Name: 有针对性的RNA测序分析表征基因表达和基因组改变 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: 学习靶向RNA测序技术，通过杂交捕获和多重测序分析基因表达、突变及基因融合。该方法可定制目标基因，为分子生物学研究提供高性价比的转录组分析方案。

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我们特别感谢 Ezra Lyon、Eliot Zhu、Michele Wing、Esko Kautto 和 Eric Samorodnitsky 提供的技术支持。同时感谢 Jenny Badillo 为我们团队提供的行政支持。我们感谢俄亥俄超级计算中心（OSC）为我们分析工作提供的磁盘空间、计算资源及技术支持。我们感谢俄亥俄州立大学韦克斯纳医学中心综合癌症中心（CCC）对本研究工作的行政支持。S.R. 及其团队的研究得到了美国癌症协会（MRSG-12-194-01-TBG）、前列腺癌基金会青年研究者奖、美国国立人类基因组研究所（NHGRI，项目编号：UM1HG006508-01A1）、Fore 癌症研究基金会、美国肺脏协会以及 Pelotonia 的资助。

<ol><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat Rev Genet. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Mercer, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+sequencing+for+gene+discovery+and+quantification+using+RNA+CaptureSeq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq.</a> Nat Protoc. 9, 989-1009 (2014).</li>
<li>Maher, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+transcript+discovery+by+paired-end+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Chimeric transcript discovery by paired-end transcriptome sequencing.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12353-12358 (2009).</li>
<li>Piskol, R., Ramaswami, G., Li, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+identification+of+genomic+variants+from+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Reliable identification of genomic variants from RNA-seq data.</a> Am J Hum Genet. 93, 641-651 (2013).</li>
<li>Quinn, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+strategies+for+SNP+detection+in+RNA-seq+data%3A+application+to+lymphoblastoid+cell+lines+and+evaluation+using+1000+Genomes+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of strategies for SNP detection in RNA-seq data: application to lymphoblastoid cell lines and evaluation using 1000 Genomes data.</a> PLoS One. 8, e58815(2013).</li>
<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eSNV-detect%3A+a+computational+system+to+identify+expressed+single+nucleotide+variants+from+transcriptome+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The eSNV-detect: a computational system to identify expressed single nucleotide variants from transcriptome sequencing data.</a> Nucleic Acids Res. 42, e172(2014).</li>
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<li>Andrews, S. FastQC. , Available from:
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<li>Broad Institute. Picard. , Available from:
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<li>DeLuca, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-SeQC%3A+RNA-seq+metrics+for+quality+control+and+process+optimization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RNA-SeQC: RNA-seq metrics for quality control and process optimization.</a> Bioinformatics. 28, 1530-1532 (2012).</li>
<li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29, 15-21 (2013).</li>
<li>Van der Auwera, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+FastQ+data+to+high+confidence+variant+calls%3A+the+Genome+Analysis+Toolkit+best+practices+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">From FastQ data to high confidence variant calls: the Genome Analysis Toolkit best practices pipeline.</a> Curr Protoc Bioinformatics. 11, 11.10.1-11.10.33 (2013).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat Biotechnol. 28, 511-515 (2010).</li>
<li>Iyer, M. K., Chinnaiyan, A. M., Maher, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChimeraScan%3A+a+tool+for+identifying+chimeric+transcription+in+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ChimeraScan: a tool for identifying chimeric transcription in sequencing data.</a> Bioinformatics. 27, 2903-2904 (2011).</li>
<li>Kim, D., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat-Fusion%3A+an+algorithm+for+discovery+of+novel+fusion+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">TopHat-Fusion: an algorithm for discovery of novel fusion transcripts.</a> Genome Biol. 12, R72(2011).</li>
<li>Fernandez-Cuesta, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+fusion+genes+in+lung+cancer+using+breakpoint+assembly+of+transcriptome+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of novel fusion genes in lung cancer using breakpoint assembly of transcriptome sequencing data.</a> Genome Biol. 16, 7(2015).</li>
<li>Shugay, M., Ortiz de Mendibil,, Vizmanos, I., L, J., Novo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncofuse%3A+a+computational+framework+for+the+prediction+of+the+oncogenic+potential+of+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Oncofuse: a computational framework for the prediction of the oncogenic potential of gene fusions.</a> Bioinformatics. 29, 2539-2546 (2013).</li>
<li>Clark, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+gene+profiling+of+long+noncoding+RNAs+with+targeted+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative gene profiling of long noncoding RNAs with targeted RNA sequencing.</a> Nat Methods. 12, 339-342 (2015).</li>
<li>Cieslik, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+exome+capture+RNA-seq+for+highly+degraded+RNA+with+application+to+clinical+cancer+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The use of exome capture RNA-seq for highly degraded RNA with application to clinical cancer sequencing.</a> Genome Res. , (2015).</li>
<li>Cabanski, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cDNA+hybrid+capture+improves+transcriptome+analysis+on+low-input+and+archived+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">cDNA hybrid capture improves transcriptome analysis on low-input and archived samples.</a> J Mol Diagn. 16, 440-451 (2014).</li>
<li>Costa, C., Gimenez-Capitan, A., Karachaliou, N., Rosell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+screening%3A+from+the+RT-PCR+to+the+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Lung+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular screening: from the RT-PCR to the RNA-seq.</a> Transl Lung Cancer Res. 2, 87-91 (2013).</li>
<li>Zhao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+RNA-Seq+by+poly+%28A%29+capture%2C+ribosomal+RNA+depletion%2C+and+DNA+microarray+for+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Comparison of RNA-Seq by poly (A) capture, ribosomal RNA depletion, and DNA microarray for expression profiling.</a> BMC Genomics. 15, 419(2014).</li>
</ol>

S.R. 获得诺华（Novartis）和Ariad Pharmaceuticals公司资助，用于开展临床试验。S.R. 的直系亲属持有强生公司（Johnson and Johnson）的股票。

RNAseq 捕获是一种介于 RNAseq 与微阵列技术之间的中间策略，用于评估转录组中特定的部分。捕获技术的优势包括成本降低、在台式测序仪上快速完成检测、高通量以及能够检测基因组变异。该方法可被调整用于表征非编码 RNA23、检测单核苷酸变异4-6、分析 RNA 剪接，并识别基因融合或结构重排24。此外，该方法还可应用于经过福尔马林固定并包埋在石蜡块中的临床样本或处理过的样本24,25。
与微阵列、实时定量PCR、Sanger测序和DNA测序相比，RNA测序捕获具有多项显著优势。微阵列技术受限于探针的交叉杂交和非特异性结合所导致的高背景信号。由于背景噪声的存在，低表达基因的定量受到限制，而高表达基因的检测则易受信号饱和的影响1。与RNA测序捕获相比，实时定量PCR难以实现重复性。此外，RNA测序能够检测新转录本，所需起始样本量更少，并可检测可变剪接事件26。与Sanger测序相比，RNA测序具有更高的通量，且可用于分析低表达的miRNA。尽管Sang...

全转录组或RNA测序（RNAseq）是一种无偏倚的测序方法，用于检测所有RNA产物。靶向RNA测序（捕获法）的目标是对选定的转录本进行更集中、更敏感的评估，相较于标准RNA测序，其具有更宽的动态范围、更低的成本或更小的规模以及更高的通量。与标准RNA测序类似，靶向富集方法可用于评估基因表达、多种RNA种类（如mRNA、微小RNA（miRNA）、长链非编码RNA1、其他非编码RNA2）、基因融合3以及突变4-6。
捕获过程涉及互补寡核苷酸的杂交，以富集用于测序的cDNA文库。RNA测序捕获（RNAseq Capture）的原理类似于微阵列技术，即通过将互补的寡核苷酸或探针与样本杂交，进而检测其相对丰度。在微阵列技术中，基因表达水平基于转录本与这些探针结合后所测得的相对信号强度来确定。因此，微阵列技术受限于检测范围、非特异性结合带来的背景噪声以及探针间的交叉杂交问题。此外，与RNA测序相比，微阵列对低表达和高表达转录本的动态检测范围有限1。然而，由于成本较低且通量较高，微阵列技术仍被广泛应用。
本文展示了一种RNAseq捕获方法，该方法在评估转录组时介于RNA测序与微阵列技术之间。RNAseq捕获具有中等通量、更宽的动态范围和更高的灵敏度，并且适用于台式测序仪实现快速周转。此外，RNAseq捕获在存储空间和数据处理方面所需的计算资源更少。

<table><tbody><tr><td>Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学级乙醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>24 x 1.5 ml 热块</td><td>Eppendorf</td><td>21516-166</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 试剂盒 v2（300 个循环）</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq 桌面测序仪</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PhiX Control v3</td><td>Illumina</td><td>FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Stranded Total RNA Kit 配套 RiboZero Gold SetA</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2301</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&amp;reg; 通用阻断寡核苷酸 - TS-p5</td><td>IDT</td><td>127040822</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&amp;reg; 通用阻断寡核苷酸 - TS-p7(6nt)</td><td>IDT</td><td>127040823</td><td></td></tr><tr><td>25 rxn xGen&amp;reg; 通用阻断寡核苷酸 - TS-p7(8nt)</td><td>IDT</td><td>127040824</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt&amp;reg; AMPure&amp;reg; XP - PCR 纯化磁珠&amp;nbsp;</td><td>Beckman-Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads&amp;reg; M-270 链霉亲和素磁珠</td><td>Life Technologies</td><td>65305</td><td></td></tr><tr><td>COT 人源 DNA，荧光级，1 mg</td><td>Roche Applied Science</td><td>05480647001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&amp;reg; 检测管&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&amp;reg; dsDNA HS 检测试剂盒</td><td>Life Technologies</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>SeqCap&amp;reg; EZ 杂交与洗涤试剂盒&amp;nbsp;（24 或 96 次反应）</td><td>Roche NimbleGen&amp;nbsp;</td><td>05634261001 或 05634253001&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Qubit&amp;reg; 2.0 荧光计&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>10 x 2 ml IDTE pH 8.0（1x TE 溶液）</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween20 BioXtra</td><td>Sigma</td><td>P7949-500ML</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Life Technologies</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch&amp;trade; 梯度PCR仪，配备 96&amp;ndash;孔快速反应模块</td><td>Biorad</td><td>185-1196</td><td></td></tr><tr><td>SeqCap EZ 杂交与洗涤试剂盒</td><td>Roche Applied Science</td><td>05634253001</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II 逆转录酶 200 U/&amp;#956;l</td><td>Life Technologies</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt RNAClean XP - 40 ml</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>RNA ScreenTape</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5576</td><td></td></tr><tr><td>RNA ScreenTape Ladder</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5578</td><td></td></tr><tr><td>RNA ScreenTape 样品缓冲液</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067-5577</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma</td><td>72068-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DynaBeads MyOne 链霉亲和素 T1</td><td>Life Technologies</td><td>65602</td><td></td></tr><tr><td>DYNAMAG -96 侧磁架</td><td>Life Technologies</td><td>12331D</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma</td><td>C2432-1L</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HotStart ReadyMix</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 分光光度计</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>My Block Mini 干式恒温器</td><td>Benchmark</td><td>BSH200</td><td></td></tr><tr><td>D1000 试剂</td><td>Agilent Technol. Inc.</td><td>5067- 5583</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge Plus</td><td>Eppendorf</td><td>022829861&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

靶向rna测序实验用于分析基因表达与基因组变异

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA测序（RNAseq）是一种多功能方法，可用于检测和表征基因表达、突变、基因融合以及非编码RNA。标准RNAseq需要30至1亿条测序读长，可包含多种RNA产物，如mRNA和非编码RNA。我们展示了如何利用台式测序仪，通过靶向RNAseq（捕获法）对选定的RNA产物进行集中研究。RNAseq捕获技术能够表征传统RNAseq方法可能遗漏的未注释、低丰度或瞬时表达的转录本。本文描述了从细胞系中提取RNA、核糖体RNA去除、cDNA合成、条形码文库制备、靶向转录本的杂交与捕获，以及在台式测序仪上进行多重测序的实验流程。我们还概述了计算分析流程，包括质量控制评估、序列比对、融合基因检测、基因表达定量以及单核苷酸变异的识别。该检测方法可实现靶向转录本测序，用于表征基因表达、基因融合和突变。

RNAseq捕获技术关键步骤的示意图如图1所示。为验证RNAseq捕获技术的有效性，选用了四种具有已知突变的癌细胞系（携带ABL1融合基因的K562细胞系、携带RET融合基因的LC2细胞系、携带PDGFRalpha融合基因的EOL1细胞系，以及携带FGFR3融合基因的RT-4细胞系）。将这四个样本混合后，在台式测序仪上以2×100 bp的双端读长进行测序，生成FASTQ文件。FASTQ文件通过一个包含五个主要组件的RNAseq分析流程进行处理：1）质量控制评估，2）比对至人类转录组，3）基因表达定量，4）融合基因检测，以及5）变异检测。比对生成的BAM文件用于检测单核苷酸变异并计算基因表达水平。融合基因通过融合检测软件（如TopHat Fusion，其可自行完成比对）进行识别，并利用融合检测软件对结果进行注释。
通过RNAseq与捕获法对基因表达进...

我们介绍一种基于靶向RNA测序的方法，包括制备带索引的cDNA文库、使用定制探针进行杂交与捕获，以及数据分析，以检测特定转录本的基因表达、突变和基因融合。靶向RNA测序可在台式测序仪上对选定转录本进行经济高效且快速的评估。

靶向RNA测序实验用于分析基因表达与基因组变异

RNA测序（RNAseq）是一种多功能方法，可用于检测和表征基因表达、突变、基因融合以及非编码……

本实验的总体目标是富集目标转录本，用于下一代测序。这种靶向RNA测序实验是一种多步骤流程，首先从总RNA中去除核糖体RNA，随后进行化学片段化和互补DNA合成，条形码文库制备，靶向转录本的杂交与捕获，多重测序，最后进行数据分析。本视频将演示四个样本的杂交、靶向捕获以及捕获后PCR扩增的操作步骤。因此，该方法有助于解答分子生物学中的关键问题，例如鉴定基因融合、单核苷酸变异、相对基因表达水平以及涉及靶向转录本的可变剪接。该技术的主要优势在于可根据任何感兴趣的基因进行定制。开始杂交实验前，从-20摄氏度冰箱中取出以下组分，并在冰上解冻：定制水化探针、Cot-1 DNA、通用封闭寡核苷酸以及适配器特异性封闭寡核苷酸。在低吸附的 1.5 毫升离心管中，加入 500 纳克 DNA 样品、5 微升 Cot-1 DNA、1 微升通用阻断寡核苷酸、0.5 微升六核苷酸接头特异性阻断寡核苷酸以及 0.5 微升八核苷酸接头特异性阻断寡核苷酸。将样品管放入真空浓缩仪中，管盖打开并朝向与旋转方向相反的一侧。在 45 °C 下干燥 20 分钟，或直至液体完全蒸发。接下来，用8.5 µL的2×杂交缓冲液、3.4 µL杂交组分A和1.1 µL无核酸酶水重悬干燥物。静置10分钟以完成重悬，每2.5分钟涡旋振荡一次。将重悬后的样品转移至0.2 mL PCR管中，在热循环仪中于95 °C孵育10分钟。从PCR仪中取出杂交样品管，加入2 µL浓度为1.5 pmol/µL的定制探针。在65 °C条件下孵育杂交反应过夜。多重杂交后的下一步是使用链霉亲和素偶联的顺磁性微珠捕获靶向RNA。从4°C取出一管磁珠，在室温下平衡30分钟。配制所有所需缓冲液的1×工作液。取140 µL 1×洗涤缓冲液一，分装至新的1.5 mL离心管中。将此份缓冲液和全部1x严格缓冲液置于65摄氏度的加热块中加热至少两小时。取适量磁珠分装至1.5毫升离心管中。置于磁力分离架上，弃去上清液。加入磁珠洗涤缓冲液，涡旋振荡10秒。将离心管置于磁力架上2至5分钟，或直至上清液变澄清。弃去上清液。重复共洗涤两次。移除磁珠洗涤缓冲液后，加入与初始起始体积相等的磁珠洗涤缓冲液。重悬磁珠并转移至0.2毫升PCR管中。将试管置于磁力架上放置2至5分钟，或直至上清液变澄清。弃去上清液。将含有磁珠的试管置于65摄氏度的微型加热块中。将杂交样品转移至含有磁珠的离心管中，用移液器吹打混合10次，然后在65摄氏度孵育45分钟。每15分钟涡旋振荡样品一次，并使用固定转速的台式小型离心机离心4秒。45分钟孵育结束后，从加热块中取出捕获管。向离心管中加入 100 µL 预热的 1× 洗涤缓冲液一，然后涡旋振荡 10 秒以混匀。将混合液转移至一个新的低吸附性 1.5 mL 离心管中。将离心管放入磁力架中，静置 2 至 5 分钟以完成分离，或直至上清液变澄清。弃去上清液。加入200 µL预热的1×严格洗涤缓冲液，上下吹打10次以混匀。在65 °C下孵育5分钟。将试管置于磁力架上，静置2至3分钟以完成分离。弃去上清液。严格洗涤步骤重复一次，共洗涤两次。加入200 µL室温的1×洗涤缓冲液一，涡旋振荡2分钟以混匀。将离心管置于磁力架上，静置2至5分钟以完成分离，弃去上清液。加入200 µL室温的1×洗涤缓冲液二，涡旋振荡1分钟以混匀。将试管置于磁力分离架上2至5分钟，然后弃去上清液。加入200微升室温1×洗涤缓冲液3，涡旋振荡30秒以混匀。将试管置于磁力分离架上2至5分钟，然后弃去上清液。最后，将离心管从磁力架上取下，加入 20 µL 无核酸酶水以重悬磁珠。用移液器吹打 10 次，充分混匀。在进行捕获后 PCR 扩增前，将磁性磁珠从 4 °C 取出，在室温下平衡 30 分钟。从-20°C冰箱中取出2x热启动PCR预混液和PCR引物混合物，在室温下解冻，然后置于冰上。通过混合27.5 µL的2x热启动PCR预混液、2.75 µL的PCR引物一和2.75 µL的PCR引物二，制备文库扩增主混合液。在PCR管中进行反应，加入20 µL磁珠及捕获的DNA，再加入30 µL文库扩增主混合液。正确盖紧管盖，并涡旋混匀。使用固定转速的迷你台式离心机，在6 × g条件下离心4秒。将管放入热循环仪中，并按照以下PCR程序启动PCR扩增：98 °C预变性45秒，随后进行10至12个循环，每个循环包括98 °C变性15秒、65 °C退火30秒和72 °C延伸60秒。在75摄氏度下进行最后一步延伸反应，持续60秒，然后在4摄氏度下保存。PCR完成后，从PCR仪中取出样品。加入75 µL的顺磁性磁珠，充分混匀，并在室温下孵育15分钟。将离心管置于室温下的磁力架上2至3分钟，然后移除上清液。在磁力架上用200微升80%乙醇洗涤磁珠，孵育30秒后移除上清液。重复洗涤一次，共洗涤两次。第二次乙醇洗涤后，去除上清液，在室温下孵育5至10分钟使磁珠干燥，但不可过度干燥至开裂。将磁珠重悬于22 µL pH 8.0的Tris-EDTA中，静置3分钟以完成洗脱。将样品置于磁力架上3至5分钟。最后，将20微升洗脱产物转移至一个新的低吸附性1.5毫升离心管中，确保无微珠被带入。在四种癌细胞系中，对捕获法与非靶向RNA测序进行基因表达比较的结果显示，捕获法使靶向基因（以蓝色表示）的富集程度较非靶向基因（以灰色表示）提高了10至1000倍。此外，在捕获法构建的文库中，比对至靶向区域的读段比例较非靶向RNA测序文库有所提高。质量控制措施的评估结果显示，在比对转录组和主要插入片段大小方面，捕获法与非靶向RNA测序表现相当。使用捕获法测得的外显子区域比例更高，而内含子区域比例更低。正如预期，非靶向RNA测序每样本产生的总测序读段数量超过捕获法50倍以上。采用捕获方法后，每个样本中核糖体RNA序列所占百分比较低。最后，对四种细胞系在捕获测序和RNA测序重叠区域中鉴定出的单核苷酸变异进行比较，结果显示在目标区域内，捕获测序与RNA测序之间的变异具有高度一致性。一旦掌握该技术，若操作得当，可在三至四天内完成。进行此操作时，重要的是在捕获杂交靶标的过程中需快速操作，并确保反应始终保持在65摄氏度。该技术在开发后，为分子生物学领域的研究人员提供了以高通量且经济高效的方式研究目标转录本的途径。

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有针对性的RNA测序分析表征基因表达和基因组改变

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通过外显子捕获与大规模并行测序检测肿瘤标本中的体细胞遗传改变

采用RNA测序和生物信息学分析方法，鉴定小鼠EML细胞中Lin-CD34+和Lin-CD34-亚群内显著差异表达的转录因子。这些转录因子可能在调控自我更新的Lin-CD34+细胞与部分分化的Lin-CD34-细胞之间的转换过程中发挥重要作用。...

通过RNA测序分析鉴定调控EML造血前体细胞自我更新与分化的关键因子

本文描述了一种用于肿瘤学样本靶向二代测序的集成系统。该跨平台系统针对质量差、数量少的肿瘤活检样本进行了优化，可兼容低量DNA输入，包含经过充分表征的多变异对照，并采用一种新型变异检出算法，该算法结合了定量的分析前质量控制指标。...

湿实验与干实验流程的整合优化了低质量与低数量肿瘤活检样本的靶向下一代测序

本文描述了一种旨在研究异常剪接对实体瘤和血液系统恶性肿瘤耐药性影响的实验方案。为此，我们分析了亲本株和耐药株的转录组谱型 体外...

利用RNA测序检测与药物耐药性相关的新剪接变异体 体外 癌症模型

在形态学组织背景下利用RNA可视化遗传变异、短靶标及点突变 原位 杂交实验

miRNA 治疗在调控癌症进展方面具有重要意义。本文展示了用于鉴定联合 miRNA...

联合miRNA治疗调控细胞周期与血管生成的分析

在此，作者展示了MULTI-seq在表型分析及后续配对的单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞ATAC测序（scATAC-seq）中的应用价值，用于表征视网膜中的转录组和染色质可及性谱型。...

利用单细胞RNA测序和单细胞ATAC测序对视网膜基因表达与染色质可及性进行多重分析

此处，我们介绍一种针对胚胎致死基因敲除的实验方案 体内 在基因工程小鼠模型来源的肿瘤中进行基因敲除，随后评估该敲除对肿瘤生长、增殖、存活、迁移、侵袭以及转录组的影响 体外 和 体内.

通过肿瘤发生中定义基因功能 离体 恶性周围神经鞘瘤细胞中 floxed 等位基因的敲除

本方案描述了一种串联免疫荧光杂交检测法，利用甲醛固定石蜡包埋组织同时检测并定量 microRNA...

通过锁核酸进行微小RNA的扩增与识别 原位 杂交作为一种新型检测与定量方法

本实验方案描述了如何从小鼠骨髓中建立原代造血细胞培养，并随后使用 Gene Pulser MXCell...

小鼠骨髓来源的原代造血细胞培养物制备及其电穿孔

学习靶向RNA测序技术，通过杂交捕获和多重测序分析基因表达、突变及基因融合。该方法可定制目标基因，为分子生物学研究提供高性价比的转录组分析方案。

靶向RNA测序实验用于分析基因表达与基因组变异

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