和慢病毒转导技术，在C2C12肌母细胞中建立强直性肌营养不良1型细胞模型。该方法有助于研究肌营养不良的发病机制并探索潜在治疗策略。

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我们感谢贝勒医学院的 Tom Cooper 博士、威斯康星大学麦迪逊分校的 Mani S. Mahadevan 博士以及日内瓦大学的 Didier Trono 博士提供的试剂。本研究得到休斯顿大学启动基金（YL）、美国心脏协会资助（YL，11SDG5260033）和国家自然科学基金（XP，81460047）的支持。

1. C2C12 细胞培养
<ol>
	<li>在100 mm培养皿中，使用含20%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 µg/ml链霉素和2 mM L-谷氨酰胺的增殖培养基（Dulbecco改良Eagle培养基，DMEM）培养C2C12小鼠成肌细胞。使传代后的C2C12细胞生长至约50–60%融合度。</li>
	<li>弃去增殖培养基，用3 ml室温磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤C2C12细胞。吸除PBS后，加入500 µl 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液以解离细胞。将培养皿置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育3–5分钟。</li>
	<li>加入3 ml增殖培养基以中和胰蛋白酶活性。轻吹6–8次使细胞充分悬浮。取1 ml细胞悬液接种至新的100 mm培养皿中，于37 °C、5% CO2条件下培养。</li>
</ol>
2. C2C12 细胞转染/转导及筛选
<ol>
	<li>C2C12 质粒转染
	<ol>
		<li>转染前 24 小时，将 7.0 × 105 个 C2C12 细胞接种至六孔板的每个孔中，每孔对应一次转染。 
		注意：此时细胞在转染时将达到 50 - 60% 的融合度。</li>
		<li>使用前将转染试剂恢复至室温。</li>
		<li>将 2 µg 质粒 DNA（GFP-CUG5 或 GFP-CUG200）加入 200 µl 预热的无血清培养基中，短暂涡旋混匀。向其中加入 6 µl 转染试剂，并立即用涡旋振荡器混合 30 秒。室温孵育该混合物 30 分钟。</li>
		<li>将 C2C12 细胞的培养基更换为 2.5 ml 无血清生长培养基。孵育结束后，将转染混合物加入细胞中。将培养板放回 5% CO2、37 °C 的培养箱中。</li>
		<li>使细胞在转染混合物/无血清生长培养基中继续培养 4 小时或过夜。次日或当细胞毒性明显时，更换为常规生长培养基。 
		注意：细胞毒性通过显微镜观察细胞进行评估。观察细胞形态变化和细胞脱落情况。只要无明显细胞毒性，在无血清生长培养基中过夜孵育可提高转染效率。</li>
		<li>转染后 48 小时开始加药筛选：加入 1.2 - 1.6 mg/ml G418，持续约 10 天，直至对照组（未转染质粒的细胞）中无存活细胞。每隔两天更换一次含 G418 的生长培养基。</li>
		<li>将获得 G418 抗性的细胞维持在生长培养基中，并于 37 °C、5% CO2 条件下培养，用于后续实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>逆转录病毒制备及 C2C12 逆转录病毒感染
	<ol>
		<li>通过在 DMEM 高糖培养基中添加 10% 胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 µg/ml 链霉素和 2 mM L-谷氨酰胺，配制 HEK 293 培养基。
		<ol>
			<li>转染前约 24 小时，将 4.0 × 106 个亲嗜性 HEK 293 包装细胞接种至 100 mm 培养皿中（转染时融合度约为 80%），加入细胞培养基。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用前将转染试剂恢复至室温。</li>
		<li>将 15 µg 质粒 DNA（pMSCV-Puro 或 pMSCV-Celf1Flag-Puro）溶于 1 ml 无血清生长培养基中，短暂涡旋混匀。向 DNA/无血清生长培养基管中加入步骤 2.2.2 中的 30 µl 转染试剂，充分涡旋混匀。室温孵育 30 分钟。</li>
		<li>将转染混合物逐滴加入亲嗜性 HEK 293 包装细胞中。轻轻晃动培养皿后放回 5% CO2、37 °C 培养箱。24 小时后，更换为 10 ml 预热的新鲜生长培养基。</li>
		<li>转染后 48 小时，用移液器收集上清液（含逆转录病毒），转移至 50 ml 离心管中。向培养皿中加入 10 ml 新鲜温热培养基，并放回培养箱。将上清液置于 4 °C 保存。 
		注意：加液时应沿皿壁缓慢加入，避免破坏细胞单层。</li>
		<li>转染后 60 小时收集第二批上清液，并与步骤 2.2.5 收集的上清液合并。在 4 °C 条件下以 500 × g 离心 7 分钟，去除细胞碎片。</li>
		<li>将上清液转移至新的 50 ml 离心管中。此时可直接用于感染 C2C12 细胞（进入步骤 2.2.9），或分装后于 -20 °C 保存以备后续使用。</li>
		<li>若使用冻存病毒，需在室温下解冻步骤 2.2.7 所得的逆转录病毒。 
		注意：避免反复冻融。</li>
		<li>在感染当天接种 C2C12 细胞，目标融合度为 30 - 40%。
		<ol>
			<li>弃去生长培养基，用 3 ml 室温 PBS 洗涤 C2C12 细胞，吸除 PBS 后加入 500 µl 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 3 - 5 分钟。</li>
			<li>加入 3 ml 生长培养基中和胰蛋白酶活性。吹打 6 - 8 次使细胞悬浮。使用血细胞计数板计数后，将 8.0 × 105 个 C2C12 细胞接种至 60 mm 培养皿中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在 3 ml 生长培养基中加入 0.5 ml 逆转录病毒以感染一个 60 mm 培养皿的细胞。将培养皿放回培养箱。</li>
		<li>感染后 48 小时，更换为含筛选抗生素（嘌呤霉素 1 - 3 µg/ml）的新鲜培养基 3 ml。每天更换一次含抗生素的培养基，持续约 5 天，直至未转导的 C2C12 对照组细胞完全死亡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>慢病毒制备及 C2C12 慢病毒感染 
	注意：所有与慢病毒相关的操作均应在生物安全二级柜中进行，并遵守生物安全操作规范。含病毒的液体废弃物在丢弃前必须进行消毒处理。
	<ol>
		<li>转染前 24 小时，在 100 mm 培养皿中接种 4.0 × 106 个 293T 细胞（转染当天融合度约为 80%），使用 HEK 293 细胞培养基（DMEM 高糖培养基，添加 10% 胎牛血清、100 U/ml 青霉素、100 µg/ml 链霉素和 2 mM L-谷氨酰胺）。</li>
		<li>将转染试剂升温至室温。将慢病毒包装载体（4 µg pMD2.G 和 6 µg psPAX2）与 8 µg 慢病毒转移载体（Celf1 shRNA 或乱序对照 shRNA）共同溶于 1 ml 无血清细胞培养基中，短暂涡旋混匀。</li>
		<li>向 DNA/DMEM 混合液中加入 36 µl 预热的转染试剂，充分涡旋混匀。室温孵育 30 分钟。</li>
		<li>从培养箱中取出 293T 细胞，将转染混合物加入培养皿中。轻轻晃动后放回 5% CO2、37 °C 培养箱。24 小时后，弃去转染混合物，更换为 10 ml 新鲜培养基。</li>
		<li>转染后 48 小时收集含慢病毒的上清液，转移至 50 ml 离心管中。向培养皿中加入 10 ml 新鲜温热培养基，并放回培养箱。将上清液保存于 4 °C。</li>
		<li>转染后 60 小时收集第二批上清液，与步骤 2.3.5 的上清液合并。在 4 °C 条件下以 500 × g 短暂离心 7 分钟。</li>
		<li>将上清液转移至新的 50 ml 离心管中。若使用新鲜病毒，直接进入步骤 2.3.9；若需保存，将含病毒的上清液分装为每管 10 ml，于 -20 °C 保存以备后续使用。</li>
		<li>若使用冻存病毒，使用前在室温下解冻步骤 2.3.7 所得的病毒。 
		注意：避免反复冻融。</li>
		<li>在感染当天，按照步骤 2.2.9 的方法接种 C2C12-CUG200 细胞（来自第 2.1 节）。 
		注意：目标融合度为 30 - 40%。</li>
		<li>向一个 60 mm 培养皿的 C2C12-CUG200 细胞中加入 0.5 ml 病毒，感染后将培养皿放回培养箱。</li>
		<li>转导后 72 小时，更换为含筛选抗生素（嘌呤霉素 1 - 3 µg/ml）的新鲜培养基。每天更换一次含抗生素的培养基，持续约 5 天，直至所有未转导的 C2C12-CUG200 对照组细胞完全死亡。</li>
		<li>通过 Western blot 检测 GFP-CUG200 转染细胞中 Celf1 的敲低效果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. C2C12 细胞分化
<ol>
	<li>在诱导分化前24小时，将2 × 106 个细胞接种于6孔板的一个孔中，加入2.5 ml生长培养基。 
	注意：可根据情况调整接种密度，以确保细胞在24小时内达到完全汇合。
	<ol>
		<li>用PBS洗涤汇合的细胞，加入2.5 ml低血清分化培养基（DMEM培养基添加2%马血清、100 U/ml青霉素、100 µg/ml链霉素、2 mM L-谷氨酰胺和1 µM胰岛素）。每两天更换一次培养基。 
		注意：胰岛素原液应保存于冷冻状态，并在每次换液时加入培养基中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在C2C12细胞分化过程中，于以下时间点收集样品进行定量RT-PCR分析（见第4节）：第0、1、2、4和6天。在第6至8天对培养物进行免疫染色处理（见第5节）。</li>
</ol>
4. RNA 提取与定量 RT-PCR
<ol>
	<li>按照制造商的说明书进行RNA提取。提取后，将RNA沉淀重悬于30 µl无RNase的水中，并用移液器上下吹打数次。 
	注意：样品可直接进行定量RT-PCR，或于-80 °C保存。</li>
	<li>使用RT qPCR试剂盒进行定量RT-PCR10，并遵循制造商的操作说明。根据表1配制反应体系。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>体积 (µl)</td>
			<td>终浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x 反应缓冲液</td>
			<td>10</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>正向引物</td>
			<td>0.5</td>
			<td>200 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>反向引物</td>
			<td>0.5</td>
			<td>200 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>探针</td>
			<td>0.5</td>
			<td>200 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>逆转录酶 &amp;#38; RNase 抑制剂</td>
			<td>0.1</td>
			<td>0.25 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>模板</td>
			<td>1</td>
			<td>100 ng 总 RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>无 RNase 水</td>
			<td>7.4</td>
			<td>不适用</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>总反应体系</td>
			<td>20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 定量RT-PCR预混液的配制
<ol start="3">
	<li>使用热循环程序 表2 进行 20 µl 的 RT-qPCR 反应。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>逆转录步骤</td>
			<td>30 分钟，48 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA 聚合酶激活/逆转录酶失活</td>
			<td>10 分钟，95 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">40 个循环</td>
			<td>15 秒，95 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 分钟，60 °C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2. 定量RT-PCR热循环程序
5. 免疫染色
<ol>
	<li>在室温下用 2.5 ml 新鲜配制的 4% 多聚甲醛/PBS 固定单层细胞 10 分钟。</li>
	<li>在室温下用 2.5 ml 0.1% Triton X-100/PBS 处理样品 30 分钟以进行透化。</li>
	<li>将样品转移至加湿孵育盒中。在37 °C下，用2.5 ml封闭缓冲液（0.1%非离子型表面活性剂/PBS，10%正常山羊血清）封闭样品30分钟。</li>
	<li>弃去封闭缓冲液，加入800 µl用封闭缓冲液按1:100稀释的一抗（抗肌球蛋白重链抗体），于湿盒中室温孵育过夜。</li>
	<li>第2天用2.5 ml洗涤缓冲液（0.1%吐温20/PBS）洗涤平板3次，每次10分钟。</li>
	<li>吸去洗涤缓冲液，加入800 µl二抗（山羊抗小鼠IgG，用PBS按1:500稀释）。在湿盒中室温孵育1小时。</li>
	<li>用2.5 ml洗涤缓冲液洗涤两次，每次10分钟。</li>
	<li>加入800 µl DAPI（1 µg/ml，溶于去离子蒸馏水）孵育25 分钟</li>
	<li>用2.5 ml洗涤缓冲液再次洗涤10分钟。</li>
	<li>更换洗涤缓冲液为2.5 ml PBS，使用荧光显微镜采集图像。</li>
</ol>

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<li>Koshelev, M., Sarma, S., Price, R. E., Wehrens, X. H. T., Cooper, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart-specific+overexpression+of+CUGBP1+reproduces+functional+and+molecular+abnormalities+of+myotonic+dystrophy+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1.</a> Hum Mol Genet. 19 (6), 1066-1075 (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

C2C12细胞系已被用作研究肌生成的模型11-14。这些细胞具有成纤维细胞样的形态，在含有20%胎牛血清的培养基中快速增殖，并可在含有2%马血清的培养基中 readily 发生分化15。快速生长和分化能力是肌生成细胞模型中的有利特性。本文展示了使用质粒、逆转录病毒和慢病毒载体将cDNA、3'-非翻译区（3'-UTR）和shRNA导入C2C12细胞的方法。以下重点说明转染/转导以及维持分化一致性的关键步骤。
日常细胞培养中的细胞密度至关重要。这些细胞的培养密度应低于50 - 70%融合度。由于C2C12细胞群体倍增时间较短，若融合度过高（&#62; 70%），在过夜培养后会自发发生分化。尽管自发分化的细胞比例可能较小，但其存在将导致后续分化实验结果不一致。此外，建议使用冻存后新复苏且传代次数较低的C2C12细胞。进行分化实验时，应以预先确定的细胞数量接种，使其在24小时后达到完全融合。胰岛素应分装成小份冷冻保存，并在每次更换分化培养基时添加。这些措施可提高分化实验的成功率。
无血清培养...

强直性肌营养不良症（DM）是一种常染色体显性遗传病，可影响多个系统，尤其是心肌和骨骼肌1。该疾病分为两种亚型：DM1 和 DM2。DM1 比 DM2 更常见，且临床表现更为严重2。DM1 的致病遗传突变为位于强直性肌营养不良蛋白激酶基因（DMPK）3'非翻译区（UTR）的CUG三核苷酸重复序列扩增3。在健康个体中，CUG重复次数为5至37次；而在DM1患者中，该重复次数增加至50次以上，有时甚至可达数千次4。因此，RNA结合蛋白（如肌肉盲样蛋白1（MBNL1）、CUGBP以及Elav样家族1（Celf1））的表达发生异常调控。由于被扩增的CUG重复序列异常捕获，MBNL1丧失了调控选择性剪接的功能5；而Celf1则出现上调表达6,7。Celf1的过表达与肌肉萎缩和肌无力相关，这种表型并非由MBNL1功能缺失引起。目前已建立多种模拟DM1相关改变的动物模型，包括DMPK 3'-UTR中CUG重复扩增、MBNL1缺失以及Celf1过表达等模型。然而，在成肌细胞中建立DM1模型提供了一种高效的替代方案，尤其适用于解析与DM1相关的细胞和分子事件。
C2C12 成肌细胞系最初从受伤的 C3H 小鼠肌肉中分离获得，现已被广泛用于研究成肌分化8,9。C2C12 细胞在含胎牛血清（FBS）的培养基中可快速增殖，当去除 FBS 后则易于启动分化。然而，使用该成肌细胞分化模型存在两个挑战：C2C12 细胞通常对基因转染或病毒转导具有抗性；此外，细胞操作和分化流程中的细微差异都可能导致肌管形成出现显著变化。
我们的实验室常规使用C2C12成肌细胞作为细胞模型，并已开发出通过质粒转染、逆转录病毒转导和慢病毒转导将基因有效导入C2C12细胞系的实验方案10。在视频中，我们展示了转染/转导C2C12细胞的优化步骤，以及在建立强直性肌营养不良1型（DM1）成肌细胞模型过程中维持分化一致性的方法。

<table><tbody><tr><td>DMEM，高糖</td><td>Life Technologies</td><td>11965-084</td><td>用于培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清 - 优质</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>用于培养基</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100倍浓度）</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td>用于培养基</td></tr><tr><td>牛胰岛素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6634-100MG</td><td>用于分化培养基</td></tr><tr><td>马血清</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12150</td><td>用于分化培养基</td></tr><tr><td>FuGENE&amp;nbsp;HD 转染试剂</td><td>Promega</td><td>E2311&amp;nbsp;</td><td>用于转染</td></tr><tr><td>G418 硫酸盐&amp;nbsp;</td><td>Gold Biotechnology&amp;nbsp;</td><td>G-418-10</td><td>用于药物抗性筛选</td></tr><tr><td>嘌呤霉素二盐酸盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>sc-108071</td><td>用于药物抗性筛选</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris 蛋白凝胶，1.0 mm，15 孔</td><td>Life Technologies</td><td>NP0323BOX</td><td>用于 Western 印迹</td></tr><tr><td>NuPAGE 转膜缓冲液（20倍浓度）</td><td>Life Technologies</td><td>NP00061</td><td>用于 Western 印迹</td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS 电泳缓冲液（20倍浓度）</td><td>Life Technologies</td><td>NP0002</td><td>用于 Western 印迹</td></tr><tr><td>Amersham Protran 支持型 0.2 NC，300 mm × 4 m</td><td>GE healthcare life science</td><td>10600015</td><td>用于 Western 印迹</td></tr><tr><td>MF 20</td><td>发育杂交瘤库</td><td>MF 20</td><td>免疫染色一抗</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG（H+L）二抗，Texas Red-X 标记</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T-862</td><td>免疫染色二抗</td></tr><tr><td>一步法 qRT-PCR 主混合液</td><td>AnaSpec</td><td>05-QPRT-032X</td><td>用于 qRT-PCR</td></tr><tr><td>TriPure 提取试剂</td><td>Roche</td><td>11667165001</td><td>用于 RNA 提取</td></tr><tr><td>CUG-BP1 抗体（3B1）</td><td>santa cruz</td><td>sc-20003</td><td>Western 印迹一抗</td></tr><tr><td>肌动蛋白抗体</td><td>santa cruz</td><td>sc-1615</td><td>山羊多克隆 IgG，用于上样对照</td></tr><tr><td>293T Ecopack</td><td>Clontech</td><td>631507</td><td>用于逆转录病毒制备的细胞</td></tr><tr><td>pMSCV-puro</td><td>Clontech</td><td>634401</td><td>空载逆转录病毒载体，用于逆转录病毒制备</td></tr><tr><td>pMSCV-Celf1Flag-puro</td><td>实验室构建</td><td>不可用</td><td>编码 Celf1Flag 的逆转录病毒载体，用于逆转录病毒制备</td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>由 Didier Trono 惠赠</td><td>不可用</td><td>用于慢病毒制备</td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>由 Didier Trono 惠赠</td><td>不可用</td><td>用于慢病毒制备</td></tr><tr><td>GFP-CUG5</td><td>由 M.S. Mahadevan 惠赠</td><td>不可用</td><td>详见参考文献10&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>GFP-CUG200</td><td>由 M.S. Mahadevan 惠赠</td><td>不可用</td><td>详见参考文献10&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Triton&amp;nbsp;X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>用于免疫染色</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>用于免疫染色</td></tr><tr><td>TWEEN&amp;nbsp;20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416</td><td>用于免疫染色</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td>用于免疫染色</td></tr></tbody></table>

在c2c12成肌细胞中建立强直性肌营养不良症1型模型

Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

强直性肌营养不良1型（DM1）是一种常见的肌营养不良症。尽管已建立了多种DM1动物模型，但成肌细胞模型仍然具有重要意义，因为它们为研究细胞和分子事件提供了高效的细胞替代方案。虽然C2C12成肌细胞已被广泛用于研究成肌过程，但其对基因转染或病毒转导的抗性限制了在C2C12细胞中的研究。本文介绍了一种优化的实验方案，包括日常培养、将基因导入C2C12成肌细胞的转染与转导操作，以及诱导肌细胞分化的步骤。总体而言，这些操作可实现最佳的转染/转导效率，并获得稳定的分化结果。本方案在建立DM1成肌细胞模型方面的应用，将有助于强直性肌营养不良及其他肌肉疾病的研究。

将C2C12细胞转染GFP-CUG5或GFP-CUG200。经药物抗性筛选后，建立稳定细胞池，可通过GFP表达进行观察（图1A）。通过肌球蛋白重链免疫染色检测分化肌母细胞中的肌管形成10（图1B）。肌管形成定量结果显示，GFP-CUG200中异常CUG扩增使融合指数从35.4 ± 4.1%下降至2.6 ± 1.1%，肌管面积从35.6 ± 2.2%下降至2.7 ± 0.8%（图1C）。融合指数通过肌管内（≥2个细胞核）的细胞核总数除以总细胞核数计算，肌管面积则通过肌管覆盖的图像总面积百分比进行计算。采用实时RT-PCR10分析多个肌肉分化相关基因（包括MyoD、MyoG、Mef2c和Celf1）的表达水平。与CUG5培养组相比，CUG200在分化起始阶段的增殖性肌母细胞中显著上调Celf1 mRNA的表达。与既往报道一致，Celf1的上调与强直性肌营养不良1型中的CUG扩增相关（图1D）。此外，...

在本实验方案中，我们介绍了建立强直性肌营养不良症1型成肌细胞模型的步骤，包括优化的C2C12细胞培养、基因转染/转导以及肌细胞分化。

在C2C12成肌细胞中建立强直性肌营养不良症1型模型

强直性肌营养不良1型（DM1）是一种常见的肌营养不良症。尽管已建立多种DM1动物模型，但成肌细胞模型仍存在……

这些成肌细胞培养、转染和转导操作的总体目标是建立一种用于研究强直性肌营养不良症及其他肌肉疾病的强直性肌营养不良症一型细胞模型。该方法有助于建立M1成肌细胞模型，可用于深入探究M1发病机制的详细过程。对C2C12成肌细胞进行多层次基因操作，可模拟M1中连续发生的遗传性病理事件。在转染前24小时，将7 × 10⁵个C2C12细胞接种于六孔板中，每孔接种一个样本。第二天，将两微克目标质粒DNA加入200微升室温无血清培养基中，短暂涡旋混匀。接着，向培养基中加入六微升室温转染试剂，并立即涡旋混匀30秒。然后在室温下孵育培养基30分钟。孵育的最后五分钟内，将每孔中的培养基更换为2.5毫升新鲜的无血清生长培养基，并向每孔中加入200微升转染混合物。将培养板放回细胞培养箱中继续孵育4小时。然后在显微镜下观察细胞形态和贴壁情况的变化。若观察到细胞毒性，立即将无血清培养基更换为生长培养基。转染后48小时，每隔两天在新鲜生长培养基中加入相应的筛选抗生素，持续10天。直到未转染质粒的对照孔中不含活细胞为止。为制备逆转录病毒，首先将四乘以十的六次方个嗜同种型HEK293包装细胞接种于含有细胞培养基的100毫米培养皿中。次日，将15微克目标质粒DNA溶于1毫升无血清生长培养基中，并轻轻涡旋混匀试管。接着，向培养基中加入 30 µL 室温转染试剂，并立即涡旋振荡溶液 30 秒。室温孵育 30 分钟后，将转染混合物逐滴加入嗜同种细胞中，并轻轻摇晃培养板。将培养板放回细胞培养箱中孵育 24 小时，次日更换为 10 mL 37 °C 的新鲜生长培养基。转染后48小时，用移液器将含有逆转录病毒的上清液转移至一个50毫升锥形管中，于4摄氏度过夜保存。然后沿培养板壁加入10毫升新鲜预温的培养基，将细胞放回培养箱继续培养。转染后60小时收集第二批逆转录病毒。将该病毒液与48小时收集的逆转录病毒合并。离心上清液以去除任何细胞碎片，并将逆转录病毒转移至新的50毫升离心管中。现在，用3毫升室温PBS洗涤C2C12细胞培养板的每孔，随后加入500微升0.25%胰蛋白酶EDTA，在37摄氏度孵育5分钟。当细胞脱落后，每孔加入三毫升培养基以中和反应，并吹打培养物六到八次，使细胞解离成单细胞悬液。计数后，将八乘以十的五次方个细胞加入60毫升培养皿中，并加入三毫升培养基。然后用零点五毫升逆转录病毒感染细胞，将培养皿放回培养箱中孵育48小时。两天后，每天更换含有适当筛选抗生素的新鲜生长培养基，每次加入三毫升，持续五天，直至未转导的C2C12对照组培养物中无任何活细胞残留。进行C2C12细胞慢病毒转导时，在生物安全二级柜中，用HEK293细胞培养基将4×10⁶个293T细胞接种至100毫米培养皿中。第二天，将慢病毒包装载体与八微克（8 µg）相应的慢病毒转移载体混合于一毫升（1 mL）无血清细胞培养基中。短暂涡旋混匀后，加入36微升（36 µL）预热的转染试剂。再次涡旋混匀30秒，然后在室温下孵育30分钟。孵育结束后，将转染混合物加入293T细胞中，轻轻摇动培养板，然后将细胞放回孵育箱。24小时后，用10毫升新鲜培养基替换转染混合物。48小时后，将含有慢病毒的上清液转移至50毫升锥形管中，于4摄氏度保存，并向培养板中加入10毫升新鲜的温热培养基。60 小时后，将第二批上清液与 48 小时收集的慢病毒合并，离心病毒以去除任何细胞碎片。然后，如上所述，将 0.5 毫升慢病毒加入接种于 60 毫米培养皿中、融合度为 30% 至 40% 的 C2C12 CUG200 细胞培养物中。转染后 72 小时，用新鲜培养基替换慢病毒上清液，培养基中需添加适当的筛选抗生素。每天更换含有新鲜筛选抗生素的新鲜培养基，持续五天，直至所有未转导的C2C12 CUG200对照细胞全部死亡。药物抗性筛选后，可通过荧光显微分析评估分化成肌细胞的GFP表达及肌管形成情况。本代表性实验中肌管形成的定量结果显示，异常CUG扩增及转染GFP CUG 200的细胞中，融合指数和肌管面积均显著降低。Celf1 的上调也与强直性肌营养不良一型中的 CUG 扩增相关。此外，蛋白质印迹实验 consistently 表明，CUG 扩增会抑制分化过程中 MyoD、MyoG 和 Mef2C 的表达，同时伴随 Celf1 蛋白水平的升高。提示 CUG 扩增可诱导肌管缺陷并损害成肌细胞的分化。Western blot 分析还显示，仅在逆转录病毒载体转导的培养物中存在 FLAG 标签的 Celf1，且其表达在这些培养物中上调。事实上，与对照培养物相比，Celf1 过表达细胞中的肌管形成极为罕见，提示 Celf1 的过表达严重损害了成肌细胞的分化。此外，在表达 Celf1 短发夹 RNA 的情况下，内源性 Celf1 蛋白水平以及经双抗生素筛选的慢病毒载体转导的 GFP CUG 200 细胞中的 Celf1 蛋白水平显著降低。同时，这些培养细胞中肌管形成的恢复、肌管融合指数及肌管面积均有所改善。与此同时，实时定量 RT-PCR 结果显示，在表达 Celf1 短发夹 RNA 的细胞中，MyoD、MyoG 和 Mef2C 的表达水平显著上调，支持 Celf1 沉默可挽救这些培养细胞中成肌细胞分化缺陷的可能性。进行此操作时，需注意监测C2C12细胞密度，使其保持在低于70%汇合度。细胞转染后，用无血清培养基处理细胞至少4小时，但不超过12小时，同时监测细胞的细胞毒性。通过质粒转染、逆转录病毒和慢病毒转导，我们已成功建立了一种强直性肌营养不良细胞模型，该模型将有助于此类及其他肌肉疾病的研究。

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