Name: 一种方法来提高背根神经节的对齐和髓鞘 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 学习利用静态预拉伸细胞培养系统增强背根神经节神经元的轴突对齐和髓鞘形成的方法。该技术通过与施万细胞共培养促进神经组织工程研究中的神经修复策略开发。

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作者感谢 Eric Vasco 在制备 PDMS 基底过程中的协助，感谢密歇根大学 Marina Mata 实验室的 Shiyong Wang 博士在背根神经节分离实验中的有益建议和培训，以及加州大学圣地亚哥分校的 Mark Tuszynski 博士和 W. Marie Campana 博士在施万细胞分离方案方面的宝贵建议和实验流程支持。本研究部分得到了美国国家科学基金会（CBET 0941055 和 CBET 1510895）以及美国国立卫生研究院（R21CA176854、R01GM089866 和 R01EB014986）的资助。

所有细胞分离操作程序均经密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会批准。
1. 预拉伸各向异性表面的制备&#160;
<ol>
	<li>按10:1的比例混合基础剂与固化剂，将混合物倒入组织培养皿（直径12 cm）中。整个交联混合物使用4,900 mg基础剂和490 mg固化剂。</li>
	<li>将凝胶混合物置于真空环境中20分钟，以去除气泡。</li>
	<li>将凝胶混合物放入烘箱中，在60 °C下过夜固化。</li>
	<li>PDMS膜固化后，使用等离子清洗/刻蚀系统对其进行氧气等离子体处理，处理条件为165 mTorr、O2流量65 sccm，处理时间3分钟。</li>
	<li>从培养皿中切下一矩形膜片（5 × 3.5 cm），注意识别经氧气处理的一侧，确保该侧朝上，并将其固定在拉伸框架上。将框架置于拉伸台上，通过旋转旋钮均匀拉伸，直至长轴方向达到10%的伸长率（或其他预设拉伸程度；伸长率可直接从拉伸台上读取）9。通过拧紧框架上的螺丝固定拉伸状态。</li>
	<li>将框架从拉伸台上取下。确保膜表面干燥且无灰尘，然后将硅胶腔室放置在膜上，使腔室的粘性面紧密贴附于膜表面。 
	注意：硅胶腔室可在PDMS膜上形成一个用于容纳细胞培养基的孔室。装置设计如图1所示。</li>
	<li>用紫外光照射表面10分钟进行灭菌。</li>
	<li>在等离子体处理后的6小时内，向腔室内的PDMS表面加入1 ml聚-L-赖氨酸（PLL）（0.01%磷酸盐缓冲液），并在接种背根神经节（DRG）神经元前于37 °C孵育2小时。此步骤可增强细胞贴附。</li>
</ol>
2. 背根神经节的分离
<ol>
	<li>为背根神经节（DRG）神经元准备标准培养基。</li>
	<li>分离前，对分离所需器械进行高压灭菌，并对试剂进行过滤。向6孔板的一个孔中加入5 ml分离缓冲液，并将该板置于冰上。通过将1 ml胶原酶A（500 U/ml）加入9 ml 0.05%胰蛋白酶-EDTA（1 mg/ml）中，配制10 ml消化液，使用0.22 µm滤器过滤溶液后置于冰上备用。</li>
	<li>使用10至12只5–7日龄的Sprague-Dawley大鼠进行分离。用75%异丙醇喷洒幼鼠，并通过断头法处死。</li>
	<li>从背部切开并去除覆盖脊髓的皮肤，清除脊柱周围的多余组织。在手术放大镜和手术照明灯下，用剪刀从颈部开始做第一个切口，然后沿脊柱两侧分别剪开。将脊柱从幼鼠体内分离，并去除多余的肌肉组织。随后，用剪刀沿脊柱长轴剪开，用镊子完全打开脊柱并取出脊髓。剪去移液管管尖以扩大开口，便于将含有分离缓冲液的背根神经节（DRG）转移至无菌15 ml离心管中。</li>
	<li>使用精细镊子从骨窝中取出神经节，从两侧共收集约10–16个背根神经节（DRG）。修剪神经根后，将神经节转移至预冷的分离缓冲液中。</li>
	<li>剪去移液管管尖以扩大开口，便于将含有分离缓冲液的背根神经节（DRG）转移至无菌15 ml离心管中。化学消化后，在4 °C条件下以900 × g离心5分钟。</li>
	<li>让组织自然沉降至管底，小心吸除上层分离缓冲液，并向管中加入10 ml消化液。</li>
	<li>将解剖后的组织置于37 °C水浴中，在消化液中孵育1小时，期间每5–10分钟轻轻振荡一次试管。</li>
	<li>化学消化完成后，在4 °C条件下以900 × g离心5分钟。</li>
	<li>吸除上清液，将沉淀物重悬于10 ml标准培养基中，并涡旋混匀。</li>
	<li>按照第2.9节所述条件，再次离心已消化的细胞。</li>
	<li>吸除上清液，将沉淀物重悬于12 ml标准培养基中，并涡旋混匀。</li>
</ol>
3. 在预拉伸表面上培养背根神经节
<ol>
	<li>在接种细胞之前，移除腔室中的PLL溶液，用无菌水冲洗PDMS表面，然后风干。</li>
	<li>重悬细胞后，静置1-2分钟，使碎片沉降至管底。取1.5 ml细胞悬液加入每个拉伸室中，于37 °C、5% CO₂条件下孵育。2.</li>
	<li>为了消除胶质细胞，在第1天 体外 （体外培养天数），加入10 µl（或15 µl）荧光素-2-脱氧尿苷和尿苷（FDU-U）储备液混合物（参见 材料清单) 加入每个孔中。7 小时后，弃去该培养基，更换为新鲜的标准生长培养基，并将预拉伸的培养装置置于含 5% CO₂ 的 37 °C 培养箱中2.</li>
	<li>在细胞培养期间（2–3 周），每两天更换一次培养基，替换为一半新鲜培养基。注意：在拉伸和未拉伸表面培养 2 周后，将纯化的施万细胞（SCs）加入培养腔室，并继续培养 1 周（步骤 4.7）。</li>
</ol>
4. 在预拉伸表面上进行施万细胞（SCs）与背根神经节神经元的共培养
<ol>
	<li>按照 Dr. Campana 团队先前所述的方法分离施万细胞（SCs）15。
	<ol>
		<li>简言之，从出生1天的幼鼠中分离施万细胞。通过化学方法（胰蛋白酶-EDTA 和胶原酶 A）和机械方法（18 号针头/10 ml 注射器）收集并解离坐骨神经 15。</li>
		<li>将解离后的细胞接种至多聚-D-赖氨酸（PDL）包被的 T25 培养瓶中，在 37 °C、5% CO2 条件下培养。第 5 天使用抗 Thy 1.1 抗体和兔补体进行抗体筛选纯化细胞，并将纯化后的细胞传代至第 2–4 代。培养基配方为：Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）、10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素/链霉素（Pen/Strep）、21 µg/ml 牛垂体提取物（BPE）和 4 µM 福斯科林（Forskolin）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移除施万细胞的培养基，向培养瓶中加入 5 ml 0.05% 胰蛋白酶-EDTA。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 2–3 分钟。</li>
	<li>在光学显微镜下使用 10X 物镜观察细胞，确认细胞是否从培养瓶壁脱落，随后加入 5 ml 培养基并与瓶内细胞混匀。</li>
	<li>将细胞悬液转移至 15 ml 离心管中，在 200 × g、20 °C 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用 7 ml 标准背根神经节（DRG）生长培养基重悬细胞沉淀。</li>
	<li>取 10 µl 细胞悬液加入 0.5 ml 微量离心管中，与 10 µl 台盼蓝混合，然后在光学显微镜下使用 10X 物镜通过血细胞计数板计数细胞数量。用 DRG 生长培养基将细胞悬液稀释至每毫升含 5,000 个细胞。</li>
	<li>从拉伸培养室中的 DRG 培养体系中移除 0.5 ml 培养基，并加入 0.5 ml 施万细胞悬液至 DRG 培养体系中。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO2 条件下继续培养 1 周。每两天更换一次培养基，每次更换一半的旧培养基，补充新鲜的标准 DRG 生长培养基。共培养 1 周后，进行免疫组织化学处理 10。</li>
</ol>

<ol><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiu%2C+C+%22Layer-by-Layer+Films+for+Biomedical+Applications%22">Layer-by-Layer Films for Biomedical Applications</a>. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. 525-546 (2015).</li>
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<li>Kim, B., ET, K. P., Papautsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+stability+of+plasma+oxidized+PDMS+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Conf+Proc+IEEE+Eng+Med+Biol+Soc%22%5BJournal%5D)">Long-term stability of plasma oxidized PDMS surfaces.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 7, 5013-5016 (2004).</li>
<li>Lopera, S., Mansano, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-Based+Surface+Modification+of+Polydimethylsiloxane+for+PDMS-PDMS+Molding%5BTitle%5D)+AND+%22ISRN+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Plasma-Based Surface Modification of Polydimethylsiloxane for PDMS-PDMS Molding.</a> ISRN Polymer Science. 2012, (2012).</li>
<li>Chandra, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChandra%2C+G+%22Organosilicon+Materials%22">Organosilicon Materials</a>. , Springer. Berlin Heidelberg. (2013).</li>
<li>Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+poly%28dimethylsiloxane%29+surface+modification+to+control+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Surf+Interface+Anal%22%5BJournal%5D)">Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion.</a> Surf Interface Anal. 41, 11-16 (2009).</li>
<li>Moore, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-channel+scaffolds+to+promote+spinal+cord+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration.</a> Biomaterials. 27, 419-429 (2006).</li>
<li>Clarke, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropatterned+methacrylate+polymers+direct+spiral+ganglion+neurite+and+Schwann+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Res%22%5BJournal%5D)">Micropatterned methacrylate polymers direct spiral ganglion neurite and Schwann cell growth.</a> Hearing Res. 278, 96-105 (2011).</li>
<li>Pfister, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+transplantable+nervous+tissue+constructs+comprised+of+stretch-grown+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of transplantable nervous tissue constructs comprised of stretch-grown axons.</a> J Neurosci Methods. 153, 95-103 (2006).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

为了在预拉伸表面上诱导轴突定向排列，有两个关键步骤：1）PDMS膜必须平整且厚度均匀；2）必须从背根神经节（DRG）中去除胶质细胞。在混合PDMS及其交联剂并经烘箱固化后，交联的PDMS凝胶应放置于平坦的台面上，并小心操作以避免任何倾斜。PDMS膜经氧等离子体处理后，须在6小时内完成聚赖氨酸（PLL）包被，因为等离子体处理后表面的亲水性（细胞贴附所必需）会随时间逐渐减弱。由于等离子体处理仅作用于膜的一侧，在将PDMS从培养皿上剥离后，必须注意确保正确的一侧被安装到拉伸框架上，即经等离子体处理的表面应朝上，以便细胞贴附。
背根神经节位于沿脊柱排列的骨性凹陷内。由于幼年幼崽的椎骨呈白色，因此很难将背根神经节与椎骨区分开来。此时，应将脊柱置于靠近光源的位置。在光照下，背根神经节会变得透明，而骨组织仍保持白色且不透明。分离用缓冲液必须保持在冰上并维持生理pH值，因为pH值会影响神经细胞的存活能力。分离得到的组织黏性较高，在转移至离心管时容易黏附在移液枪头尖端。因此，剪去移液枪头的最末端以形成较大的开口，有助于组织的转移。
在某些实验方...

在神经损伤中，由于损伤部位的存在，近端和远端神经残端通常难以实现神经束的直接准确对合1-2。正常情况下，轴突通路由高度有序且排列整齐的轴突束组成，形成复杂的连接网络。然而，由于轴突排列紊乱，神经再生过程往往具有无序性3-4。因此，为了产生足够数量并能跨越损伤部位的再生轴突，必须诱导轴突形成良好有序的排列。此外，由于损伤部位髓鞘形成细胞的死亡，神经损伤常伴随脱髓鞘现象。由于脱髓鞘会显著损害存活轴突的传导能力，针对脱髓鞘的治疗或促进再髓鞘化的策略对于神经损伤后的功能恢复具有重要意义5。因此，本实验方案的目标是阐述一种可解决神经再生中上述两个关键问题的工程学方法。
表面各向异性，即材料在不同轴向上测得的物理或力学性质存在差异，已被用于调控细胞的排列、生长和迁移。 6-7除了形貌学方法外，还有其他诱导各向异性的方法。此前，我们研究了通过机械静态预拉伸聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜所诱导的表面各向异性。该理论的 &#34;大变形上的小变形&#34; 预测细胞在拉伸方向上感知的有效刚度与垂直方向上的有效刚度存在差异，这种有效刚度的差异源于表面各向异性 8在预拉伸的PDMS膜上培养的间充质干细胞（MSCs）能够通过主动牵拉表面感知各向异性，并因此沿预拉伸方向排列。 9类似地，由机械预拉伸表面产生的各向异性表面会影响背根神经节（DRG）轴突的排列、生长及髓鞘化。 10在此，我们提供一种在静态预拉伸的PDMS基底上诱导表面各向异性的方案，以促进轴突再生 10.
为了诱导轴突定向排列，需采用具有特定图案的拓扑结构，这些结构可通过排列整齐的纤维和通道提供接触引导作用 6,11-12，被证明可促进轴突排列 11,13然而，已有报道的通过拓扑结构特征（如纤维、通道和图案化）诱导轴突定向排列的技术，无法实现轴突的延长和增粗。相比之下，渐进式机械拉伸可促使轴突沿拉伸方向定向排列，并使轴突长度和直径随拉伸幅度的增加而增大 14然而，结合使用电动马达装置 体内 不可行。相比之下，静态预拉伸诱导的各向异性更为简单，可更便捷地整合到未来支架设计中 在体内 应用。
在本实验方案中，采用静态预拉伸细胞培养系统，在无拓扑结构特征的情况下诱导表面各向异性。该预拉伸培养系统由聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜、可拉伸框架和拉伸装置组成，其中膜被固定在框架上，并在拉伸装置上施加预设的拉伸幅度。将新分离的背根神经节（DRG）神经元在预拉伸表面上培养长达21天，监测其轴突的排列方向与直径。随后，将施万细胞（SCs）与已排列的轴突进行共培养，观察其髓鞘形成情况。通过引入由预拉伸诱导的表面各向异性，我们分别增强了间充质干细胞（MSCs）的细胞排列-分化以及DRG神经元的轴突排列-生长能力9-10。

<table><tbody><tr><td>Neurobasal 培养基 1x</td><td>GibcoBRL</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27 添加剂 50x</td><td>GibcoBRL</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax-I 100x</td><td>GibcoBRL</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Albumax-I</td><td>GibcoBRL</td><td>11020-021</td><td></td></tr><tr><td>神经生长因子-7S</td><td>Invitrogen</td><td>13290-010</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>GibcoBRL</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA/1 mM EDTA</td><td>GibcoBRL</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Trevigen</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.trevigen.com/item/2/7/64/220/Cultrex_PolyLLysine/">3438-100-01&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine</td><td>Sigma</td><td>p-6407</td><td></td></tr><tr><td>氟代-2-脱氧尿苷</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>尿苷</td><td>Sigma</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液 (HBSS)</td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td>分离缓冲液</td></tr><tr><td>I 型胶原酶</td><td>Worthington</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11885</td><td></td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td>SH30080.03</td><td></td></tr><tr><td>BPE</td><td>Clonetics</td><td>CC-4009</td><td></td></tr><tr><td>佛司可林</td><td>Calbiochem</td><td>344270</td><td></td></tr><tr><td>硅胶腔室</td><td>Greiner bio-one</td><td>FlexiPERM ConA</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗/刻蚀系统</td><td>March Instruments</td><td>PX-250</td><td></td></tr><tr><td>抗 Thy 1.1 抗体</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>M7898</td><td></td></tr><tr><td>兔补体</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S-7764</td><td></td></tr><tr><td>标准生长培养基</td><td></td><td></td><td>取 500 ml Neurobasal 培养基 1x，加入 10 ml B-27 50x、5 ml Glutamax-I 100x、2.5 ml 青霉素/链霉素 (Penn/Strep)、1 ml Albumax-I 和 1 &amp;mu;l NGF-7S（50 &amp;mu;g/ml）。</td></tr><tr><td>FDU 尿苷储备液</td><td></td><td></td><td>将 100 mg FDU 溶于 10 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 中（终浓度 10 mg/ml），在超净台中过滤，分装为每份 500 &amp;mu;l，于 -20 &amp;ordm;C 保存。将 5 g 尿苷溶于 166.7 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 中（终浓度 33 mg/ml），在超净台中过滤，分装为每份 200 &amp;mu;l，于 -20 &amp;ordm;C 保存。取 61.5 &amp;mu;l FDU（10 mg/ml）和 20.5 &amp;mu;l 尿苷（33 mg/ml），加入 4,918 &amp;mu;l ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，配制成终末储备浓度，分装为每份 1 ml，于 -20 &amp;ordm;C 保存。</td></tr></tbody></table>

一种增强背根神经节神经元轴突排列与髓鞘形成的方法

An Approach to Enhance Alignment and Myelination of Dorsal Root Ganglion Neurons

轴突再生是一个混乱的过程，主要由于轴突排列无序所致。因此，为了使足够数量的再生轴突能够跨越损伤部位，必须实现轴突的有序排列。由于神经损伤后的脱髓鞘会严重损害存活轴突的传导能力，因此髓鞘再生对于再生神经的功能恢复至关重要。此前，我们已证明间充质干细胞（MSCs）在预拉伸诱导的各向异性表面上会沿特定方向排列，因为细胞在拉伸方向上感知到的有效刚度大于垂直方向。我们还发现，由机械预拉伸表面形成的各向异性结构同样会影响轴突的排列、生长以及髓鞘形成。本文中，我们提供了一套详细的实验方案，用于制备预拉伸各向异性表面，分离并培养背根神经节（DRG）神经元于该预拉伸表面上，并展示DRG神经元与施万细胞（SCs）在预拉伸表面上共培养时的髓鞘形成行为。

预拉伸细胞培养系统促进了背根神经节（DRG）轴突的定向排列10。将DRG神经元分别接种于预拉伸和未拉伸的表面，培养12天。通过β-III微管蛋白染色以显示轴突的排列情况。图2比较了培养12天后，DRG轴突在预拉伸与未拉伸PDMS基底上的取向。在预拉伸基底上，DRG轴突沿拉伸方向平行排列；而在未拉伸的PDMS基底上，轴突呈随机排列，并形成相互连接的网络结构。
除了诱导轴突定向排列外，预拉伸诱导的各向异性还增强了轴突的束化。在拉伸表面上，排列整齐的轴突形成了轴突束，这与在未拉伸表面上观察到的相互连接的轴突网络不同。预拉伸表面上的这些束状结构类似于神经组织中的神经束 体内. 图3 显示培养21天后在预拉伸和未拉伸表面上的DRG神经元轴突。 图3 如图所示，预拉伸基底上的轴突聚集形成束状结构，类似于神经束样结构。这表明预...

本方案描述了从大鼠分离背根神经节（DRG）神经元，并在静态预拉伸细胞培养系统上培养DRG神经元以增强轴突排列，随后与施万细胞（SCs）共培养以促进髓鞘形成的实验方法。

轴突再生是一个混乱的过程，主要由于轴突排列缺乏有序性。因此，为了使足够数量的再生轴突能够……

本实验方案的总体目标是利用静态预拉伸细胞培养系统，增强背根神经节神经元的轴突排列和髓鞘化。该方法有助于解答神经组织工程领域中的关键问题，例如轴突排列和轴突增厚生长。该技术的主要优势在于，这种预拉伸方法不仅能增强轴突排列，还能促进髓鞘形成。开始此操作时，将基础剂与固化剂的混合物倒入组织培养皿中。将凝胶混合物置于真空环境中20分钟，以去除气泡。然后将凝胶混合物放入60摄氏度的烘箱中过夜固化。PDMS 膜固化后，在等离子清洗和刻蚀系统中用氧气等离子体处理其表面 3 分钟。随后，从培养皿中切下一小块矩形膜，将其固定在拉伸支架上，使经氧气处理的一面朝上。然后将框架置于拉伸台上，通过旋转台上的旋钮均匀拉伸，直至长轴方向达到10%的伸长率。接着，拧紧框架上的螺丝以固定拉伸状态。之后，将框架从拉伸台上取下。在将硅胶腔室放置到膜上之前，确保膜表面干燥且无灰尘。让腔室的粘性面紧密贴附在膜上。然后用紫外光对表面灭菌10分钟。随后，在等离子处理后的6小时内，向培养腔室中的PDMS表面加入1毫升PLL。接下来，在接种背根神经节（DRG）神经元之前，于37摄氏度孵育2小时，以增强细胞贴附。在此步骤中，为DRG神经元配制标准培养基。分离前，对分离设备和滤过试剂进行高压灭菌。向六孔板的一个孔中加入5毫升分离缓冲液，并将该板置于冰上。然后通过将1毫升胶原酶A加入9毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA中，制备10毫升消化液。用0.22微米滤器过滤溶液，并将其置于冰上。随后，处死10至12只5至7日龄的SD大鼠，从每只大鼠背部切除外覆于脊髓的皮肤，并清除脊柱周围的多余组织。在手术放大镜下，从颈部开始做第一个切口，然后用剪刀沿脊柱两侧各做一次切口。将脊柱从幼鼠体内分离，并去除多余的肌肉组织。接着沿脊柱长轴进行切割，用镊子将脊柱完全打开，以取出脊髓。接下来，将神经节从骨窝中取出。修剪神经根，并将神经节转移至冰冻的分离缓冲液中。从两侧共收集约10至16个背根神经节（DRGs）。对剩余的幼鼠重复解剖步骤。随后，将带有分离缓冲液的背根神经节转移至无菌的15毫升离心管中。静置使组织沉降至管底，然后小心移除上层的分离缓冲液。然后向试管中加入10毫升解离液。将解剖后的组织置于解离液中，在37°C水浴中孵育1小时，每5至10分钟摇动一次试管。化学解离后，在4°C条件下离心神经节5分钟。五分钟后，弃去上清液，将沉淀物重悬于10毫升标准培养基中并涡旋混匀。随后，再次离心分离消化后的细胞。然后弃去上清液，将沉淀物重悬于12毫升标准培养基中并涡旋混匀。接种细胞前，从培养腔中移除PLL溶液，用无菌水冲洗PDMS表面，并使其自然风干。重悬细胞后，将细胞悬液静置1至2分钟，使碎片沉淀至离心管底部。接下来，将1.5毫升细胞悬液加入每个拉伸后的培养腔中，并在37摄氏度、5%CO2条件下孵育。为了在体外培养第一天清除胶质细胞，向每孔中加

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

一种方法来提高背根神经节的对齐和髓鞘

本文介绍了制备和维护隔室化培养室以培养背根神经节感觉神经元的技术。...

背根神经节神经元在隔室化培养中的制备与维持

本文描述了一种利用培养的成年小鼠背根神经节神经元进行轴突再生遗传学研究的体外模型。该方法包括重新悬浮和再接种步骤，以允许经历遗传操作的神经元重新生长轴突。该策略对于利用基于RNA干扰的蛋白敲低技术进行轴突再生的缺失功能研究尤为有用。...

成年背根神经节神经元培养体系中的轴突再生遗传学研究

该视频展示了背根神经节（DRG）神经元与施万细胞的共培养过程。首先将DRG神经元培养在预先拉伸的膜上，以促进轴突的定向生长。随后引入施万细胞，这些细胞会附着在轴突上，起到绝缘作用，并促进神经细胞的存活与功能维持。...

在预拉伸膜上进行施万细胞与背根神经节神经元的共培养

本视频演示了一种通过免疫平皿法富集背根神经节神经元培养物的实验方案，从而提高其纯度及在神经科学研究中的应用价值。...

通过免疫贴壁法实现背根神经节的神经元富集

本视频展示了背根神经节外植体与施万细胞的共培养模型。在共培养条件下，抗坏血酸可促进施万细胞向髓鞘形成细胞分化。髓鞘形成施万细胞会多次包裹轴突，形成髓鞘，这对神经功能至关重要。...

背根神经节外植体与施万细胞共培养以实现神经元髓鞘化

来源：Li, Q. et al. 研究哺乳动物轴突再生：成年小鼠背根神经节的体内电穿孔。 J. Vis. Exp.

电穿孔介导的小鼠背根神经节转染以促进感觉轴突再生

背根神经节（DRG）是包含周围神经系统感觉神经元的结构。经分离后，可与类似施万细胞的脂肪源性干细胞（ASC）进行共培养，从而为研究提供有价值的模型 体外 神经再生与髓鞘化，模拟 体内...

背根神经节神经元与分化后的脂肪源性干细胞：一种 体外 共培养模型用于研究周围神经再生

本方案介绍了一种在成年大鼠中通过背根神经节（DRG）注射病毒载体并同时造成背根 crush...

背根神经节注射与背根挤压损伤作为感觉轴突再生的研究模型

单纤维记录是一种适用于中枢和周围神经系统的有效电生理技术。结合带有附着坐骨神经的完整背根神经节制备，可检测传导阻滞的机制。这两种方案均有助于加深对周围神经系统与疼痛关系的理解。...

利用体内单纤维记录法及附着坐骨神经的完整背根神经节研究传导阻滞的机制

在背根神经节与施万细胞的共培养体系中，可以研究周围神经系统的髓鞘形成。该模型为观察和量化周围髓鞘化过程，以及研究感兴趣化合物对髓鞘影响提供了实验机会。...

大鼠背根神经节外植体与施万细胞共培养体系中周围神经轴突的体外髓鞘化

本方案描述了建立小鼠背根神经节（DRG）全组织培养和分散培养的方法，以及利用这些培养系统评估肿瘤-神经相互作用的应用。...

建立 体外 背根神经节培养模型：探究癌症-神经相互作用的互补方法

学习利用静态预拉伸细胞培养系统增强背根神经节神经元的轴突对齐和髓鞘形成的方法。该技术通过与施万细胞共培养促进神经组织工程研究中的神经修复策略开发。

一种增强背根神经节神经元轴突排列与髓鞘形成的方法

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