一种利用Vermamoeba vermiformis从环境样本中快速分离新型福斯托病毒的策略

这种新型分离策略的总体目标是扩大新病毒分离株的数量，以研究该新型病毒家族的泛基因组，并更深入地了解其生态系统及对人类的潜在致病性。该方法能够回答病毒学领域的一些关键问题，有助于全球范围内对巨型病毒尤其是法斯托病毒（Faustoviruses）探查感兴趣的病毒学家。该技术的主要优势在于其在多个步骤上实现了新的改进，例如抗生素与抗真菌剂的混合使用、为阿米巴细胞优化设计的新型饥饿培养基，以及采用流式细胞术实现更快速、更灵敏的裂解检测。根据文本方案采集污染水样后，通过将阿米巴细胞接种至含30毫升蛋白酶肽胨酵母提取物葡萄糖（PYG）培养基的75平方厘米细胞培养瓶中，于28°C培养48小时，以制备宿主细胞V. vermiformis。使用计数载片对阿米巴细胞进行计数，当细胞浓度达到每毫升5×10⁵至10⁶个时，以720×g离心10分钟收集细胞。

吸去上清液，加入30毫升无菌的Page氏阿米巴生理盐水（PAS）重悬阿米巴沉淀。再次洗涤沉淀后，使用30毫升含有抗生素和抗真菌剂的饥饿培养基重悬细胞，使阿米巴浓度约为每毫升10的6次方个。饥饿培养基可使阿米巴保持存活状态，同时避免包囊形成或增殖。

接下来，将200微升阿米巴原虫接种至96孔平底板的各孔中，在30摄氏度下孵育30分钟。然后，在室温下将水样涡旋震荡1分钟，取每份样品25微升接种至阿米巴细胞上，保留两个孔不加样品作为阴性对照。为防止蒸发，将含有初代培养物的培养板放入带有湿敷垫的密封袋中，并将加湿的培养装置连同培养板一起置于30摄氏度的培养箱中。

首次接种后第三天，将原始培养板上的培养物转接至新鲜的含有阿米巴的96孔板上，操作方法如前所述，无需进行显微镜观察。在30°C条件下培养三天。随后，利用该继代培养物，按照前述方法接种第三个培养板，并在相同条件下继续培养两天。

为了检测最终共培养板中的裂解情况，打开流式细胞仪并根据制造商的协议执行清洗和冲洗程序，以降低背景噪音。为进行持续40分钟的完全自动化采集，启动高通量进样器（HTS），根据制造商的协议自动从96孔板中加载样品。按照此处列出的参数设置HTS：样品体积为150 µL，混匀体积为50 µL，混匀速度为180，混匀次数为5次，样品间清洗体积为400 µL，流速为2.5 µL/s，记录事件数为10,000。点击“归位”（home）以使HTS定位板的位置。然后首先检测含有宿主阿米巴细胞的阴性对照孔，以圈定阿米巴细胞群体，并根据其物理特性确定细胞百分比。需确保阿米巴细胞群体均一，同时存在另一个对应碎片和噪音的低信号次级群体。接下来，点击“采集样品”开始设门分析。

然后，使用定义门控的箭头，定位目标变形虫群体。门控至少 10,000 个事件后，点击运行，使 HTS 自动运行整块板。根据前向散射的大小参数和侧向散射的结构参数进行数据采集与分析。更多细节请参见正文。

通过流式细胞术检测到裂解后，用移液器吹打裂解后的共培养物，以重悬剩余的阿米巴细胞。将每个样本50微升移液至载玻片后，立即以800 × g离心10分钟进行细胞离心。

接下来，使用纯甲醇固定载玻片，然后将载玻片置于室温下干燥。固定后，将载玻片浸入ESN溶液中三次，每次四秒，随后将载玻片放入蓝色亚甲蓝溶液中六秒。最后，将载玻片浸入PBS溶液中45秒。

将载玻片在室温下静置干燥，然后进行观察。如需用 DAPI 对新固定的载玻片染色，可将 15 µL DAPI 滴加到干燥的载玻片上。在光学显微镜下以 1000 倍放大倍数观察载玻片，以检测病毒工厂的存在。

进行电子显微镜观察时，将五微升阳性样品滴加到经辉光放电处理的载网上，在室温下孵育约20分钟。小心地将载网干燥，然后加入少量1%钼酸铵溶液，孵育10秒。轻轻去除液滴后，让载网干燥5分钟。接着，将电子显微镜设置为200千电子伏特。将载网置于样品托上，并将样品托插入显微镜中。点击真空概览图标并检查真空状态。然后关闭阀门，设置光斑尺寸为5，放大倍数为25,000，再开始观察。在采集屏幕上找到巨病毒后，使用测量工具对病毒进行测量。

根据文本方案进行分子生物学实验和病毒基因组测序。

该图显示了两种福斯托病毒的检测结果，并与可靠的阴性对照进行了比较。裂解的阴性对照中含有86%的阿米巴种群。相比之下，阳性样本中超过60%的阿米巴发生裂解，且碎片比例最高。

如图所示，ESN 和蓝色偶氮染料对未感染和感染的变形虫细胞的细胞核进行染色，并显示出感染细胞内存在病毒工厂。DAPI 染色也证实了变形虫细胞内存在病毒工厂。在这些图像中，透射电子显微镜揭示了福斯托病毒的存在，其具有典型巨型病毒的形态特征，由缺乏纤毛的二十面体衣壳组成，大小为 200 纳米。

一旦掌握并在共培养后，若操作得当，该裂解检测与病毒表征技术可在一小时内完成。在进行该操作时，重要的是要控制阿米巴的活性，并检查是否存在可能的污染。在完成该操作后，可进一步采用其他方法，如针对巨型病毒的分子生物学技术，以回答更多问题，例如病毒所属的科或基因型。

该技术问世后，为病毒学领域的研究人员探索此类病毒家族、其特定宿主以及潜在致病性铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过扩大样本数量和类型，并选择最佳宿主细胞与培养条件，来轻松分离巨型病毒。请务必注意，操作可能对人类具有致病性的病毒存在极高风险，尤其是处理污水样本时更需谨慎。

因此，在执行该操作时，应始终采取在具备安全条件的BSL-2实验室中进行工作等预防措施。