一种方法来提高背根神经节的对齐和髓鞘

该方案的总体目标是使用静态的、预拉伸的细胞培养系统增强背根神经节神经元的轴突对齐和髓鞘形成。这种方法可以帮助回答神经组织工程领域的关键问题，例如轴突排列和厚度增长。这种技术的主要优点是这种预拉伸方法不仅可以增强轴突对齐，还可以促进髓鞘形成。

要开始此过程，请将基础和固化剂的混合物倒入组织培养皿中。将凝胶混合物在真空下放置 20 分钟以去除气泡。然后将凝胶混合物放入 60 摄氏度的烤箱中过夜固化。

PDMS 膜固化后，在等离子清洗和蚀刻系统中用氧气等离子体处理表面 3 分钟。随后，从培养皿中切下一块矩形膜。将其固定在拉伸架上，氧气处理面朝上。

然后将框架放在拉伸舞台上，通过转动舞台上的旋钮均匀拉伸它，直到它在较长的轴上达到 10% 的伸长率。接下来，通过拧紧框架上的螺钉来修复拉伸。之后，从舞台中删除该帧。

在将硅胶室放在膜上之前，请确保膜表面干燥且无灰尘。让腔室的粘性侧紧紧地附着在膜上。然后用紫外线对表面消毒 10 分钟。

之后，在等离子体处理后 6 小时内向腔室中的 PDMS 表面添加 1 毫升 PLL。接下来，在 37 摄氏度下孵育 2 小时，然后接种 DRG 神经元以增强细胞附着。在此步骤中，为 DRG 神经元准备标准生长培养基。

在分离之前，对分离设备和过滤试剂进行高压灭菌。将 5 mL 分离缓冲液加入 6 孔板的一个孔中，并将板置于冰上。然后通过将 1 毫升胶原酶 A 添加到 9 毫升 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 中来制备 10 毫升解离培养基。

用 0.22 微米过滤器过滤溶液并将其置于冰上。之后，处死 10 到 12 只 5 到 7 天大的 SD 大鼠，并从每只大鼠的背部切掉覆盖在脊髓上的皮肤。去除脊柱周围多余的组织。

在手术放大镜下，从颈部切开第一个切口，然后用剪刀沿着脊柱两侧切开一个。将脊柱从幼犬的身体上分离出来，去除多余的肌肉。然后沿脊柱的长轴切割，用镊子将脊柱完全打开，以提取脊髓。

接下来，从骨袋中取出神经节。修剪神经根并将神经节转移到冰冷的隔离缓冲液中。从两侧收集大约 10 到 16 个 DRG。

对其余幼崽重复解剖程序。现在，将带有分离缓冲液的 DRG 转移到无菌的 15 毫升试管中。让组织沉降到试管底部，然后轻轻去除顶部的分离缓冲液。

然后将 10 毫升解离培养基加入试管中。将解剖的组织在 37 摄氏度水浴中的解离培养基中孵育 1 小时，同时每 5 到 10 分钟摇动一次试管。化学解离后，将神经节在 4 摄氏度下离心 5 分钟。

5 分钟后，去除上清液，将沉淀重悬于 10 mL 标准生长培养基中，然后涡旋。随后，再次离心解离的细胞。然后去除上清液，将沉淀重悬于 12 mL 标准生长培养基中并涡旋。

在接种细胞之前，从腔室中取出 PLL 溶液。用无菌水冲洗 PDMS 表面并风干。重悬细胞后，让悬浮液静置 1 到 2 分钟，让碎片沉淀到试管底部。

接下来，将 1.5 毫升细胞悬液添加到每个拉伸的腔室中，并在 37 摄氏度下与 5% CO2 一起孵育。要在体外一天消除神经胶质细胞，向每个孔中加入 10 微升或 15 微升 FDU-U 混合物储备液。7 小时后，用新鲜的标准生长培养基替换该培养基，并将预拉伸的培养装置放入 37 摄氏度的 5% CO2 培养箱中。

在细胞培养期间，每两天更换一次培养基，用新鲜培养基替换一半的用过的培养基。在此过程中，从雪旺细胞中取出培养基，并在培养瓶中加入 5 毫升 0.05% 胰蛋白酶-EDTA。将细胞在 37 摄氏度的 5% CO2 中孵育 2 到 3 分钟。

使用 10 倍物镜在光学显微镜下检查细胞，看看它们是否从培养瓶中升起。然后向培养瓶中的细胞中加入 5 mL 培养基并混合。随后，将细胞悬液添加到 15 mL 离心管中，并在 20 摄氏度下离心 5 分钟。

然后去除上清液，将沉淀重悬于 7 毫升标准 DRG 生长培养基中。然后，将 10 μL 细胞悬液转移到 0.5 mL 微量离心管中。将其与 10 μL 台盼蓝混合，然后用血细胞计数器使用 10X 物镜计数细胞数。

添加 DRG 生长培养基，将细胞悬液稀释至每毫升 5， 000 个细胞。接下来，从拉伸室中的 DRG 培养物中去除 0.5 毫升培养基，并向 DRG 培养物中加入 0.5 毫升雪旺细胞悬液。将细胞在 37 摄氏度、5% CO 2 中培养一周。

每两天更换一次培养基，用新鲜的标准生长培养基替换一半的用过的培养基。在拉伸和未拉伸的表面上培养两周后，将纯化的雪旺细胞加入腔室中并再培养一周。这里显示的是拉伸表面上轴突的 beta-III 微管蛋白染色。

这是 β-III 微管蛋白和 P0 染色在拉伸表面上的叠加，表明雪旺细胞附着在轴突上并可能使轴突髓鞘化。该图显示了未拉伸表面上轴突的 β-III 微管蛋白染色。β-III 微管蛋白和 P0 染色覆盖在未拉伸的表面上表明雪旺细胞没有附着在轴突上。

一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在三到四个小时内完成。在尝试此过程时，请务必记住保持 PDMS 膜平坦且厚度均匀。按照此程序，可以执行预拉伸微通道等雾化器，以回答轴突晶状体和雪旺细胞迁移等其他问题。

该技术开发后，将为组织工程领域的研究人员探索表面各向异性对脊髓和坐骨神经神经再生的作用铺平道路。看完这个视频后，您应该对如何使用预拉伸装置诱导轴突对齐和髓鞘形成有一个很好的了解。