Name: 用 CaspaseTracker 生物传感器检测 Anastasis体内 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 20 min 16 s
Description: 了解如何使用CaspaseTracker生物传感器在活体果蝇中检测细胞死亡逆转现象。该方法利用Drosophila melanogaster模型，通过荧光标记追踪经历半胱天冬酶激活后恢复存活的细胞，为研究细胞命运调控提供新视角。

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感谢 Darren Obbard 提供图 3C 和视频文稿中的 Drosophila 图像；感谢 J. Marie Hardwick、Wade Gibson 和 Heather M. Lamb 对本文稿的宝贵讨论。本研究得到了 Sir Edward Youde 纪念奖学金（H.L.T.）、Dr. Walter Szeto 纪念奖学金（H.L.T.）、富布赖特资助项目 007-2009（H.L.T.）、生命科学研究基金会博士后奖学金（H.L.T.）以及 NCI K22 资助项目 CA204458（H.L.T.）的支持。Ho Lam Tang 曾是生命科学研究基金会 Shurl 和 Kay Curci 基金会研究员（2014–2017）。

1）制备CaspaseTracker生物传感器果蝇
<ol>
	<li>用CO₂麻醉果蝇2，并使用画笔转移7至10个caspase敏感型Gal4（DQVD）19 处女雌蝇和7至10只G-Trace53 将Gal4报告基因的年轻雄性果蝇（或反之）与果蝇食物和新鲜酵母糊一同放入同一试剂瓶中。 
	注意： Caspase敏感型（DQVD）Gal4果蝇与G-Trace果蝇杂交将产生CaspaseTracker子代果蝇。Caspase-在敏感（DQVA）19 Gal4 和 G-Trace 果蝇将提供阴性对照果蝇（见讨论）。新鲜酵母糊作为蛋白质来源以促进产卵，从而增加子代数量。根据表型挑选处女雌蝇和年轻雄蝇。54.</li>
	<li>在18摄氏度下培养果蝇（oC）在杂交过程中保持3至7天，然后将果蝇转移至新试管中，在18 °C下建立新的杂交。继续在18 °C下培养原始试管，直至子代果蝇羽化。 
	注意： 将亲代果蝇转移至新的培养瓶中，以避免原培养瓶中子代果蝇过度拥挤。亲代果蝇在前2至3次换瓶期间可继续产下子代，并需提供新鲜培养基和酵母糊；此后繁殖能力将随时间显著下降。在18 °C条件下培养果蝇可降低CaspaseTracker生物传感器的非特异性信号（见讨论部分）。</li>
	<li>选择具有正确表型的子代果蝇54 用于后续实验。 
	注意： 此处caspase敏感性Gal4和G-Trace的转基因均位于第二染色体上，并以CyO作为平衡染色体。选择非卷翅（无CyO）的子代个体，其同时携带caspase敏感性Gal4和G-Trace两种转基因。</li>
</ol>
2) 将瞬时细胞死亡诱导应用于CaspaseTracker生物传感器果蝇
<ol>
	<li>将10至20只新羽化的雌蝇转移至装有新鲜果蝇培养基和新鲜酵母糊的新离心管中，在18 °C条件下培养1天，以促进卵室通过卵子发生过程形成。 
	注意：将雌蝇与雄蝇共同培养可能有助于提高卵室的产生。</li>
	<li>为通过冷休克诱导卵室发生凋亡，将雌蝇转移至新的空离心管中，并置于-7 °C环境中处理1小时。 
	注意：冷休克可通过诱导质膜破裂对细胞造成损伤55,56。</li>
	<li>为通过蛋白质饥饿诱导卵室发生凋亡，将雌蝇转移至含有8%蔗糖和1%琼脂培养基的新离心管中，在18 °C条件下培养3天。 
	注意：蛋白质饥饿（无蛋白食物）可触发卵室发生凋亡57,58,59以及自噬60,61。每天将果蝇更换至含有8%蔗糖和1%琼脂培养基的新离心管中，以维持蔗糖培养基的最佳状态。</li>
	<li>将经历应激处理的果蝇重新转移至装有新鲜果蝇培养基和新鲜酵母糊的新离心管中，在18 °C条件下恢复培养3天，以允许其恢复。按照文献所述方法62，解剖饥饿处理及饥饿后恢复的果蝇，获取卵巢中的卵室。 
	注意：为解剖Drosophila以获取卵巢，可使用CO2麻醉果蝇，利用两对镊子去除果蝇头部，并用镊子牵拉腹部基部以取出果蝇的卵巢。</li>
</ol>
3) 用于成像的解剖后卵室固定与染色
<ol>
	<li>将解剖后的卵室连同约 0.5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）一起转移至 1 mL 离心管中，静置使卵室沉降。 
	注意：使用前将塑料移液枪头用含 1% 牛血清白蛋白（BSA）的水或 PBS 溶液包被，以防止卵室黏附在枪头塑料表面。后续操作均需在避光条件下进行，以避免卵室中红色荧光蛋白（RFP，又称 DsRed）和绿色荧光蛋白（GFP）发生光漂白。</li>
	<li>用移液器吸除 PBS，然后加入 0.5 mL 含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液，在室温避光条件下固定卵室 20 至 30 分钟。 
	注意：本步骤及后续所有孵育步骤均需轻柔振荡。</li>
	<li>用移液器吸除多聚甲醛溶液，然后用 0.5 mL PBST（PBS + 0.1% Triton X-100）洗涤卵室 3 次。 
	注意：过度固定可能导致 RFP 和 GFP 信号减弱。</li>
	<li>将卵室置于 PBST 中，在室温孵育 1 至 2 小时&#160;，或在 4 °C 过夜，同时轻柔振荡，以实现卵室的通透化。 
	注意：PBST 还可防止卵室黏附于未用 BSA 包被的塑料表面。</li>
	<li>用移液器吸除 PBST，然后向卵室中加入 0.5 mL 含 10 μg/mL 蓝色核染料 Hoechst 的 PBST 溶液，在室温下孵育 1 至 2 小时&#160;，以标记细胞核。 
	注意1：避免核染料孵育时间过长，以免增加非特异性信号。 
	注意2：若不使用 Hoechst 染核，可选用替代方法：加入 200 μL 含 DAPI 的抗光漂白封片剂（见材料），并在封片前按第 3.8 步骤所述，于 4 °C 过夜孵育63。 
	注意3：染色及后续操作均需在避光条件下进行，以防光漂白。</li>
	<li>用移液器吸除核染料，然后在 1 mL 离心管中用 0.5 mL PBST 洗涤卵室 3 次，每次洗涤之间在轻柔振荡条件下孵育 10 至 20 分钟&#160;。</li>
	<li>用精细移液器彻底吸除 PBST，然后加入 200 μL 抗光漂白封片剂（见材料），在室温孵育 3 小时&#160;，或在 4 °C 过夜，直至卵室完全沉降至管底。 
	注意：组织完全吸收封片剂后会沉降至管底。</li>
	<li>用移液器将染色后的卵室连同 200 μL 抗光漂白封片剂转移至预先清洁的载玻片上进行成像，用 20 × 20 mm 预先清洁的盖玻片覆盖卵室，并在盖玻片边缘涂抹指甲油以密封盖玻片与载玻片。 
	注意1：使用前需用清水或 70% 乙醇清洁载玻片和盖玻片。 
	注意2：可在载玻片与盖玻片之间涂抹少量凡士林，以防止因过度压紧而破坏卵室结构。</li>
	<li>使用荧光显微镜或共聚焦显微镜对卵室进行成像，选用 20×、NA 0.8 的 Plan-Apochromat 物镜，激发波长分别为：405 nm 用于核染色（检测发射波长约 461 nm），561 nm 用于 RFP 信号（反映正在进行或近期发生的半胱天冬酶活性，检测发射波长约 590 nm），488 nm 用于 GFP 信号（反映既往半胱天冬酶活性，检测发射波长约 518 nm）。 
	注意：显微成像相关详细步骤可参见我们已发表的实验方案20,64。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

CaspaseTracker 双生物传感器系统是一种新颖且独特的工具，可用于检测近期或正在进行的半胱天冬酶（caspase）活性，并追踪那些在经历caspase活性后逆转细胞死亡过程并存活下来的细胞 in vivo。尽管传统上caspase活性一直被视为细胞凋亡的标志，但越来越多的研究表明，非凋亡性caspase活性在多种正常细胞功能中发挥潜在作用，例如调控神经元活动79,80、学习与记忆81,82,83,84、抑制坏死性凋亡（necroptosis）85,86、精子细...

程序性细胞死亡（如凋亡）通过清除多细胞生物体中不需要的、受损的或危险的细胞，在胚胎发育和正常稳态中发挥着至关重要的作用1,2,3。细胞死亡与存活之间的平衡一旦丧失，可能导致癌症、心力衰竭、自身免疫和退行性疾病等致命后果4,5,6,7,8。传统上，效应半胱天冬酶（caspase）的激活被认为是凋亡过程中“不可逆转的临界点”9,10,11，因为它会触发迅速而广泛的细胞解体12,13,14,15,16。然而，我们发现培养中的濒死原代细胞和癌细胞不仅可在caspase激活后恢复，甚至在出现一系列关键的细胞死亡标志性事件（包括质膜出泡、细胞皱缩、线粒体断裂、线粒体细胞色素c释放至胞质、细胞核和染色质浓缩、DNA损伤、核碎裂、磷脂酰丝氨酸（PS）在细胞表面暴露以及凋亡小体形成）之后仍可恢复生命活动17,18,19,20,21，这一发现挑战了上述普遍观点。我们提出，anastasis是一种内在的细胞恢复现象，因为濒死细胞在去除死亡刺激后能够恢复17,18,19,20,21。我们将这一出乎意料的细胞恢复现象命名为“anastasis”（Αναστάσης）18，该词在希腊语中意为“起死回生”。我们对anastasis现象的观察也得到了近期其他独立研究的支持，这些研究同样揭示了细胞在磷脂酰丝氨酸外翻22,23,24、有限的线粒体外膜通透化25&#160;、混合谱系激酶样蛋白（MLKL）激活以及细胞皱缩26之后仍可恢复的现象。
阐明调控回生过程的机制将对生理学、病理学和治疗学产生范式转变性的影响。回生可能代表一种此前未知的细胞保护机制，可用于挽救或保存难以替代的重要终末分化细胞和组织，并可能解释通过左心室辅助装置（LVAD）减轻心室负荷而实现的心力衰竭逆转27,28、光感受器细胞在短暂暴露于过强光照后的恢复29,30,31，以及脑损伤后神经元的修复32。若确实如此，促进回生过程可增强细胞和组织的恢复能力。相反地，回生也可能是癌细胞在诱导细胞死亡的治疗过程中意外采用的一种逃逸策略，从而导致癌症复发17,18。因此，在癌症治疗期间及之后抑制濒死癌细胞的回生过程，可能是一种通过防止癌症复发来实现治愈的新型治疗策略。
在复生过程中，我们发现一些恢复的细胞获得了永久性的遗传改变，并发生了癌变转化，这可能是由于细胞在凋亡过程中遭受了DNA损伤18,20,21。逆转DNA受损细胞的死亡过程可能是一种肿瘤发生机制，这或许可以解释为何多种组织中反复发生的组织损伤会增加癌症风险，例如因饮用过热饮料导致食管慢性热损伤33,34,35、酒精性肝损伤36,37、基因毒性癌症治疗后的肿瘤演化38,39,40，以及在抗癌治疗周期间歇期从正常组织发展出的新发癌症41,42,43,44。如果这一机制成立，靶向干预复生过程可能有助于预防或阻止癌症的发生与发展。我们发现，在重新喂食的果蝇（Drosophila）中，饥饿诱导的生殖细胞死亡可发生复生19&#160;。如果DNA受损的生殖细胞也能发生复生，则可能解释长期环境压力促进遗传性疾病发生的现象。例如，饥荒可导致糖尿病和冠心病等跨代可遗传疾病的发生45。因此，深入理解复生机制有望为预防此类潜在机制引发的可遗传疾病提供新的策略。
为了利用细胞复苏（anastasis）的发现并推动创新疗法的开发，研究活体动物中细胞复苏的原因及其后果至关重要。然而，在技术上难以识别和追踪发生细胞复苏的细胞 体内因为从细胞死亡过程中恢复的细胞在形态上与正常的健康细胞无异，且目前尚未发现细胞复生的生物标志物17,18,21为了解决这些问题，我们近期开发了一种新方法 体内 指定为“CaspaseTracker”的半胱天冬酶生物传感器19，以鉴定并追踪在半胱天冬酶（caspase）激活后存活并逃逸凋亡的细胞19,46细胞凋亡的特征10,14区别于SCAT等“实时”半胱天冬酶生物传感器12,47Apoliner48, CA-GFP49，ApoAlert18,50C3AIs51 和 iCasper52 能够检测持续的半胱天冬酶（caspase）活性，CaspaseTracker 生物传感器还具备永久标记表达过（即使为短暂表达）半胱天冬酶活性细胞的能力。因此，CaspaseTracker 生物传感器可在半胱天冬酶介导的细胞死亡过程逆转后，实现对细胞回生（anastasis）的长期追踪 体内.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;耗材与试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 封片剂</td><td>Vector Products</td><td>H-1000</td><td>抗荧光淬灭封片剂</td></tr><tr><td>Vectashield 封片剂（含 DAPI）</td><td>Vector Products</td><td>H-1200</td><td>含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Ted Pella</td><td>#505 (110mm, #5)</td><td>Dumont 生物级不锈钢镊子</td></tr><tr><td>悬滴载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565B</td><td>玻璃载玻片</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Molecular Probes</td><td>H1399</td><td>DNA 染料</td></tr><tr><td>Mitotracker Red CMXRos&amp;nbsp;</td><td>Molecular Probes</td><td>M-7512</td><td>线粒体染料</td></tr><tr><td>裂解型半胱天冬酶-3（Asp175）抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#9661</td><td>用于标记半胱天冬酶-3 活性片段的染色剂</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806</td><td>免疫染色封闭剂</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>114-056-101</td><td>洗涤和免疫染色用缓冲液</td></tr><tr><td>Triton&amp;trade; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>用于细胞通透的去垢剂</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM780 共聚焦显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>成像</td></tr><tr><td>Carl Zeiss 体视显微镜 Stemi 2000&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>N/A</td><td>果蝇解剖</td></tr><tr><td>AmScope 光纤双蛇形颈显微镜照明器，150W</td><td>AmScope</td><td>WBM99316&amp;nbsp;</td><td>光源</td></tr></tbody></table>

检测细胞复苏 在体 内 通过caspasetracker生物传感器

Detecting Anastasis In Vivo by CaspaseTracker Biosensor

Anastasis（希腊语意为“复活”）是一种新近发现的细胞恢复现象，指濒死细胞能够逆转通常被认为本质上不可逆的晚期细胞死亡过程。理论上，促进anastasis可能挽救或保护难以替代的受损细胞，如心肌细胞或神经元，从而促进组织修复。相反，在抗癌治疗后经历凋亡的癌细胞中抑制anastasis，可能确保癌细胞彻底死亡，并降低复发风险。然而，由于缺乏在活体动物中追踪经历anastasis细胞命运的工具，相关研究一直受到阻碍。主要挑战在于识别那些虽已逆转细胞死亡过程、但在恢复后形态上已恢复正常表型的细胞。为克服这一难题，我们已开发出 黑腹果蝇 以及能够识别并永久追踪复苏细胞的哺乳动物CaspaseTracker生物传感器系统 体外 或 体内在此，我们介绍 体内 用于生成和使用CaspaseTracker双生物传感器系统以检测和追踪anastasis的方案 黑腹果蝇 在短暂暴露于细胞死亡刺激后。传统的生物传感器和实验方案仅能标记正在经历凋亡性细胞死亡的细胞，而CaspaseTracker生物传感器则能够永久性地标记那些在caspase激活后恢复存活的细胞——caspase激活是晚期凋亡的标志性事件，同时还能识别正在进行的活性凋亡过程。该生物传感器还可追踪那些曾尝试其他形式细胞死亡且该过程直接或间接涉及caspase活性的细胞的恢复情况。因此，本实验方案使我们能够持续追踪这些细胞及其子代的命运，有助于未来对anastasis（凋亡逆转）的生物学功能、分子机制、生理与病理后果以及治疗意义开展深入研究。我们还讨论了适当的对照设置，以区分经历anastasis的细胞与表现出非凋亡性caspase活性的细胞。 体内.

虽然延时活细胞显微镜技术是追踪培养细胞中细胞复苏过程的一种可靠方法20，很难识别动物体内哪些细胞经历了复苏，因为恢复后的细胞在形态上与未经历细胞死亡的正常健康细胞无法区分。例如，人宫颈癌HeLa细胞会表现出细胞凋亡的形态学特征1,2,14细胞皱缩、细胞核凝聚以及质膜起泡等对细胞死亡刺激的响应 1µM staurosporine17 (图1A, 图1B i-ii）。在去除细胞死亡刺激因素并换用新鲜培养基培养后，濒死细胞可通过anastasis逆转细胞死亡过程17,18，如形态...

检测细胞回生现象在技术上具有挑战性 体内 因为经历细胞死亡逆转过程的细胞在形态上可能与正常的健康细胞难以区分。本文介绍了利用我们新开发的方法在活体动物中检测和追踪发生anastasis细胞的实验方案。 体内 CaspaseTracker 生物传感器系统

检测细胞复苏 在体 内 通过CaspaseTracker生物传感器

Anastasis（希腊语“起死回生”）是一种新近发现的细胞恢复现象，指濒死细胞能够逆转晚期细胞死亡过程……

本实验的总体目标是利用黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）作为模式生物，在活体动物中检测并追踪细胞在caspase激活后发生细胞死亡过程的逆转。在死亡刺激作用下，细胞会经历程序性细胞死亡（如凋亡），传统上认为这一过程是一个不可逆的级联反应，最终导致细胞死亡。然而有趣的是，在死亡刺激被移除后，部分即将死亡的细胞即使处于晚期阶段，仍可逆转细胞死亡过程。通过一种新发现的细胞恢复现象——anastasis（复生）。活细胞显微镜观察显示，发生凋亡的濒死细胞表现出独特的形态学特征，例如质膜起泡、细胞核凝聚以及细胞皱缩。通常情况下，这些细胞被认为将走向死亡。然而，在用新鲜培养基洗涤并孵育这些濒死细胞后，它们会经历细胞死亡逆转（anastasis），恢复活力，并可在之后进行分裂。由于恢复后的细胞在形态上可能与周围健康细胞难以区分，因此在活体动物中检测和追踪细胞死亡逆转过程十分困难。为解决这一问题，研究人员开发了哺乳动物CaspaseTracker生物传感器系统，用于识别和追踪那些在细胞凋亡执行阶段或caspase激活后逆转细胞死亡过程的细胞。该生物传感器系统由两个组分构成：caspase 可激活的转录激活因子 rtTA，以及基于 Cre LoxP 的 rtTA 活性报告系统。在健康的细胞中，由于没有 caspase 活性，rtTA 通过可被 caspase 切割的 DEVD 连接子与细胞质膜锚定结构相连。由于锚定状态的 rtTA 无法从细胞质转位至细胞核，因此 rtTA 报告系统保持非活性状态。然而，当细胞发生凋亡诱导而被激活时，caspase会切割DEVD连接子，释放rtTA进入细胞核，从而激活rtTA报告系统。一旦进入细胞核，rtTA便会结合四环素反应元件（TRE），并触发Cre重组酶的瞬时表达，导致发生不可逆的重组事件，移除CAG启动子与红色荧光蛋白DsRed编码序列之间的终止密码子盒。由此实现DsRed的永久性表达，作为曾经历caspase活性但仍存活下来的细胞及其子代细胞的永久性荧光标记。活细胞共聚焦显微镜显示，在短暂诱导细胞死亡后，CaspaseTracker 生物传感器细胞在其恢复期间及恢复后表达 DsRed，从而可将它们与未恢复的细胞（以白色箭头指示）以及未暴露于细胞死亡刺激的对照生物传感器细胞区分开来。程序性细胞死亡（如凋亡）通常被认为不可逆，因其由广泛而剧烈的细胞破坏所执行。然而，我们发现，即使在以往被认为不可逆转的晚期阶段——例如细胞色素 c 释放、caspase-3 激活、DNA 损伤、质膜出泡、细胞皱缩以及凋亡小体形成之后——濒死细胞仍能实际恢复。我们将这种细胞死亡过程的逆转称为“anastasis”，在希腊语中意为“起死回生”。通过使用活细胞显微镜技术，我们可以在培养的细胞中观察到anastasis现象。然而，在活体动物中观察anastasis在技术上具有挑战性，因为恢复存活的死亡细胞可能看起来与从未启动过细胞死亡的正常健康细胞无异。因此，我们开发了一种CaspaseTracker生物传感器系统，用于在活体动物中检测和追踪回生现象。果蝇版的CaspaseTracker系统是一种双组分生物传感器，包含两个部分：可被半胱天冬酶（caspase）激活的转录因子GAL4，以及GAL4活性报告系统G-TRACE。在无半胱天冬酶活性的细胞中，酵母转录因子GAL4通过一个可被半胱天冬酶切割的DQVD连接序列与质膜锚定结构域相连。当caspase被激活后，活化的caspase会切割DQVD连接序列，释放GAL4，随后GAL4转位至细胞核，激活G-TRACE报告系统。核内的GAL4结合特定的上游激活序列（简称UAS），从而触发RFP的瞬时表达；RFP作为报告分子，可指示近期或当前的caspase活性，直至caspase和GAL4的活性停止，且RFP蛋白被降解。GAL4同时也会启动FLP重组酶的表达，进而引发重组事件，移除泛素（简称Ubi）启动子与编码核定位GFP序列之间的终止盒。这会导致细胞核内GFP的永久性表达，从而作为曾经经历caspase活性但仍然存活的细胞及其子代的永久标记。因此，该系统可通过短暂的RFP信号识别正在发生或近期发生caspase活性的细胞，而通过永久性的GFP信号识别过去发生过caspase活性的细胞。作为对照的生物传感器在caspase切割位点含有DQVA突变，对该酶活性不敏感。将Caspase敏感的GAL4雌蝇与G-TRACE雄蝇杂交，或反交，以产生CaspaseTracker果蝇。为检测caspase激活后细胞死亡过程的可逆性，首先使果蝇暴露于短暂的、可诱导细胞死亡的环境应激条件下，例如低温休克或蛋白质饥饿。随后将经历应激的果蝇转移回正常培养条件下进行恢复。从对照组、应激组或恢复组果蝇的卵巢卵室中获取组织。将样品进行共聚焦显微镜检测，以观察CaspaseTracker生物传感器的荧光信号。首先，使用二氧化碳麻醉新羽化的对caspase敏感的DQVD GAL4果蝇，并用画笔将7至10只处女雌蝇转移至含有少量酵母糊的新鲜培养管中。将雌蝇与7至10只年轻的G-TRACE GAL4报告基因雄蝇交配。新羽化的处女蝇表现出深绿色的胎粪（如箭头所示），这是幼虫食物的残留物。新羽化的果蝇体型通常比成熟果蝇更大。雄性腹部颜色较深，以圆圈标示，且体型通常小于雌性。将杂交实验设置在18摄氏度条件下，以减少子代中CaspaseTracker生物传感器的非特异性信号，因为GAL4活性随温度升高而增强。每三至七天，将成虫转移至含有酵母糊的新试管中，直至其繁殖能力下降。当子代羽化后，将携带caspase敏感型GAL4和G-TRACE两种转基因的果蝇进行交配，这些果蝇将作为CaspaseTracker子代果蝇。两种插入均以Curly-O进行平衡，因此非Curly翅的果蝇将同时携带这两种转基因。作为阴性对照，将对caspase不敏感的DQVA GAL4雌性与G-TRACE GAL4报告基因雄性杂交，或反交，收集双转基因子代。从实验杂交组中，将10至20只新羽化的雌蝇群体转移至含有酵母糊的新试管中。添加少量雄蝇有助于促进雌蝇产卵。将充分喂养的果蝇转移至18摄氏度环境中培养一天，使其卵巢通过卵子发生过程产生卵室。随后为诱导其卵室发生凋亡，采用冷休克处理：将果蝇转移至无食物的新试管中，并在7摄氏度下冷冻一小时。诱导卵室凋亡的另一种方法是通过蛋白质饥饿处理，即将果蝇饲养在含8%蔗糖和1%琼脂的食物中，置于18°C环境下持续三天。采用此方法时，需每日更换无蛋白质食物的培养瓶。无论采用上述哪种方法对果蝇进行胁迫处理后，均需将其恢复至正常饲养条件，并提供含酵母膏的食物，持续三天以使其恢复。随后解剖这些果蝇以分离其卵室和卵巢。在麻醉后，使用两对镊子去除果蝇头部，然后从腹部基部牵拉果蝇以取出卵巢。通过将塑料移液器吸头浸入含有1% BSA（溶于水或PBS）的溶液中进行包被，以防止卵室粘附在移液器吸头上，从而为收集卵巢做好准备。解剖卵室后，将其收集至预先处理过的吸头中，并加入约0.5 mL PBS。随后转移至1 mL离心管中，使卵子自然沉降。继续在低光照或完全黑暗的条件下进行操作，以防止荧光标签发生光漂白。吸除 PBS，向离心管中加入 500 微升含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液。将卵在室温下轻轻旋转固定 20 至 30 分钟。避免长时间固定，以免耗尽卵室中荧光蛋白的信号。固定完成后，去除多聚甲醛（PFA），并用500 µL PBS-T洗涤卵室三次。随后将卵室置于PBS-T中，在4°C下轻轻旋转孵育过夜，以实现卵室的通透化处理。第二天早晨，向卵室中加入500 µL含5 µg蓝色核染料（如Hoechst）的PBS-T溶液。在室温下轻轻旋转孵育1至2小时，但不可超过此时间，否则信号将变得非特异性。随后，用PBS-T洗涤卵室3次，每次10分钟。然后，使用精细的移液器吸除所有 PBS-T，加入 200 µL 抗荧光淬灭封片剂。组织在完全吸收封片剂之前会漂浮在液面。将卵室置于 4 °C 的封片剂中孵育三小时至过夜。完全吸收封片剂后，组织会沉入管底，即可进行封片。开始操作时，在载玻片或盖玻片上涂抹凡士林，以防止因过度压紧而破坏卵室结构。将染色后的卵室连同200 µL封片剂转移至载玻片上，并用20 mm²的玻璃盖玻片覆盖。用指甲油封固盖玻片，随后进行共聚焦显微镜观察。在健康CaspaseTracker果蝇卵巢的卵室中，未观察到CaspaseTracker生物传感器活性，表现为无绿色和红色荧光信号。然而，在果蝇经历可诱导细胞死亡的环境应激（如蛋白质饥饿处理三天）后，卵室发生细胞死亡过程，伴随caspase激活，从而诱导RFP和GFP生物传感器信号的出现。相比之下，在对照组中，对caspase无敏感性的DQVA果蝇其caspase切割位点发生突变，导致生物传感器的敏感性消失，表明该生物传感器信号依赖于caspase活性。随后，将饥饿处理的caspase敏感型生物传感器果蝇恢复喂养蛋白质食物三天。恢复后的果蝇卵室未表达RFP瞬时caspase报告基因，表明近期无caspase活性发生或持续存在。重要的是，回收的卵室仅表达GFP，表明它们在caspase激活后逆转了细胞死亡过程。在短暂的诱导细胞死亡的温度应激后，体内也可观察到anastasis现象。在冷休克刺激下，正在死亡的卵室表达RFP和GFP生物传感器标记物，其中RFP信号代表近期或正在进行的caspase活性，而GFP信号则代表既往的caspase活性。然而，在恢复至正常培养条件以解除胁迫三天后，恢复组果蝇的卵室中仅显示 GFP 半胱天冬酶报告信号，表明这些卵室中的细胞在半胱天冬酶激活后的某个时间点发生了回生（anastasis）。值得注意的是，GFP CaspaseTracker 信号显示，卵室内的多种细胞类型均能够逆转细胞死亡过程，并修复由半胱天冬酶造成的损伤，包括生殖系细胞（如卵母细胞和滋养细胞）以及体性滤泡细胞。有趣的是，GFP 还标记了生殖囊（germarium）中的细胞（包含干细胞），以及同一卵巢链中与其相连的卵室细胞。因此，这些GFP阳性的卵室可能来源于经历了复生（anastasis）的干细胞。以下是显示未暴露于环境胁迫条件下 CaspaseTracker 生物传感器活性的组织图像。这些组织来自一只解剖后的新生羽化雌蝇（0日龄），包括口器、前肠、嗉囊、中肠、后肠、马尔皮基安小管、肛门、输卵管和卵巢。共聚焦显微镜显示了由RFP指示的近期caspase活性以及由GFP指示的既往caspase活性。放大图像显示了在视叶、贲门、马尔皮基小管、后肠以及与F-actin染色共定位的卵室肌壁上的近期或持续性及既往caspase活性。某些组织（如输卵管）仅显示既往caspase活性。这些生物传感器活性表明在胚胎发育或正常稳态过程中可能存在麻醉活性。也可能提示当前或既往存在非凋亡性半胱天冬酶（caspase）活性。详情请参见原文手稿。体内 CaspaseTracker 生物传感器可特异性报告半胱天冬酶（caspase）活性，而对半胱天冬酶不敏感的 CaspaseTracker（含有不可被半胱天冬酶切割的序列 DQVA）则无生物传感器信号。此处唯一的信号来自色素、表皮和脂肪体的自发荧光所产生的非特异性信号。观看本视频后，您应能够基本了解如何利用 CaspaseTracker 生物传感器系统在活体动物中检测和追踪细胞回生（anastasis）过程。这些生物传感器有助于研究细胞回生（anastasis）的过程及其已知功能。它们的检测范围在生理学、病理学和治疗学领域具有广泛的应用。这些生物传感器不仅能够在半胱天冬酶（caspase）激活后检测到细胞凋亡的逆转，还能检测细胞在尝试其他直接或间接涉及半胱天冬酶活性的细胞死亡形式后是否恢复。在设计实验时，必须设置相互对照，以区分追踪麻醉细胞的荧光生物传感器信号与正在进行半胱天冬酶（caspase）活性的凋亡细胞。还需注意具有已知当前或既往凋亡相关半胱天冬酶活性的健康细胞，以及来自色素、脂肪等的非特异性自发荧光信号，这些因素均至关重要。有关详细讨论，请参见本文手稿的 PDF 版本。

detecting-anastasis-in-vivo-by-caspasetracker-biosensor

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Medicine

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