Name: 从青蛙和蝾螈的卵母细胞活巨Lampbrush染色体的分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 学习从两栖动物卵母细胞中分离巨型灯刷染色体的方法，用于细胞生物学和遗传学研究。该技术结合免疫荧光与原位杂交，帮助研究人员实时观察转录过程并深入理解染色体结构与功能。

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本研究由美国国立卫生研究院下属的国立普通医学科学研究所资助，项目编号为 R01 GM33397。本内容完全由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。J.G.G. 是美国癌症协会发育遗传学讲席教授。

有关青蛙和蝾螈的一般信息以及实验动物来源，可访问以下网站获取：Xenbase（http://www.xenbase.org）和 Sal-Site（http://www.ambystoma.org）。本实验方案遵循卡内基科学研究所胚胎学系的动物护理指南。
1. 溶液
<ol>
	<li>制备 10 L &#34;蛙水&#34;：加入10 mL的1 M CaCl₂2 和10 mL 1 M NaHCO₃3 至10 L去离子水或去氯水2O，同时搅拌。</li>
	<li>配制1 L 20%多聚甲醛：配制1 L 4 mM Na2CO3在通风橱中加入200 g粉末状多聚甲醛，加热至约80 ℃ oC以溶解。冷却后，用滤纸过滤。注意：多聚甲醛具有毒性，必须小心操作。或者，可购买市售的多聚甲醛溶液。</li>
	<li>配制1升两栖动物麻醉溶液：将1.5 g氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐加入1 L蛙用养殖水中，混匀。室温保存。</li>
	<li>配制1升卵母细胞培养基OR214：82.5 mM NaCl，2.5 mM KCl，1 mM CaCl2，1 mM MgCl2，1 mM Na2HPO4，5 mM HEPES（来自500 mM 储液，pH 8.3）。最终pH约为7.8。加入100 mg氨苄青霉素和100 mg链霉素以防止细菌生长。</li>
	<li>配制1 L GV分离液：83 mM KCl，17 mM NaCl，6.5 mM Na2HPO4，3.5 mM KH2PO4，1 mM MgCl2，1 mM 二硫苏糖醇（DTT）。调节pH至7.0。</li>
	<li>配制100 mL GV分散液：20.7 mM KCl，4.3 mM NaCl，1.6 mM Na2HPO4，0.9 mM KH2PO4，1 mM MgCl2，1 mM 二硫苏糖醇（DTT），0.1% 多聚甲醛。调节pH至7.0。为促进核凝胶更快分散，加入10–50 µM CaCl₂2.</li>
	<li>配制500 mL涂底层溶液。将0.5 g市售明胶在20 mL H₂O中溶胀2O，5-10 分钟。加入 500 mL 沸腾的 H2O，并轻轻摇晃以溶解明胶。冷却后加入50 mg CrK(SO₄)₂4)2 ·12 小时2O. 抽滤，并在 4 ℃ 下保存 oC.</li>
	<li>配制10 mL封片液。将10 mg对苯二胺溶解于5 mL PBS（135 mM NaCl，2.5 mM KCl，4.3 mM Na2HPO4，1.5 mM KH2PO4，调节pH至9。加入5 mL甘油。分装为250 µL每份，于-80℃保存 oC.</li>
</ol>
2. 材料
<ol>
	<li>对于涂胶载玻片，将 3 英寸 × 1 英寸的玻璃显微镜载玻片放入商用洗涤剂溶液中，轻轻擦拭以去除任何污染物。将载玻片置于载玻片架中，先用自来水充分冲洗，再用去离子水冲洗。将载玻片浸入涂胶液中，倾斜沥干后，于 60 °C 烘箱中烘烤过夜。 oC.</li>
	<li>对于塑料方片，从1 mm厚的聚甲基丙烯酸甲酯板上切割出25 mm的方片。在每片方片中央钻一个直径5 mm的圆孔。对每片方片的两个表面、边缘以及孔的周边进行打磨。 
	注意：作为下一段所述自制塑料方块和凹玻片的替代方案，可使用商用粘合剂 原位 PCR 和杂交室（25 µL）。也可尝试使用可重复使用的细胞培养硅胶隔离器，但目前尚未经过充分测试。</li>
	<li>对于载玻片，熔化 20 - 30 g 石蜡（56 - 57 oC) 在50 mL玻璃烧杯中，置于加热板上。使用20 µL移液器，将一滴5 µL石蜡均匀涂布于涂布载玻片中心两侧。将塑料方片压入石蜡中，并将载玻片放回加热板上。石蜡将融化并均匀扩散至塑料方片下方。
	<ol>
		<li>从加热板上取下载玻片并使其冷却。在载玻片两端下方各放置一个支撑物，确保载玻片在冷却过程中不与台面接触。如果石蜡冷却过快，可能会从中央孔处脱离。准备10个或更多的凹孔载玻片：每次GV制备均使用新的凹孔载玻片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于离心的载玻片架应使用针对所用转子专门设计的载具。多家制造商提供的离心机配备有适用于96孔塑料板的载具，这些载具可较容易地改装以固定显微镜载玻片。</li>
</ol>
3. 卵母细胞的分离
<ol>
	<li>将一只成年雌性青蛙（Xenopus laevis 或 Xenopus tropicalis）或蝾螈（Ambystoma mexicanum）置于足以完全浸没动物的麻醉液中。当动物停止活动后，将其腹部朝上放置于合适容器内的碎冰床上。</li>
	<li>使用手术剪在腹部下侧偏离中线处做一长度为 2 - 3 cm 的切口。轻柔地移开内脏器官，以找到切口侧的卵巢（腹腔两侧各有一个卵巢）。根据实验计划所需卵母细胞的数量，切取适当大小的卵巢组织。由于每个卵巢中含有数千个卵母细胞，通常只需取相对较小的一块卵巢组织（1 - 3 cm）即可满足需求。</li>
	<li>将一块或多块卵巢组织置于盛有 OR2 生理盐水的大培养皿（100 mm）中，在室温下保存。若能及时去除受损的卵母细胞并每日更换 OR2 溶液，卵母细胞可在良好状态下保存数天。</li>
	<li>用手术丝线缝合切口，并将动物放入单独的玻璃缸中恢复。加入适量&#34;frog water&#34;以浸没动物，直至其恢复意识（约 15 分钟）。当动物出现自主运动后，将玻璃缸注满水。尽管应使用新鲜水，但无需无菌条件，因为两栖类动物术后几乎不会发生感染。如有需要，可在缝合处涂抹新霉素。伤口通常在数天内完全愈合，同一动物可在约两个月后再次使用。</li>
</ol>
4. 生发泡（GV）的分离
<ol>
	<li>取部分卵巢组织（含10 - 20个大型卵母细胞），置于盛有OR2溶液的小型培养皿（35 × 10 mm）中。</li>
	<li>使用两对#5精细镊子撕开连接卵母细胞与卵巢壁的细小组织 stalk，从卵巢中取出一个卵母细胞，并将其放入另一盛有GV分离培养基的小型培养皿中。 
	注意：LBC的形态取决于卵母细胞的大小（成熟度）。在略小于完全大小的卵母细胞中，LBC长度达到最大，且环状结构明显。最成熟的卵母细胞通常含有染色体较短、环状结构收缩的特征。</li>
	<li>在解剖显微镜的低倍镜下（视野直径约为10 - 20 mm）进行以下操作：
	<ol>
		<li>用两对镊子在动物极（深色半球）附近夹住卵母细胞，制造一个小裂口。在挤出的卵黄中寻找透明的卵母细胞核，即生发泡（germinal vesicle，GV）。</li>
		<li>或者，用一对镊子在动物极附近戳一个较大的孔，轻轻挤压，使GV随卵黄一同挤出（图2）。</li>
		<li>轻轻将GV从大部分卵黄中滚离。通常会有一小部分卵黄紧密附着在GV表面。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 去除核膜
<ol>
	<li>对于 X. laevis 和 X. tropicalis在分离后60秒内，即使仍有少量附着的卵黄，也将GV从分离液转移至铺展液中。 
	注意：这两种物种的GVs &#34;硬化&#34; 若留在分离液中约60秒内，细胞将不会在后续步骤中铺展，因此在观察时速度至关重要 非洲爪蟾 GV内容。
	<ol>
		<li>用一对精细镊子夹住生发泡（GV）顶部附近的核膜，注意不要下压。用第二对镊子尽可能靠近第一对的位置夹住核膜。将两对镊子朝相反方向拉开，生发泡内容物将被释放出来 &#34;流行&#34; 脱离包膜，该包膜紧密附着于一个或两个镊子上。</li>
		<li>用玻璃移液管或可调式20 µL微量移液器吸取GV内容物。若使用可调式移液器，将移液器设定为10 µL，并用剃刀片切去塑料吸头的尖端。先吸入5 µL液体，再用剩余的5 µL吸取GV。</li>
		<li>将仍处于凝胶状态的细胞核内容物转移至已预先加有铺展液的凹玻片中央。铺展液的液面必须呈凸面，以确保加盖盖玻片时不会产生气泡。</li>
		<li>加盖18 mm盖玻片，将载玻片置于湿盒中。接下来的10–60分钟内，核凝胶会逐渐扩散，使染色体和核内细胞器平铺于载玻片表面。 
		注意：蝾螈的卵黄囊 A. mexicanum 和 N. viridescens 不要 &#34;硬化&#34; 在分离介质中，核膜的去除可以比在其他情况下更从容地进行。 非洲爪蟾</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照5.1.1节所述方法，但在分离培养基中去除蝾螈生发泡（GV）的核膜。
	<ol>
		<li>用移液器吸取略微凝胶化的GV内容物，并转移至含有铺展液的培养皿中。</li>
		<li>用移液枪吸头在铺展液中快速冲洗一次，吸取核凝胶后将其置于预先加有铺展液的凹玻片中央。盖上18 mm盖玻片，将整个玻片放入湿盒中。在接下来的10至60分钟内，核液将缓慢扩散，染色体和核内细胞器将逐渐平铺于玻片表面。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. LBCs 与细胞器的初步观察
<ol>
	<li>在铺展腔室中分散核内容物后，使用相差显微镜（常规直立显微镜）在低倍镜下观察LBCs和核内细胞器。由于腔室深度约为1 mm，而核内容物位于底部，因此应使用具有较长工作距离的低倍物镜（5X - 10X）。 
	注意：此时检查样本的主要目的是判断是否值得继续进行后续步骤。在制备良好的样本中，染色体应完整无断裂，并已沉降至腔室底部。制备完成后应在一小时内进行离心步骤，以确保灯刷染色体环状结构与载玻片之间的最佳附着。</li>
</ol>
7. 细胞核内容物的离心
<ol>
	<li>将一张滤纸放在盖玻片上，轻轻按压以去除腔室中的过量液体。</li>
	<li>在盖玻片的每侧放置约 1 mm3 的凡士林。用加热至约 70 - 80 oC 的金属棒熔化凡士林，将盖玻片密封到下方的塑料方片上。</li>
	<li>将载玻片放入离心滑座中，确保相对的滑座保持平衡。在 4 oC 下以约 4,800 × g 离心 30 分钟至 1 小时。使用离心机的慢速启动功能。</li>
</ol>
8. 固定细胞核内容物
<ol>
	<li>对于大多数后续操作步骤，使用多聚甲醛固定细胞核内容物。</li>
	<li>将载玻片架放入标准的显微镜载玻片染色缸中，然后将载玻片逐个放入架内。加入足量固定液以浸没载玻片（OR2 或 PBS 中含 2–4% 多聚甲醛）。</li>
	<li>用一对钝头镊子将盖玻片向侧向推动，夹起并丢弃至适当的玻璃废弃物容器中。将载玻片保留在固定液中至少15–30分钟。对于 原位 杂交和大多数抗体染色可允许较长时间的固定（h或d）。</li>
	<li>为去除塑料方块，将载玻片逐个放入盛有冰冻OR2或PBS的染色皿中。将锋利的剃刀刀片插入塑料方块边缘，将其撬起并分离。 
	注意：理想情况下，塑料膜应完整剥离，使所有石蜡保留在载玻片上。石蜡具有重要作用：由于其包围着细胞核内容物附着于载玻片的中央小区域，可起到屏障作用，从而允许使用小体积（5–10 µL）试剂进行免疫染色操作。 等等载玻片可无限期保存于冷的OR2或PBS中。</li>
</ol>
9. LBCs 与细胞核细胞器的免疫染色
<ol>
	<li>从OR2或PBS储存液中取出固定的GV样本，擦去多余液体后置于湿润室内的支撑物上。一个简便的湿润室可使用直径90 × 15 mm的培养皿，内含一张直径90 mm的湿润滤纸。 
	注意：此时细胞核内容物已牢固附着于载玻片上直径为5 mm的无石蜡区域。由于石蜡具有疏水性，可通过移液枪在中心区域边缘添加或移除少量液体（20 µL）来更换溶液。主要注意事项是避免移液枪头接触无石蜡区域。</li>
	<li>使用少量试剂（10–20 µL）进行免疫染色。由于染色体和核内细胞器体积微小，且与添加的试剂直接接触，因此染色步骤可较短，一抗和二抗孵育时间可短至1小时或更短。任何步骤中均不得使用去污剂，以免损伤样本。如需增强多线染色体轴的显示效果，可用 DAPI（1 µg/mL）染色10–20分钟。</li>
	<li>用甘油或适用于免疫荧光的商用封片剂进行封片。为避免封片过程中产生气泡，请按以下步骤操作。
	<ol>
		<li>用20 µL移液器吸取15 µL封片剂。尽可能吸除核展片周围区域的液体 &#34;毛细作用&#34; 用一张滤纸（将直径90 mm的#1滤纸剪成极细的三角形）将其擦去。</li>
		<li>用移液器将大部分封片液滴加到样本上，注意不要触碰核展开区域。将最后约1 µL的封片液置于22 mm盖玻片（厚度#1.5）中央。将盖玻片翻转，对准样本缓慢放下，小心避免产生气泡。</li>
		<li>临时封片（数天内）可使用含1 mg/mL对苯二胺的50%甘油溶液。永久封片，尤其是用于超分辨率成像研究时，应使用低荧光、可硬化至折射率约为1.46的封片介质。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. 荧光 原位 液基细胞（LBC）与细胞核结构的杂交（FISH）
<ol>
	<li>由于FISH实验方案通常需要在较高温度下进行，需从制片中去除石蜡。可用剃刀刀片小心刮除，但该步骤较为繁琐，且可能意外损伤制片。建议使用金刚石笔在载玻片背面标记制片区域。
	<ol>
		<li>或者，用二甲苯溶解石蜡。准备一系列 Coplin 染色缸或染色皿，内含以下试剂：30%、50%、70%、95% 和 100% 乙醇；3 个装有二甲苯的容器；另外 2 个装有 100% 乙醇的容器以及 1 个丙酮容器。</li>
		<li>将载玻片放入载片架中，并依次在乙醇系列中进行脱水，每个浓度中停留3-5分钟（若晃动则时间可缩短）。</li>
		<li>将载玻片依次通过3个二甲苯容器以溶解石蜡，若进行震荡，每个容器约5分钟。再将载玻片依次通过两份100%乙醇以去除二甲苯，最后用丙酮去除乙醇。从丙酮中取出载玻片，倾斜放置使其干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>执行 原位 使用任何标准方案进行杂交。15,16</li>
</ol>
11. 油下GV的分离
<ol>
	<li>用珠宝镊子从 OR2 溶液中夹取一个卵母细胞，尽量减少周围组织的附着。将卵母细胞放置在一小片 #1 滤纸上。多余的 OR2 溶液会转移到滤纸上，使卵母细胞几乎不带液体。夹起&#34;干燥&#34;的卵母细胞，将其置于小培养皿（35 × 10 mm）中的轻质矿物油（石蜡油）液面下。
	<ol>
		<li>用细钨针或镊子的一股尖端，在靠近深色动物极的位置刺一个小孔。用一对镊子夹住卵母细胞（避免接触尖端），轻轻挤压。核膜（GV）将连同表面或多或少的卵黄一起挤出（图 3）。</li>
		<li>用镊子侧面轻轻扫过核膜，尽可能去除卵黄。大多数情况下难以完全清除所有卵黄，但通常少量卵黄不会造成问题。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为观察核膜内容物，可将核膜不同程度地压平。
	<ol>
		<li>从凹面载玻片上取下塑料方块，利用残留的石蜡作为盛放石蜡油的浅凹容器10。用 20 µL 移液器吸取核膜及石蜡油，转移至石蜡区域中央。加盖盖玻片，观察部分压平的核膜内容物。该技术不会损伤灯刷染色体（LBCs）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>或者，将核膜压平至约 10 µm 厚度，以观察核内细胞器。
	<ol>
		<li>用锋利的剃刀切去塑料移液枪头末端最后 1 mm。用枪头吸取核膜及恰好 5 µL 的矿物油。将核膜和全部油液挤出至 22 mm 玻璃盖玻片中央。</li>
		<li>缓慢放下标准的 3&#34; × 1&#34; 玻璃载玻片，直至其刚好接触油滴。油滴和盖玻片将因毛细作用被抬起，油液将扩散至盖玻片边缘。当油滴完全铺展后，油层厚度约为 10 µm。此时灯刷染色体（LBCs）将受损，大核仁会轻微压缩，但大多数较小的核内细胞器仍基本保持其在完整核膜中的原有形态（图 3）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

最初的观察 &#34;活体&#34; 80年前，美国生物学家William Duryee通过手工分离青蛙和蝾螈的卵母细胞生发泡制备了LBCs，19 在相差显微镜和微分干涉差显微镜（DIC）出现之前，在荧光免疫染色和荧光原位杂交（FISH）技术应用之前。为了在单个基因水平上研究染色体结构和转录的细节，需开发出将灯刷染色体（LBCs）固定于玻片、以接近生命状态保存其形态，并在不破坏其基本形态的前提下应用分子技术的方法。几乎每一种实现这些目标的技术都需要根据所研究物种进行一定调整，并在保持自然形态与实现分子表征之间做出权衡。例如，有尾两栖类的卵母细胞核（GVs）和灯刷染色体（LBCs）因其体积巨大，且其核内容物在适宜介质中极易扩散，因而特别易于操作。然而直到最近，人们对这些物种的基因组信息知之甚少，导致难以将丰富的细胞学特征与分子细节相对应。相反，来自其他物种的LBCs则 非洲爪蟾 与有尾两栖动物相比，其体型相当小（图5），但两者的基因组 X. tropicalis 和 X. laevis 已测序且注释较为完善。
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大多数脊椎动物（有袋类和胎盘哺乳动物除外）会产生富含卵黄的大卵。尽管这些卵有时体积巨大，但它们仍是单细胞，且在雌性卵巢内即已达到最终大小。卵巢中的卵称为卵母细胞，每个卵母细胞通常含有一个巨大的细胞核，该细胞核自20世纪早期起被称为胚泡th 世纪时的生发泡，或简称为GV。1 常见实验用蛙类的卵母细胞， Xenopus laevis 和 Xenopus tropicalis，分别达到最大直径1.2 mm和0.8 mm（图1）。这两种蛙类成熟卵母细胞的卵母细胞核（GV）直径为0.3 - 0.4 mm（图2、图3）。蝾螈的卵母细胞和卵母细胞核通常更大。墨西哥钝口螈的完全成熟卵母细胞， 墨西哥钝口螈直径超过2 mm，其中核仁（GV）约为0.5 mm，因此这些细胞核肉眼可见，且可进行多种操作，而这些操作在典型的体细胞核上是无法实现的。
同样引人注目的是生发泡（GV）内染色体的巨大尺寸，这一事实早在20世纪末就已被认识。th 世纪。单个染色体的 Ambystoma 以及其他蝾螈的长度可达1毫米（图4、图5）。那些 非洲爪蟾 明显更小，但长度可达100 µm或以上，因此比大多数生物典型的体细胞染色体要大得多。卵母细胞染色体的一个重要特征是其极强的转录活性，这导致了其最显著的形态学特征之一——数百对侧环结构图5）。每个环包含一个或少数几个正在活跃合成RNA的转录单位。这些环使卵母细胞染色体呈现出模糊的外观，由此得名 &#34;灯刷染色体&#34; 染色体因其表面与早期用于清洁煤油灯灯罩的刷子相似而得名。2
本文的重点是利用分离的卵母细胞核（GV）来研究灯刷染色体（LBCs）以及核内细胞器（核仁、组蛋白基因位点小体和核斑点）。将介绍两种截然不同的技术。第一种是较为常用的技术，即使用钟表匠镊子在生理盐水中分离GV，短暂漂洗以去除附着的卵黄，再用钟表匠镊子去除核膜。将含有LBCs和核内细胞器的胶状内容物沉降到玻璃载玻片或盖玻片上。此类样品可直接通过相差显微镜或微分干涉差（DIC）显微镜进行观察。 alternatively，也可通过离心使LBCs和细胞器牢固附着于载玻片或盖玻片。随后可对这类样品进行核酸和蛋白质的深入分子分析，主要采用免疫荧光和荧光标记方法 原位 荧光原位杂交（FISH）3-7
第二种技术涉及在矿物油中分离生发泡（GV）。8 油分离的细胞核囊泡在数小时内仍保持转录活性，可能适用于需要细胞核内容物尽可能接近生理状态的研究。9,10 因为细胞核的折射率 &#34;汁液&#34; 与LBCs及其他核细胞器的相似度较高（图3），对于油分离的GVs，显微技术可能会面临挑战。
最后，由于其体积较大且易于操作，卵母细胞生发泡（GV）是研究核膜的理想材料。核孔复合体最初就是通过电子显微镜对两栖类动物生发泡膜的研究而首次描述的11，而近期的超分辨率观察也使用了相同的材料12,13。

<table><tbody><tr><td>多聚甲醛（试剂级，结晶状）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>尽管许多实验方案中有相关警示，但浓溶液可在室温下长期保存</td></tr><tr><td>3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-100G</td><td>有时称为 MS-222</td></tr><tr><td>Ethicon RB-1 1/2 圆弧锥形针 3-0 缝合线</td><td>VWR&amp;nbsp;</td><td>95057-000</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast（石蜡）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3558-1KG</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-苯二胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6001</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>杂货店</td><td></td><td>市售Knox明胶即可满足要求</td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Gold Seal 盖玻片&amp;nbsp; 22 x 22 mm #1 1/2（厚度 0.16 - 0.19 mm）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63786-01</td><td>该厚度盖玻片适用于超分辨率显微镜</td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72700-D</td><td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx</td></tr><tr><td>石蜡油（轻质）&amp;nbsp;</td><td>EMD Chemicals</td><td>PX0047-1</td><td>用于在油中分离GVs</td></tr><tr><td>粘附式 &lt;em&gt;in situ&lt;/em&gt; PCR 和杂交腔室（25 &amp;micro;L）</td><td>BioRad</td><td>Frame-Seal Slide Chambers #SLF0201</td><td>http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers</td></tr><tr><td>硅胶隔离器</td><td>Grace-Biolabs</td><td>从产品目录链接中选择</td><td>http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html</td></tr><tr><td>Coplin 染色缸和染色皿</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>从产品目录链接中选择</td><td>http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx</td></tr></tbody></table>

从青蛙和蝾螈活体卵母细胞中分离巨型灯刷染色体

Isolation of Giant Lampbrush Chromosomes from Living Oocytes of Frogs and Salamanders

我们描述了研究蛙类和蝾螈卵母细胞（即未产出的卵）中巨大且具有转录活性的灯刷染色体（LBCs）的方法。单条LBC的长度可达1毫米，位于一个巨大的细胞核内，该细胞核直径本身可达0.5毫米。染色体的巨大尺寸使得通过光学显微镜对活跃基因进行无与伦比的观察成为可能，但同时需要特殊的实验技术来分离细胞核、去除核膜，并将染色体铺展在显微镜载玻片上。卵母细胞核，也称为生发泡（GV），在一种允许核内肌动蛋白部分凝胶化的培养基中被分离，以维持LBC精细结构的完整性。此步骤在解剖显微镜下使用珠宝镊子手工完成。接下来，再次使用珠宝镊子手工去除核膜。随后迅速将核内容物转移至另一种培养基中，该培养基可分散肌动蛋白凝胶，使完整的LBC沉降到显微镜载玻片表面。此时可通过相差显微镜或微分干涉差显微镜观察LBC及其他核内细胞器，但布朗运动的存在会遮蔽更精细的结构细节。为了实现高分辨率显微观察或分子分析，需对整个样品进行离心处理，使脆弱的LBC牢固地附着于载玻片上。随后用多聚甲醛进行短暂固定，继而进行免疫荧光染色或原位杂交。LBC处于转录活跃状态，其巨大的尺寸使得利用共聚焦显微镜或超分辨率显微镜在单个基因水平上开展分子分析成为可能。

要观察巨型灯刷染色体，首先需要从青蛙或蝾螈中分离卵母细胞。 图1 显示从青蛙卵巢中取出后置于缓冲盐溶液中的一组成熟卵母细胞， 非洲爪蟾此类卵母细胞在室温下可保持良好状态数天。随后用珠宝匠镊子在生理盐水溶液中去除卵母细胞的细胞核（或生发泡），图2）或在油中（图3）。通过轻轻压碎在油中分离的细胞核，可用相差显微镜或微分干涉差显微镜（DIC）观察其核内容物。若要观察在盐溶液中分离的细胞核内容物，需先用钟表镊去除核膜，使内容物沉降到载玻片上。随后将样品离心，使染色体牢固附着于载玻片，之后可用抗体对染色体进行染色（图4）或进行处理 原位 杂交。蝾螈的灯刷染色体比青蛙的大得多（图5在这两种情况下，单个转录单元（基因）可被视为从染色体轴侧向伸出的染色质环。
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我们介绍了一种从青蛙和蝾螈活体卵母细胞中分离巨型转录活跃的灯刷染色体的简便技术。我们描述了如何观察这些染色体 &#34;存活的&#34; 通过相差或微分干涉对比观察，并如何固定以进行荧光标记 原位 杂交或免疫荧光染色。

我们描述了研究青蛙卵母细胞（即未产出的卵）中巨大且具有转录活性的灯刷染色体（LBCs）的方法，以及……

本实验的主要目标是从两栖动物卵母细胞中分离出巨大的细胞核（即生发泡），并将灯刷染色体及其他核内细胞器铺展在显微镜载玻片上，用于免疫染色、原位杂交及其他分子生物学技术。该方法有助于解答有关染色体、核仁及其他核内细胞器的基本结构，以及转录、剪接和RNA转运等分子过程的关键问题。该技术的主要优势在于，可通过常规光学显微镜结合免疫荧光、原位杂交及其他分子技术，简便地观察染色体结构和转录活动。演示该实验操作的是来自我实验室的博士后 Zehra Nizami 博士。在配制好所有所需溶液后，组装好由涂布过的载玻片构成的多孔载玻片，其中塑料小室通过石蜡固定在载玻片上，具体方法如文本方案所述。随后收集之前从成年雌性青蛙或蝾螈获取的卵巢组织，并用卵母细胞培养基填充一个小的培养皿。取部分已分离的组织，其中包含约10至20个卵母细胞，放入此培养皿中。接着，挑选一个卵母细胞，使用两把显微镊子剪断将其与卵巢壁相连的 stalk（柄状结构）。待其完全游离后，将该卵母细胞转移至一个新的含有生发泡（germinal vesicle, GV）分离培养基的培养皿中。在低倍镜下找到卵母细胞的动物极，动物极可通过其深色区域进行识别。然后用镊子在动物极附近戳一个较大的孔，轻轻挤出透明的卵母细胞核，即生发泡（GV）。随后，将生发泡从一同被挤出的卵黄中滚开。对于仍紧密附着的卵黄，可通过使用尖端直径略大于生发泡的移液枪头反复吸入和推出生发泡的方式去除。在收集到蛙的生发泡后，应立即将其转移至分散培养基中，以防止核硬化，避免影响后续操作步骤。接下来，使用两把镊子夹住生发泡（GV）顶部附近的核膜，注意不要向下按压。在保持夹持核膜的同时，将两把镊子逐渐分开，此时可预期细胞核内容物会弹出。为收集这些内容物，首先根据文本方案中所述，准备一支带有切口吸头的可调式20微升移液器。然后，从培养皿中吸取5 µL分散液，再吸取5 µL含有GV内容物的溶液。收集完这些内容物后，将其转移至一个装有分散液的凹玻片中。确保玻片中的液体表面呈凸面，以避免在后续步骤中产生气泡。 随后，将一个18毫米的盖玻片置于小孔上方，并将组装好的载玻片放入湿盒中孵育10至60分钟。在此期间，细胞核凝胶会逐渐扩散，使染色体和细胞核内细胞器平铺于玻片表面。从蝾螈卵母细胞中取出细胞核后，将其留在分离介质中。请注意，蝾螈的卵母细胞核（GV）与本实验所用蛙类物种不同，在该溶液中不会过度硬化。使用与蛙类相同的方法，用镊子去除蝾螈 GV 的核膜。接着，用剪口吸头的移液器吸取略呈凝胶状的核内容物，并将该凝胶转移至含有分散溶液的培养皿中。用分散液快速冲洗移液管，然后吸取核凝胶。将凝胶转移至载玻片的凹孔中，加盖盖玻片，使凝胶按前述方法自然分散。随后使用相差显微镜观察核内成分，根据其较大的尺寸以及成对的侧环结构识别灯刷染色体（简称LBCs）。在确认LBCs未破裂后，通过在盖玻

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

从青蛙和蝾螈的卵母细胞活巨Lampbrush染色体的分离

使用宿主转移法对Xenopus oocytes进行受精

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