检测细胞复苏 体内 通过CaspaseTracker生物传感器

本实验的总体目标是利用黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）作为模式生物，在活体动物中检测并追踪细胞在半胱天冬酶（caspase）激活后发生细胞死亡过程的逆转。在死亡刺激作用下，细胞会经历程序性细胞死亡（如凋亡），传统上认为这一过程是一个不可逆的级联反应，最终导致细胞死亡。然而有趣的是，在死亡刺激被移除后，部分濒死细胞即使处于晚期阶段，仍可逆转细胞死亡过程。

通过一种新发现的细胞恢复现象——anastasis（复生）。活细胞显微镜观察显示，发生凋亡的濒死细胞表现出独特的形态学特征，例如质膜起泡、细胞核凝聚和细胞收缩。通常情况下，这些细胞被认为将走向死亡。

然而，在用新鲜培养基洗涤并孵育这些濒死细胞后，它们会经历复生（anastasis）过程，恢复活力，并可在之后进行分裂。由于复生后的细胞在形态上可能与周围健康细胞难以区分，因此在活体动物中检测和追踪复生现象十分困难。为解决这一问题，研究人员开发了哺乳动物CaspaseTracker生物传感器系统，用于识别并追踪那些在执行阶段或caspase激活（细胞凋亡的标志性事件）后逆转细胞死亡过程的细胞。

该生物传感器系统由两个组分构成：caspase 可激活的转录激活因子 rtTA，以及基于 Cre LoxP 的 rtTA 活性报告系统。在健康的细胞中，由于没有 caspase 活性，rtTA 通过可被 caspase 切割的 DEVD 连接子与细胞质膜锚定结构相连。由于锚定状态的 rtTA 无法从细胞质转位至细胞核，因此 rtTA 报告系统保持非活性状态。

然而，当细胞死亡被诱导而激活时，caspase会切割DEVD连接子，释放rtTA进入细胞核，从而激活rtTA报告系统。一旦进入细胞核，rtTA便会结合四环素反应元件（TRE），并触发Cre重组酶的瞬时表达，导致发生不可逆的重组事件，移除CAG启动子与红色荧光蛋白DsRed编码序列之间的终止密码子盒。这使得DsRed得以永久性表达，作为曾经历caspase活性但仍存活下来的细胞及其子代细胞的永久性荧光标记。

活细胞共聚焦显微镜显示，在短暂诱导细胞死亡后，CaspaseTracker 生物传感器细胞在其恢复期间及恢复后表达 DsRed，从而可将这些细胞与未恢复的细胞（以白色箭头指示）以及未暴露于细胞死亡刺激的对照生物传感器细胞区分开来。程序性细胞死亡（如凋亡）通常被认为不可逆，因其由剧烈且广泛的细胞破坏所执行。然而，我们发现，即使在以往被认为不可逆的晚期阶段（例如细胞色素 c 释放、caspase-3 激活、DNA 损伤、质膜出泡、细胞皱缩以及凋亡小体形成之后），濒死细胞实际上仍可恢复。

我们将这种细胞死亡过程的逆转称为 anastasis，该词在希腊语中意为“起死回生”。通过使用活细胞显微镜技术，我们可以在培养的细胞中观察到 anastasis 现象。然而，在活体动物中观察 anastasis 在技术上具有挑战性，因为恢复存活的死亡细胞可能与从未发生过细胞死亡的正常健康细胞无异。

因此，我们开发了一种CaspaseTracker生物传感器系统，用于在活体动物中检测和追踪回生现象。果蝇版的CaspaseTracker系统是一种双组分生物传感器，包含两个部分：一种可被caspase激活的转录因子GAL4，以及GAL4活性报告系统G-TRACE。在无caspase活性的细胞中，酵母转录因子GAL4通过一个可被caspase切割的DQVD连接子与质膜锚定结构域相连。

当caspase被激活后，活化的caspase会切割DQVD连接序列，释放GAL4，随后GAL4转位至细胞核，激活G-TRACE报告系统。核内的GAL4结合特定的上游激活序列（简称UAS），从而触发RFP的瞬时表达；RFP作为报告分子，可指示近期或当前的caspase活性，直至caspase和GAL4的活性停止，且RFP蛋白被降解。同时，GAL4还会启动FLP重组酶的表达，导致重组事件发生，移除泛素（简称Ubi）启动子与编码核定位GFP序列之间的终止盒。

这会导致核内GFP的永久性表达，从而作为曾经经历caspase活性但仍然存活的细胞及其子代的永久标记。因此，该系统可通过短暂的RFP信号识别正在发生或近期发生caspase活性的细胞，而通过永久性的GFP信号识别过去发生过caspase活性的细胞。一种对照型生物传感器在caspase切割位点含有DQVA突变，对该酶活性不敏感。

将Caspase敏感的GAL4雌蝇与G-TRACE雄蝇杂交，或反交，以产生CaspaseTracker果蝇。为检测caspase激活后细胞死亡过程的可逆性，首先使果蝇暴露于短暂的、可诱导细胞死亡的环境应激（如冷休克或蛋白质饥饿）中。随后将经历应激的果蝇转移回正常培养条件下进行恢复。

从对照组、应激组或恢复组果蝇的卵巢卵室中获取组织样本。随后对样本进行共聚焦显微镜检测，以观察CaspaseTracker生物传感器的荧光信号。实验开始时，使用二氧化碳麻醉新羽化的对caspase敏感的DQVD GAL4果蝇，并用画笔将7至10只处女雌蝇转移至含有少量酵母糊的新鲜培养管中。

将雌蝇与7至10只年轻的G-TRACE GAL4报告基因雄蝇交配。新羽化的处女蝇表现出深绿色的胎粪（如箭头所示），这是幼虫食物的残留物。新羽化的果蝇体型通常比成熟果蝇更大。

雄性个体腹部颜色较深，以圆圈标示，且体型通常小于雌性。将杂交实验设置在18摄氏度条件下，以减少子代中CaspaseTracker生物传感器的非特异性信号，因为GAL4活性随温度升高而增强。每三至七天，将成虫转移至含有酵母糊的新试管中，直至其繁殖能力下降。

当子代羽化后，收集同时携带caspase敏感型GAL4和G-TRACE两种转基因的果蝇，这些果蝇将作为CaspaseTracker子代果蝇。两种插入均以Curly-O进行平衡，因此非Curly翅型的果蝇将同时携带这两种转基因。

作为阴性对照，将对caspase不敏感的DQVA GAL4雌性与G-TRACE GAL4报告基因雄性杂交，或反交，收集双转基因子代。从实验杂交组中，将10至20只新羽化的雌蝇群体转移至含有酵母糊的新试管中。添加少量雄蝇有助于促进雌蝇产卵。

将充分喂养的果蝇转移至18摄氏度环境中培养一天，使其卵巢通过卵子发生过程产生卵室。随后通过冷休克诱导其卵室发生凋亡。将果蝇转移至不含食物的新试管中，并在7摄氏度下冷冻一小时。

诱导卵室凋亡的另一种方法是通过蛋白质饥饿处理，即将果蝇饲养在含8%蔗糖和1%琼脂的食物中，置于18°C环境下持续三天。采用此方法时，需每天更换无蛋白质食物的培养瓶。无论采用上述哪种方法对果蝇进行胁迫处理后，均需将其恢复至正常饲养条件，并提供含酵母膏的食物，持续三天以使其恢复。

随后解剖这些果蝇以分离其卵室和卵巢。先将果蝇麻醉，然后使用两对镊子去除其头部。接着在腹部基部牵拉果蝇以取出卵巢。

通过将塑料移液器吸头浸入含有1% BSA（溶于水或PBS）的溶液中进行包被，以防止卵室粘附在吸头上，从而为收集卵巢做好准备。解剖卵室后，将其收集到预先处理过的吸头中，吸头内含约0.5 mL PBS。随后将卵室转移至1 mL离心管中，静置使卵沉降。

在低光照或完全避光条件下继续操作，以防止荧光标签发生光漂白。吸除 PBS，向离心管中加入 500 微升含 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液。将卵在室温下轻轻旋转固定 20 至 30 分钟。

避免长时间固定，否则会耗尽卵室中荧光蛋白的信号。固定完成后，去除多聚甲醛（PFA），并用500 µL PBS-T洗涤卵室三次。随后将卵室置于PBS-T中，在4°C下轻轻旋转孵育过夜，以实现卵室的通透化处理。

次日早晨，向卵室中加入500 µL含5 µg蓝色核染料（如Hoechst）的PBS-T溶液。室温下轻柔旋转孵育1至2小时，不可超过此时间，否则信号将出现非特异性。随后，用PBS-T洗涤卵室3次，每次洗涤10分钟。

然后，使用精细的移液器吸除所有 PBS-T，并加入 200 微升抗荧光淬灭封片剂。组织在完全吸收封片剂之前会漂浮在液滴表面。将卵室置于 4 摄氏度的封片剂中孵育三小时至过夜。

完全吸收封片剂后，组织会沉入管底，即可进行封片。开始操作时，在载玻片或盖玻片上涂抹凡士林，以防止卵室因过度压紧而受损。将染色后的卵室用200 µL封片剂转移至载玻片上，并用20 mm²的玻璃盖玻片覆盖。

用指甲油封固盖玻片，随后进行共聚焦显微镜观察。在健康CaspaseTracker果蝇卵巢的卵室中，未观察到CaspaseTracker生物传感器活性，表现为无绿色和红色荧光信号。然而，在果蝇经历可诱导细胞死亡的环境应激（如蛋白质饥饿处理三天）后，卵室发生细胞死亡过程，伴随caspase激活，从而诱导RFP和GFP生物传感器信号的出现。

相比之下，在对照组中，对caspase不敏感的DQVA果蝇其caspase切割位点发生突变，导致生物传感器的敏感性消失，表明该生物传感器的信号依赖于caspase活性。随后，将饥饿处理的、对caspase敏感的生物传感器果蝇重新给予蛋白质食物，持续三天。恢复后的果蝇卵室未表达RFP瞬时caspase报告基因，表明近期无caspase活性发生或持续存在。

重要的是，回收的卵室仅表达GFP，表明它们在caspase激活后逆转了细胞死亡过程。在短暂的诱导细胞死亡的温度应激后，体内也可观察到anastasis现象。在冷休克刺激下，即将死亡的卵室表达RFP和GFP生物传感器标记物，其中RFP信号代表近期或正在进行的caspase活性，而GFP信号则代表既往的caspase活性。

然而，在恢复至正常培养条件以解除胁迫三天后，恢复组果蝇的卵室中仅显示 GFP 半胱天冬酶报告信号，表明这些卵室中的细胞在半胱天冬酶激活后的某个时间点发生了细胞回生（anastasis）。值得注意的是，GFP CaspaseTracker 信号显示，卵室内的多种细胞类型均能够逆转细胞死亡过程，并修复由半胱天冬酶造成的损伤，包括生殖系细胞（如卵母细胞和滋养细胞）以及体性滤泡细胞。有趣的是，GFP 还标记了生殖囊（germarium）中的细胞，其中包含干细胞，以及同一卵巢链中与其相连的卵室。

因此，这些GFP阳性的卵室可能来源于经历了复生（anastasis）的干细胞。以下是显示未暴露于环境胁迫条件下CaspaseTracker生物传感器活性的组织图像。这些组织来自一只解剖后的新生羽化雌蝇（0日龄），包括口器、前肠、嗉囊、中肠、后肠、马尔皮基管、肛门、输卵管和卵巢。

共聚焦显微镜显示了由RFP指示的近期caspase活性以及由GFP指示的既往caspase活性。放大图像显示了在视叶、贲门、马尔皮基小管、后肠以及与F-actin染色共定位的卵室肌壁上发生的近期或持续性及既往caspase活性。某些组织（如输卵管）仅表现出既往caspase活性。

这些生物传感器活性表明在胚胎发育或正常稳态过程中可能存在麻醉活性。也可能提示当前或既往的非凋亡性半胱天冬酶（caspase）活性。详情请参见原文手稿。

体内 CaspaseTracker 生物传感器可特异性报告半胱天冬酶（caspase）活性，而对半胱天冬酶不敏感的 CaspaseTracker（含有不可被半胱天冬酶切割的序列 DQVA）则无生物传感信号。此处唯一的信号来自色素、角质层和脂肪体的自发荧光所产生的非特异性信号。观看本视频后，您应能够基本了解如何利用 CaspaseTracker 生物传感器系统在活体动物中检测并追踪细胞回生（anastasis）过程。

这些生物传感器有助于研究细胞回生（anastasis）的过程及其已知功能。它们的检测范围在生理学、病理学和治疗学领域具有广泛的应用。这些生物传感器不仅能够在半胱天冬酶（caspase）激活后检测到细胞凋亡的逆转，还能检测细胞在尝试其他直接或间接涉及半胱天冬酶活性的细胞死亡形式后是否恢复。

在设计实验时，必须设置相互对照，以区分追踪麻醉细胞的荧光生物传感器信号与正在死亡且具有持续半胱天冬酶（caspase）活性的细胞。还需注意具有已知当前或既往凋亡相关半胱天冬酶活性的健康细胞，以及来自色素、脂肪等的非特异性自发荧光信号，这些因素均至关重要。有关详细讨论，请参见本文手稿的 PDF 版本。