Name: 在组织工程由内在血管化在体内组织工程商会 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-05-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: 学习利用动静脉袢微外科技术构建体内血管化组织的方法。该技术通过建立独立血供网络，为器官再生、组织修复及疾病建模提供可靠的研究模型。

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本工作获得了澳大利亚国家健康与医学研究理事会（NHMRC）和斯塔福德·福克斯医学基金会资助项目的资助。作者感谢墨尔本圣文森特医院实验外科与外科手术单元的Sue McKay、Liliana Pepe、Anna Deftereos和Amanda Rixon提供的外科手术协助。维多利亚州政府创新、产业与区域发展部的运营基础设施支持计划也为本研究提供了支持。

本文所述方案已获得澳大利亚墨尔本圣文森特医院动物伦理委员会的批准，并严格遵循澳大利亚国家卫生与医学研究委员会指南进行。
注意：下文描述了两种腔室方案。两种不同的模型及其特定的腔室设计如图1所示。腔室（1）由聚碳酸酯制成（用于大鼠动静脉袢模型），呈圆柱形，内径为13 mm，高度为4 mm。腔室壁上设有一个窗口，可使血管蒂无阻碍地进入。第二种模型（用于大鼠贯通式血管蒂腔室模型）的腔室由聚丙烯酸酯制成，呈长方体形（内部尺寸为10 × 8 × 4 mm3），在相对两侧各有一个1.5 mm的开口，以容纳穿过腔室的股动脉和股静脉。
1. 大鼠动静脉环路腔室模型（每只动物一个腔室）
注意：在开始手术前，确保所有器械均已正确灭菌。同时，应将器械放置在无菌毛巾上，并置于距离手术区域适当的位置，以避免手术过程中发生污染。
<ol>
	<li>手术前动物准备
	<ol>
		<li>选用体重至少250 g的大鼠，因其血管较大，便于构建动静脉环路。</li>
		<li>通过吸入4%异氟烷对动物进行麻醉。通过夹捏脚趾无反应来确认麻醉深度足够。麻醉后，在整个手术过程中通过吸入2%异氟烷维持充分的麻醉状态&#160;。</li>
		<li>将动物仰卧置于加热垫上，并在眼睛表面涂抹无菌润滑剂，以防止手术期间角膜干燥。</li>
		<li>使用电动剃刀剃除双侧腹股沟区域的毛发，并用湿润纱布擦净残留毛发。</li>
		<li>用氯己定/70%乙醇溶液对术区进行消毒，并用无菌毛巾覆盖动物身体。&#160;皮下注射一次剂量的卡洛芬（5 mg/kg）作为镇痛药。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>股静脉移植物的获取
	<ol>
		<li>使用#15刀片，在左侧腹股沟区沿腹股沟韧带平行方向做一条长约4 cm的皮肤切口，暴露腹股沟脂肪垫。</li>
		<li>用剪刀环形切开脂肪垫，保留其基于腹壁下血管的血管蒂。</li>
		<li>使用显微剪刀分离腹壁与下方股血管之间的薄膜状结缔组织粘连。</li>
		<li>将牵开器置于腹壁并牵向内侧，以暴露腹股沟韧带及整段股血管。</li>
		<li>使用显微镊和弯头显微剪，通过轻拉和剪切的方式分离腹壁下静脉，并将其从周围脂肪组织中游离出来。该静脉在构建环路时作为固定牵拉点。</li>
		<li>使用显微镊和弯头显微剪，从腹股沟韧带至远端分叉处（位于腹壁下分支远端）完整切开包裹股血管和神经的血管鞘。</li>
		<li>使用显微镊夹住股静脉的外膜，通过轻拉和剪切的方式，用显微镊和弯头圆头显微剪将其从周围组织及伴行动脉中分离出来。 
		注意：切勿夹住静脉壁全层，以免损伤内膜，导致血栓形成倾向。</li>
		<li>在解剖过程中发现的侧支血管，使用10/0尼龙缝线结扎或双极电凝仪进行凝固处理。</li>
		<li>当股静脉完全游离后，使用4/0丝线在其近端和远端分别结扎。确保获取的静脉移植物长度至少为10 mm，并保留约0.5 cm长的腹壁下分支，作为“牵引绳”以在腔室内固定环路张开状态。</li>
		<li>使用显微镊和直头显微剪，通过轻拉和剪切的方式修剪移植物两端的外膜。此步骤也可在显微吻合前进行。</li>
		<li>用肝素化生理盐水（含肝素10 U/mL）冲洗静脉移植物，并将其浸泡于该溶液中备用。使用连续锁边缝合（4/0丝线）加两至三个间断缝合关闭切口。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>动静脉环路的构建与腔室植入
	<ol>
		<li>在对侧肢体完全重复步骤1.2.1至1.2.4的操作。</li>
		<li>使用显微镊从周围脂肪垫中分离并游离腹壁下动脉和静脉，操作时轻轻将组织从血管上剥离。</li>
		<li>使用显微镊夹住股动脉外膜，将其从周围组织中游离出来。操作时使用显微镊和弯头圆头显微剪，通过牵拉和剪切完成。其侧支血管应予以结扎或电凝处理。</li>
		<li>使用4/0丝线在腹壁下血管发出部位远端结扎股动脉和股静脉。</li>
		<li>在股动脉和股静脉近端各放置一个单个血管夹。使用锐利的直头显微剪，在腹壁下分支发出部位远端对每条血管做一干净的横向切口。在血管下方放置无菌塑料对比背景板。</li>
		<li>用大量肝素化生理盐水强力冲洗血管，直至管腔内血液完全清除。</li>
		<li>将静脉移植物引入手术视野，如有需要，按步骤1.2.10的方法清除血管断端多余的外膜。</li>
		<li>使用10/0尼龙缝线完成两处显微吻合。将静脉移植物近端与股静脉吻合，远端与股动脉吻合。此设计可使血流从动脉侧流向静脉侧，避免静脉移植物内瓣膜造成的阻力。 
		注意：确保股血管和静脉移植物处于自然位置，无扭曲或成角。</li>
		<li>检查两处吻合口是否存在渗漏。对于小的非搏动性渗漏（表现为吻合口处缓慢渗血），可在其上覆盖一小块脂肪组织并轻压5–10分钟予以处理；对于迅速充满术区的搏动性大渗漏，则需追加缝合。</li>
		<li>检查动静脉环路的通畅性。轻压股动脉应导致其塌陷，而轻压股静脉则应使其充盈扩张。</li>
		<li>将组织工程腔室的底座置于动静脉环路下方，确保环路自然平展，无扭曲或折叠。</li>
		<li>使用6/0尼龙缝线将腔室底座固定于腹股沟韧带及下方肌肉筋膜上。</li>
		<li>将腔室盖板盖到底座上，使股血管通过腔室侧壁的缺口（窗口）进入腔内。关闭盖板时，确保腹壁下分支被夹在底座与盖板之间，作为牵拉固定点以维持动静脉环路的位置。</li>
		<li>使用连续锁边缝合（4/0丝线）加两至三个间断缝合关闭切口。</li>
		<li>将动物置于加热垫上，使其从麻醉中恢复。&#160;</li>
		<li>在动物恢复至能够维持胸卧位意识水平前不得离开看护。同样，术后动物在完全恢复前不得与其他动物合笼饲养。术后24小时&#160;，再次皮下注射一次卡洛芬（5 mg/kg）作为镇痛药。</li>
		<li>术后连续5天局部使用抗生素软膏处理伤口。若伤口裂开，应按照步骤1.1.2至1.1.5重新麻醉动物，并按步骤1.3.14重新缝合伤口。每日监测动物健康状况。若动物出现超过一项中度症状（如活动减少、食欲减退、体重下降、体色变差），应通过腹腔注射致死剂量的戊巴比妥钠溶液（163 mg/kg，0.25 mL，23 G针头）实施安乐死。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 透析式皮瓣蒂腔室（每只动物两个腔室）
<ol>
	<li>手术前动物准备
	<ol>
		<li>重复步骤 1.1.1 至 1.1.4。可在单只大鼠的双侧腹股沟区域植入两个腔室。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>股血管的分离与腔室植入
	<ol>
		<li>重复步骤 1.2.1 至 1.2.8。</li>
		<li>在股动脉和股静脉完全游离周围组织且其分支已结扎后，将腔室移入手术区域。</li>
		<li>将完整的股血管分别置于腔室基座对应的切口上，确保无扭曲或折叠。</li>
		<li>通过将盖子固定到基座上关闭腔室。使用连续缝合的 4/0 丝线缝合切口，并辅以两到三个额外的间断缝合，然后按照前述方法让动物恢复。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 培养室收获与组织处理
<ol>
	<li>当达到实验时间点（植入后4-6周）时，按照步骤1.1.2麻醉动物，并重复步骤1.1.3至1.1.5。</li>
	<li>使用15号刀片切开伤口，并用剪刀剪开组织，直至完全暴露腔室。</li>
	<li>暴露构建物近端的股血管并检测血管通畅性：用两把显微镊子轻轻夹闭血管，将血液向远端挤出，然后松开近端的镊子。若血管重新充盈血液，则表明通畅。对于动静脉环模型，近端结扎股血管；对于流通式模型，则近远端均需结扎，并移除含有组织的腔室 整块地</li>
	<li>实验结束时，使用腹腔注射致死剂量的戊巴比妥钠溶液（163 mg/kg，0.25 ml，23 G针头）处死动物。</li>
	<li>在室温下用4%多聚甲醛固定组织24小时。将组织切成多个横截面（厚1-2 mm），分别包埋于石蜡或最佳切割温度化合物中，用于制备石蜡切片（5 µm）或冰冻切片（10 µm）。3,4,8,17,22,24</li>
	<li>进行常规组织学染色（如苏木精和伊红染色）以观察组织的一般形态。使用特异性抗体进行免疫组织化学染色，以鉴定目标细胞类型。3,4,8,17,22,24,29 例如，对心肌细胞进行心肌肌钙蛋白T免疫染色。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无竞争利益。

微循环的构建目前主要通过两种方法进行研究。第一种方法是在构建物内形成高度相互连通的血管网络 体外 因此，当植入后，宿主血管床的毛细血管会通过一种称为吻合（inosculation）的过程与移植构建物中的毛细血管相连接，从而确保营养物质不仅送达周边区域，也输送至核心部位。21,32,33 这称为预血管化。第二种方法旨在直接增强宿主自身的血管系统 体内以便毛细血管出芽发生在植入细胞分化和组织生长之前或同时进行。17,34
本文介绍的体内组织工程腔室技术方案，通过将动脉和静脉以动静脉袢或贯通式血管蒂的构型置于一个受保护的空腔内，利用后一种原理，随时间推移促进大量新生毛细血管的出芽与形成。3 该腔室技术的优势包括：（1）无需进行体外操作；（2）可形成完全自体来源的血管网络，不会被宿主排斥；（3）无需经历1至7天的吻合期，避免组织构建物在此期间发生缺血风险。35,36
然而必须指...

利用组织工程技术构建具有功能的血管化组织，是再生医学领域的一个新兴范式。1,2 目前已开发出多种组织工程方法，用于生成新的健康组织，以替代受损组织或有缺陷的器官，3-6 这些方法在小型动物模型中进行了实验，展现出良好的临床应用前景。7,8 然而，血管化仍是组织工程面临的主要挑战之一，限制了其构建具有临床应用规模组织的潜力。9
目前用于使组织血管化的方法主要遵循外源性途径，即新生血管从受体的血管床长出，并侵入植入的组织构建物中10 或一种内在血管化途径，其中血管与新发育的组织同步生长和扩展。11 外源法传统上涉及将细胞接种到支架上 体外 并将完整的构建物植入活体动物体内，期望原本由培养基提供的营养物质能够通过血液循环供给。12,13 该概念过于简单化，因为血管长入速度过慢，且仅适用于非常薄的植入物（&#60;1-2毫米厚）的组织仍可保持活性。通过充分且快速的血管化来提供营养和氧气，是构建更复杂、更大体积的组织工程替代物（如骨、肌肉、脂肪和实体器官）成功的关键所在。14,15 内在血管化具有促进更大组织构建物发育的潜力，其组织生长与不断扩展的血液供应相匹配。一种设计是 体内 植入带有或不带有细胞接种支架的血管蒂腔室。5,6 这为生成更厚的、具有内在血管化的组织开辟了新途径。16,17
最近，研究人员已开发出在植入前对组织移植物进行预血管化的策略。这些移植物中包含的血管网络旨在植入时与宿主血管发生吻合，从而快速建立完整的血液供应，以提高移植的厚组织移植物各部分的存活率。18
我们率先开发了一种 体内 在小型动物中建立的血管化组织工程模型，该模型涉及皮下植入一个半刚性封闭腔室，腔室内包含灌注的血管蒂和含细胞的生物材料。该腔室可形成缺血环境，从而刺激植入血管发生血管生成性出芽。3 血管蒂可以是重建的动静脉环，也可以是完整的贯穿式动脉和静脉。3-6,19 该血管蒂发出一个功能完善且分布广泛的动脉-毛细血管-静脉网络，其动脉端和静脉端均与血管蒂相连接。3,20 此外，周围的中空支撑腔可保护发育中的组织免受可能造成变形的机械力影响，并延长缺血驱动以促进血管化。3,21,22 如果血管蒂仅被植入正常组织中，而未置于观察 chamber 的保护空间内，则血管生成性出芽将与普通伤口愈合过程同步停止，且血管蒂周围不会积累新的组织。研究人员已利用这一现象 体内 构建具有支持性血管网络且尺寸达到临床相关水平的三维功能性血管化组织。4,23 此外，可将带有完整血管蒂的工程化血管化组织构建物取出，用于后续在损伤部位的移植。24,25 更具临床可行性的方案是在重建的最终部位（如乳房）创建腔室。因此，这 从头合成 组织工程方法可能具有临床潜力，可为重建手术提供一种新的功能性靶组织来源。26-28 
以下方案将提供构建一个的通用指南 体内 大鼠体内血管化组织工程腔室，可适配于不同动物模型，用于研究血管生成、基质产生以及细胞迁移与分化等复杂过程。

<table><tbody><tr><td>1 把 15 号刀片手术刀</td><td>Braun</td><td>BB515</td><td></td></tr><tr><td>1 把带齿 Adson 镊子</td><td>Braun</td><td>BD527R</td><td></td></tr><tr><td>1 把持针器</td><td>Braun</td><td>BM201R</td><td></td></tr><tr><td>1 台双极电凝器&amp;nbsp;</td><td>Braun</td><td>US335</td><td></td></tr><tr><td>1 把微型持针器 B-15-8.3</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00763</td><td></td></tr><tr><td>1 把微型扩张镊 D-5a.2</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00125</td><td></td></tr><tr><td>1 把微型珠宝镊 JF-5</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00108</td><td></td></tr><tr><td>1 把直型微型剪刀 SAS-11</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00098</td><td></td></tr><tr><td>1 把弯型微型剪刀 SDC-11</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00090</td><td></td></tr><tr><td>2 把单齿止血钳 B-3</td><td>S &amp;amp; T</td><td>00400</td><td></td></tr><tr><td>2 根 10/0 尼龙缝线</td><td>S &amp;amp; T</td><td>03199</td><td></td></tr><tr><td>1 根 6/0 尼龙缝线</td><td>Braun</td><td>G2095469</td><td></td></tr><tr><td>2 根 4/0 丝线缝线</td><td>Braun</td><td>C0760145</td><td></td></tr><tr><td>1% 利多卡因（Xilocaine）</td><td>Dealmed</td><td>150733</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>肝素钠</td><td>Dealmed</td><td>272301</td><td>5,000 UI/ml</td></tr><tr><td>乳酸林格液</td><td>Baxter</td><td>JB2323</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>1 个圆顶形组织工程腔室</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 个灌流腔室</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>凝集素 I，扁豆素（Griffonia Simplicifolia）&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1105</td><td>1.67 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>肌钙蛋白 T 抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab8295</td><td>4 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>人特异性 Ku80 抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab80592</td><td>0.06 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>结蛋白（Desmin）抗体</td><td>Dako</td><td>M0760</td><td>2.55 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>细胞示踪染料 CM-DiI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C-7000</td><td>3 mg/10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; 个细胞</td></tr><tr><td>戊巴比妥钠（Lethabarb）</td><td><a href="www.virbac.com.au" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Virbac Animal Health</a></td><td>LETHA450</td><td>325 mg/ml</td></tr><tr><td>柔性加热垫</td><td><a href="http://www.redzoneheating.com.au" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Redzone Heating</a></td><td>RZ/Medium</td><td></td></tr></tbody></table>

通过内在血管化进行组织工程 在体 内 组织工程室

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

在重建外科领域，目前自体组织重建方法存在操作复杂、成本高昂且以一处缺损修复另一处缺损的问题，临床亟需替代方案。组织工程有望满足这一日益增长的需求。然而，大多数组织工程策略因血管化不足，难以生成稳定且具有功能的组织替代物。本文重点介绍一种 体内 组织工程腔室模型中的内在血管化，是指将灌注的动脉和静脉以动静脉环或贯通式血管蒂的构型引入一个受保护的中空腔室内。在此基于腔室的系统中，血管新生的芽状出芽从动静脉血管发生，同时该系统可吸引缺血和炎症驱动的内源性细胞迁移，逐步使腔室空间被纤维血管组织填充。在构建腔室时植入外源性细胞/基质可增强细胞存活，并决定所形成工程化组织的特异性。我们的研究表明，该腔室模型可成功生成多种组织，如脂肪、心肌、肝脏及其他组织。然而，仍需进行改进与优化，以确保目标组织的形成具有稳定性和可重复性。本文介绍了一种标准化操作流程，用于构建两种不同的血管化组织工程腔室模型 体内.

组织工程舱的显微外科构建操作按照上述方案中所述进行。可在舱内生成的组织可按照方案第3步所述进行组织学检查。体内血管化舱内已成功构建多种类型的组织（图2），包括利用新生大鼠心肌细胞构建的心肌组织（图2A）、利用大鼠骨骼肌成肌细胞构建的肌肉组织（图2B），以及利用源自脂肪组织细胞外基质的水凝胶构建的脂肪组织（图2C）。
可使用体视学分析系统或ImageJ软件对组织进行形态计量学评估。3,4,8,17,22,29 除对各类组织成分进行定性评估外，体视学系统还可实现特定组织体积的无偏定量分析。例如，利用体视学系统结合视频显微镜，可对凝集素（啮齿类动物内皮细胞标记物）染色的横断面切片（图3）进行分析，以估算所获取组织构建物的血管体积。类似定量方法亦可用于评...

本指南介绍如何在组织工程腔室内利用显微外科动静脉环或贯穿式血管蒂结构构建体内血管化组织。所生成的血管化组织可用于器官再生、组织缺损修复，以及药物筛选和疾病模型研究。

在重建外科手术中，目前自体组织重建方法存在操作复杂、成本高昂等问题，临床上亟需一种替代方案。

本实验的总体目标是创建一个空间，使组织能够在形成强大血液供应的同时生长和扩展，最终生成具有血管化的大型三维组织块。该方法有助于解决血管化组织工程在重建手术以及器官替代与修复领域中的关键科学问题。该技术的主要优势在于，新生成的组织由其自身的血管网络提供内在血供，而无需依赖周围环境的扩散作用来维持存活。演示该操作的人员为 Sue McKay 和 Liliana Pepe。麻醉一只体重至少为 250 克的大鼠，并通过脚趾夹捏法评估麻醉深度。如果大鼠无反应，则在整个操作过程中使用 2% 异氟烷维持其麻醉状态。接下来，将硫酸镁眼膏涂抹于眼睛。然后，将大鼠仰卧固定，使用电动剃刀剃除腹股沟部位的毛发，并用湿润的纱布清除残留毛发。随后，使用含有70%乙醇的氯己定溶液清洁手术部位。最后，用无菌毛巾覆盖动物，并开始手术。使用15号刀片，在左侧腹股沟沿腹股沟韧带平行方向做一条4厘米长的皮肤切口。接着，用剪刀环形剪开暴露的腹股沟脂肪垫，保留其以腹壁下血管为蒂的血管蒂。现在，使用显微剪刀松解腹壁与下方股血管之间的菲薄结缔组织粘连。然后，在腹壁上放置牵开器，并将其向内侧牵拉，以暴露腹股沟韧带及整段股血管。接着，使用显微镊和弯头剪刀分离腹壁下静脉，并将其从周围脂肪组织中游离出来。该静脉将作为牵拉线使用。接着打开包含股血管和神经的血管周围鞘膜，从腹股沟韧带开始，一直切开至腹壁下支远端的分支处。此时及整个操作过程中，必须轻柔处理股血管，任何损伤均可能导致血栓形成，进而造成实验失败。随后，使用显微镊夹住股静脉的外膜，轻轻将其与周围组织及伴行动脉分离。此步骤中，切勿夹住静脉壁的全层厚度，以免损伤内膜，导致静脉易于发生血栓。同时，使用10-0尼龙缝线结扎侧支，或使用双极电凝器对其进行凝固处理。完全游离股静脉后， proximally 和 distally 使用4-0丝线结扎，获取一段至少10毫米长的静脉移植物，其中包含约0.5厘米长的腹壁上静脉分支。分支起到牵拉绳的作用，用于在腔内固定环状结构以保持其开放。接下来，修剪移植物两端的外膜组织。如有必要，此步骤可推迟至显微外科吻合前进行。用肝素化生理盐水冲洗血管移植物并完成制备，随后使其充满肝素化生理盐水静置备用。接着，采用连续锁扣式4-0丝线缝合关闭切口，并辅以两到三个间断单缝线加固。首先，暴露腹股沟韧带及对侧肢体股血管的全长，操作方法如前所述。然后，使用显微镊子从周围脂肪垫中解剖并分离腹壁上动脉和静脉。牵拉组织远离血管时动作要轻柔。接着夹住股动脉的外膜，将其从周围组织中游离出来。在此过程中，结扎或凝固动脉的侧支。然后，在股动脉和股静脉近端分别放置血管钳。接着，使用4-0丝线在腹壁浅血管发出部位远端结扎股动脉和股静脉。现在将无菌的塑料对比背景置于血管下方，使用锋利的直显微剪刀横向切断每根血管。切断后，用大量肝素化生理盐水用力冲洗血管，直至管腔内的所有血液完全清除。现在将静脉移植物置于手术视野中。将静脉移植物放置到位，使其近端准备与受体股静脉吻合，远端准备与受体股动脉吻合。这样可使血液从动脉侧流向静脉侧，而不会受到静脉移植物内瓣膜的阻碍。确保股血管和静脉移植物处于自然位置，无任何扭曲。使用10-0尼龙缝线，在两侧进行手术吻合。良好的无创显微外科吻合至关重要。若损伤血管内膜、血管干燥或缝合位置不当，均会使吻合部位易于形成血栓。然后，检查两个吻合部位是否有渗漏。对于小的渗漏（表现为非搏动性血液从吻合口流出），可在其上覆盖一小块脂肪组织或海绵，并轻轻压迫5到10分钟以止血。若出现较大的搏动性渗漏，导致整个术野迅速被血液充满，则需要追加缝合。 接下来，检查动静脉袢的通畅性。轻柔地阻断股动脉应使其塌陷；相反，阻断股静脉则应使袢充血膨胀。现在将组织工程腔的基底部置于动静脉袢下方。确保该袢处于自然位置，无任何扭曲或弯曲。然后使用6-0尼龙缝线，将腔体基底部固定于腹股沟韧带及下方的肌肉筋膜上。接下来，将盖子盖在腔室基座上。将剑突下分支夹在盖子下方，以固定环状结构的位置。然后，使用连续锁扣式4-0丝线缝合伤口，并辅以两到三针间断单纯缝合。最后，将动物置于单独的笼子中使其从麻醉中恢复，并皮下注射单剂量卡洛芬作为镇痛剂。按之前的步骤进行手术准备。可在一只大鼠的两侧腹股沟分别植入两个腔室。然后，按照先前所述方法分离股血管。在动脉和静脉完全游离周围组织且其分支均已结扎后，将灌流 chamber 置于手术区域。接着，将完整的股动脉和股静脉分别放入 chamber 底座对应的切口内。确保两者均未扭曲或弯曲。接着，通过将盖子连接到底座上来关闭腔室。然后闭合伤口，并按照先前所述方法让动物恢复。组织工程腔室的显微外科构建方法如前所述。利用体内血管化腔室已成功构建多种类型的组织，包括使用新生大鼠心肌细胞构建的心脏组织、使用大鼠骨骼肌成肌细胞构建的肌肉组织，以及使用源自脂肪组织细胞外基质的水凝胶构建的脂肪组织。体视学系统可对特定组织体积进行无偏定量分析。例如，通过凝集素染色的横切面内皮细胞可用来估算血管容积。在将荧光染料标记的细胞进行体内植入后，可追踪其命运。例如，用染料 i 标记的新生大鼠心肌细胞在植入后第三天可在组织构建物中被检测到。此外，可使用物种特异性抗体来鉴定异种移植研究中植入的细胞。例如，可鉴定在免疫缺陷大鼠体内植入后从腔室中收获的组织中的人诱导性多能干细胞。一旦掌握操作技巧，流式腔室和动静脉环的植入分别大约需要20分钟和90分钟。在进行该操作时，必须始终保持无菌状态，并在发生污染时采取必要的处理措施。切记，轻柔操作血管以及无创的显微外科吻合是确保手术成功的关键。因此，我们建议在尝试该操作前接受基本的显微外科培训，尤其是对于动静脉环的构建。

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