通过内在血管化进行组织工程 在体 内 组织工程室

本实验的总体目标是创建一个空间，使组织能够在形成强大血液供应的同时生长和扩张，最终生成具有血管化的大体积三维组织块。该方法有助于解决血管化组织工程在重建手术以及器官替代与修复领域中的关键科学问题。该技术的主要优势在于，新生成的组织由其自身的血管网络提供内在血供，而无需依赖周围环境的扩散作用来维持存活。

演示该操作的人员为 Sue McKay 和 Liliana Pepe。麻醉一只体重至少为 250 克的大鼠，并通过脚趾夹捏法评估麻醉深度。如果大鼠无反应，则在整个操作过程中使用 2% 异氟烷维持其麻醉状态。

接下来，将硫酸镁眼膏涂抹于眼睛。然后，将大鼠仰卧固定，使用电动剃刀剃除腹股沟部位的毛发，并用湿润的纱布清除残留毛发。随后，使用含有70%乙醇的氯己定溶液清洁手术部位。

最后，用无菌毛巾覆盖动物，并开始手术。使用15号刀片，在左侧腹股沟沿腹股沟韧带做一条长四厘米的皮肤切口。接着，用剪刀环形剪开暴露的腹股沟脂肪垫，但将其通过腹壁下血管蒂与血供相连，保持附着。

现在，使用显微剪刀松解腹壁与下方股血管之间的薄膜状结缔组织粘连。然后，将牵开器置于腹壁上，并向内侧牵拉，以暴露腹股沟韧带及整段股血管。接着，使用显微镊子和弯头剪刀，分离腹壁下静脉，并将其从周围脂肪组织中游离出来。

该静脉将作为牵拉线。接着打开包含股血管和神经的血管外膜鞘，从腹股沟韧带开始，一直切开至腹壁下支远端的分叉处。

此时以及整个操作过程中，对股血管的轻柔操作至关重要。若造成损伤，可能导致血栓形成，从而使整个实验失败。随后，使用显微镊子夹住股静脉的外膜，将其从周围组织及伴行动脉中轻轻分离。

此步骤中，切勿夹住静脉壁的全层厚度，以免损伤内膜，从而导致静脉易于发生血栓。同时，在此步骤中，使用10-0尼龙缝线结扎侧支，或使用双极电凝器进行凝固。将股静脉完全游离后，使用4-0丝线在近端和远端分别结扎，以获取一段至少10毫米长的静脉移植物，其中包含约0.5厘米长的腹壁上静脉分支。

该分支起到牵拉绳的作用，用于将环路固定在室内心室并保持其开放状态。接下来，修剪移植物两端的外膜组织。如有必要，此步骤可推迟至显微外科吻合前进行。

通过用肝素化生理盐水冲洗静脉移植物并使其在充满肝素化生理盐水的条件下静置，完成移植物的制备。随后，采用连续锁边的4-0丝线缝合关闭切口，并辅以两到三个间断的单纯缝合。首先，暴露腹股沟韧带以及对侧肢体股血管的全长，操作方法如前所述。

然后，使用显微镊子从周围脂肪垫中解剖并分离腹壁上动脉和静脉。将组织从血管上拉开时动作要轻柔。接着，夹住股动脉的外膜，将其从周围组织中游离出来。

在此过程中，结扎或凝固动脉的侧支。然后，在股动脉和股静脉近端分别放置血管钳。接着，使用4-0丝线在腹壁浅血管发出部位远端结扎股动脉和股静脉。

现在将无菌的塑料对比背景置于血管下方，使用锋利的直显微剪刀横向切断每根血管。切断后，用大量肝素化生理盐水用力冲洗血管，直至管腔内的所有血液完全清除。现在将静脉移植物置于手术视野中。

将静脉移植物放置到位，使其近端准备与受体股静脉吻合，远端准备与受体股动脉吻合。这样可使血液从动脉侧流向静脉侧，而不会受到静脉移植物内瓣膜的阻碍。确保股血管和静脉移植物处于自然位置，无任何扭曲。

使用10-0尼龙缝线，在两侧进行手术吻合。良好的无创显微外科吻合至关重要。血管内膜损伤、血管干燥或缝合位置不当均会使吻合部位易于形成血栓。

然后检查两个吻合部位是否有渗漏。对于小的渗漏（表现为非搏动性血液从吻合口流出），可在其上覆盖一小块脂肪组织或海绵，并轻柔压迫5到10分钟以止血。若出现较大的搏动性渗漏，导致整个术野迅速被血液充满，则需要追加缝合。

接下来，检查动静脉回路的通畅性。轻柔地阻断股动脉应使其塌陷；相反，阻断股静脉则应使回路充血膨胀。

现在将组织工程腔的基部置于动静脉袢下方。确保该袢处于自然位置，无任何扭曲或弯曲。然后使用6-0尼龙缝线，将腔的基部固定于腹股沟韧带及下方的肌筋膜上。

接下来，将盖子盖在腔室的基座上。用盖子夹住腹上部分支，以固定环的位置。然后，使用连续锁扣式4-0丝线缝合关闭切口，并额外加两到三针间断缝合。

最后，将动物置于单独的笼子中使其从麻醉状态恢复，并皮下注射一次剂量的卡洛芬作为镇痛剂。按之前的步骤进行动物的术前准备。可在一只大鼠的双侧腹股沟分别植入两个腔室。

然后，按照先前所述方法分离股血管。将动脉和静脉完全游离周围组织，并结扎其分支后，将灌流 chamber 置于手术区域。接着，将完整的股动脉和股静脉分别放入 chamber 底座对应的切口中。

确保两者均未扭曲或弯曲。接着，通过将盖子连接到底座上来关闭腔室。然后闭合伤口，并按照先前所述方法让动物恢复。

组织工程腔室的显微外科构建方法如前所述。利用体内血管化腔室已成功构建多种类型的组织，包括使用新生大鼠心肌细胞构建的心脏组织、使用大鼠骨骼肌成肌细胞构建的肌肉组织，以及使用源自脂肪组织细胞外基质的水凝胶构建的脂肪组织。体视学系统可对特定组织体积进行无偏定量分析。

例如，通过横切面中凝集素染色的内皮细胞可估算血管容积。在将荧光染料标记的细胞体内植入后，可追踪其命运。例如，经染料 i 标记的新生大鼠心肌细胞在植入后第三天可在组织构建物中被检测到。

此外，可使用物种特异性抗体来鉴定异种移植研究中植入的细胞。例如，可鉴定在免疫缺陷大鼠体内植入后从腔室中收获的组织中的人诱导性多能干细胞。一旦掌握操作技巧，流式腔室和动静脉环的植入分别大约需要20分钟和90分钟。

在进行该操作时，必须始终保持无菌状态，并在发生污染时采取必要的处理措施。切记，轻柔操作血管以及无创的显微外科吻合是确保手术成功的关键。因此，我们建议在尝试该操作前接受基本的显微外科培训，尤其是对于动静脉环的构建。