利用离体海马神经元研究蛋白质底物吸引或排斥活性的条带实验

条带实验的总体目标是评估特定蛋白质（如导向分子）吸引或排斥神经元的能力。该方法有助于回答轴突导向领域的一些关键问题，例如，神经元如何响应外部细胞环境而发生迁移或延伸其轴突。该技术的主要优势在于，单次实验即可观察大量神经元，并可同时分析多个生长锥。

准备时，将四个到八个硅胶基质在水中煮沸五分钟。将其条纹面朝上放置于层流罩下完全晾干，约需一小时。

继续在通风橱内操作。使用压缩空气或粘性胶带清除基质条纹面的任何灰尘。然后将每块基质小心地放入单独的6厘米塑料培养皿中，条纹面朝下。

用一根手指用力按压每个基质，避免基质与培养皿之间残留气泡。若基质未能贴附，请重复该步骤。

固定后，在培养皿底部标记条带的位置。在 PBS 中制备荧光标记的重组蛋白，每条带培养皿制备 25 微升。

将混合物在室温下孵育30分钟。接下来，对于每个培养皿，用22号注射器吸取25 µL稀释后的蛋白质溶液，通过基质侧面的小孔注入。注意避免将气泡注入基质中，因为气泡会干扰蛋白质在培养皿上的结合。

将培养皿置于细胞培养箱中，在37摄氏度下孵育30分钟。孵育结束后，向每个基质的顶部狭缝中加入300微升PBS。然后从每个基质侧面的小孔中抽吸PBS，以去除所有未结合的重组蛋白。

不要完全吸净 PBS，以免蛋白质干燥。总共进行三次 PBS 洗涤。接下来，小心地从每块培养皿中取出基质。

然后立即在整个条带区域上加入约 100 微升的控制蛋白，使每块培养皿形成交替涂层。接着，将培养皿在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。同时，将层粘连蛋白和磷酸盐缓冲液（PBS）置于冰上解冻，浓度为每毫升 20 微克。

30分钟后，用PBS清洗培养皿三次。然后每皿加入约100微升冷的层粘连蛋白（laminin），将培养皿放回培养箱中继续孵育1小时。1小时后，再次用PBS清洗培养皿三次。

第三次洗涤后，向每皿中加入约150微升培养基。然后将培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育，直至下次使用。处死一只E15.5天的供体小鼠后，用手术剪沿头部正中矢状面剪开皮肤和颅骨，用微型刮匙取出脑组织。

将脑组织小心转移至含有 3 毫升 HBSS 的 60 毫升培养皿中。在培养皿中，使用解剖刀切取包含皮层、海马和纹状体的半球组织，随后通过仔细去除脑膜来分离海马区域。

将分离的海马组织转移至含有2毫升冰上预冷的HBSS溶液的15毫升离心管中。来自3个胚胎的6个海马足以用于在8个培养皿中培养神经元。收集完所有海马组织后，吸除HBSS溶液，并加入2毫升胰蛋白酶-EDTA溶液替代。

然后将试管置于37摄氏度水浴中孵育15分钟。接着加入500微升胎牛血清以中和胰蛋白酶活性。随后在100 ×g 条件下离心混合物5分钟。

吸去上清液，用两毫升培养基洗涤沉淀。然后再次离心混合物，并更换为新鲜培养基。现在使用剪去尖端的一毫升移液头，通过轻柔吹打来解离组织。

将组织在移液管头尖端上下吹打约10次。然后使用未剪切的1毫升枪头，重复吹打以获得单细胞悬液。接着通过80至100微米的细胞滤网，挤压悬液以分离单细胞。

然后将过滤后的悬液在150 G下离心5分钟，吸除上清液，并将沉淀重悬于2毫升培养基中。使用血细胞计数板对细胞进行计数，每孔预先制备好的条纹培养板中加入150微升培养基，接种10,000个神经元。小心地将细胞悬液滴加至条纹区域，确保完全覆盖整个条纹区域。

将E15.5小鼠的海马神经元解离后，接种并培养24小时，培养基底为荧光标记的对照蛋白FC条带，或接种在FLRT2 FC与非标记对照FC交替排列的条带上。在两种情况下，神经元均发生聚集，并以束状形式延伸其轴突。在FC对照组中，神经元分布均匀，轴突向随机方向延伸；相比之下，在含有FLRT2 FC条带的培养条件下，轴突避免在FLRT2 FC区域生长。

因此，延伸的轴突主要生长在 FC 条带上。高倍镜下可见，轴突沿 FLRT2 FC 条带的边界生长，但未延伸进入 FLRT2 区域。观看本视频后，您应能充分掌握如何制备推荐蛋白的条带状“地毯”，并利用离体培养的海马神经元评估其趋化吸引或排斥活性。

一旦掌握，若操作得当，该技术可在五小时内完成。