通过的嗅球钙监控录像的变化温度引起的神经元电活动非洲爪蟾
June 3rd, 2016
这里我们描述了一种测量和分析非洲爪蟾嗅球温度反应的协议。嗅觉受体神经元和二尖瓣细胞经过差异染色，然后记录钙变化，反映了灯泡中一些神经网络对鼻子诱导的温度下降的敏感性。
该程序的总体目标是记录嗅球神经元中响应鼻上皮诱导的温度下降的钙变化。这种方法可以帮助回答情感领域的关键问题，例如嗅球如何整合和处理在鼻子中获得的温度信息。嗅球的一级和二级神经元进行差异染色，并通过钙成像测量鼻上皮温度波动的影响。
细胞电穿孔、推注加载和活动相关成像的视觉演示将有助于这些技术在嗅球以外的大脑网络中实施。要开始此过程，请将蝌蚪放在凝胶垫上。通过在周围放置针头来固定它，并注意不要将针头戳穿它的皮肤。
接下来，将动物置于立体显微镜下并聚焦于鼻孔。然后，将染料晶体放入其中一个鼻腔中，等待它完全溶解，这应该需要不到一分钟的时间。如果晶体较小，则在每个腔中加入 2 或 3 个，直到它们产生非半透明、高浓度的溶液。
之后，将阴极放在蝌蚪的皮肤上，将阳极放入其中一个鼻孔中。施加 6 个 20 伏特和 20 毫秒的脉冲，刺激间隔约为 0.5 秒。对于具有不同极性的染料，将阴极放入鼻孔中可以改善染色结果。
如果不确定染料的极性，可以将两个电极同时放置在鼻孔中，并在单个电压脉冲之间交替极性。牺牲动物后，用手术刀解剖出包含鼻腔、嗅神经和嗅球的组织块。在靠近左鼻孔的地方做第一个切口，将刀片向前移动，沿着左嗅神经和球部切割，直到端脑-间脑边界。
在右侧重复同样的步骤。接下来，通过在端脑后方进行最终切割，将制剂与神经系统的其余部分隔离开来。通过在嗅神经之间插入两根针头，再次固定组织阻滞。
然后，在纸巾上滴一滴 Frog Ringer 溶液。将制剂浸泡在林格溶液中可防止脑组织在解剖时塌陷。之后，通过做三个切口去除覆盖轴突分选区和嗅球的脑膜。
从组织块的后缘开始，沿着左嗅球紧密切开尾鼻，直到嗅神经进入球的入口点。对右半球重复此过程。随后，用镊子抬起脑膜，并在轴突分选区垂直于前一个切口进行第三次切割。
之后，将样品转移到装满 Frog Ringer 的记录室中，以进行进一步处理和成像。确保腹侧朝上，并用横跨在小铂框架上的尼龙纤维网固定样品。为了更容易地应用刺激，将鼻腔放在其中一根尼龙纤维的顶部。
在此过程中，用 10 微升溶液填充微量移液器，然后轻弹微量移液器去除气泡。接下来，将微量移液器安装在移液器支架中。确保可以使用注射器或气动药物喷射装置手动施加压力，并用仪表监测施加的压力。
然后，将移液器降低到嗅球表面，尖端指向制剂的喙部方向。对微量移液器施加一个小而恒定的正压，以防止移液器堵塞。轻轻地将微量移液器插入组织中并施加正压。
通过观察施加压力时在强光照明下可见的轻微组织运动来确认移液器的流出。上样 10 分钟后，将施加的压力降至零并检查染色。染色区域的大小差异很大，取决于几个参数，例如注射的染料量和喷射部位的位置。
良好的染色覆盖面积约为 100 微米 x 100 微米。在推注负载期间监测二尖瓣细胞胞体随时间的渐进染料负载。如果染色强度或染色二尖瓣细胞的数量没有增加，请检查移液器是否堵塞，并在必要时更换。
在此步骤中，通过将干净的温度计探头插入管中来监测冷却的 Ringer 的温度。等到温度降至 1 摄氏度以下后再开始实验。接下来，使用漏斗涂抹器，允许刺激物同时输送到灌注 Ringer，以便在刺激溶液释放期间腔室中的水流保持恒定和不间断。
然后，将漏斗放置在远端出口距离嗅上皮不到 1 毫米的位置。然后，将连接到数字温度计的镍铬合金温度传感器放置在靠近上皮和漏斗涂抹器出口的位置。将温度计输出端口连接到计算机，以记录和直观地显示反映微小温度波动的电压变化。
之后，开始图像采集并通过电动移液器以 20 至 30 秒的刺激间隔依次施加 200 至 400 微升冷林格、L-组氨酸和室温林格。为了更好地控制刺激应用，如果可能，请用所选成像设置发送到移液器的触发信号释放刺激。在此过程中，将作为变量获取的原始数据加载到 MATLAB 用户的工作区中，组织为 x、y、z、t 矩阵，其中 x 和 y 表示横向尺寸，z（轴向），t 表示时间过程。
然后，从 MATLAB 命令行调用 ACI。在 UI 中，选择 Prepare Data，然后选择包含数据的变量和保存结果的目录。通过在 UI 中移动相应的滑块来滚动测量的 z 层，以获得所显示方差图的概览。
之后，在 UI 中输入 ROI 的大小。对于二尖瓣细胞体细胞，调整 ROI 以在外侧跨越约 10 微米，在轴向跨越约 5 微米。对于肾小球，外侧 20 微米和轴向 10 微米的稍高值是合适的。然后，通过用鼠标中键单击细胞或肾小球的中心，选择包含周围二尖瓣细胞的每个可见胞体的 γ 肾小球和其他区域的 ROI。
然后，关闭主 UI，这将触发所有参考跟踪的相关图计算。结果将自动保存并显示。该图像显示，终止于小簇中的 ORN 轴突通过非钙敏感染料 Alexa 647 葡聚糖的电穿孔染色。
虚线勾勒出 γ 肾小球。此处显示的是用钙敏感染料 Fluo-8 AM 推注后第二个测量通道中相同区域的图像。一些二尖瓣细胞胞体可见，但对比度有限。绘制两条响应轨迹用于活性相关性成像，轨迹下方的蓝色、红色和黑色条分别描述了冷林格、10 微摩尔组氨酸和室温林格作为阴性对照的应用开始。
此处显示了主要响应冷振铃的突出显示区域中的跟踪的 ACI 结果。这是主要对组氨酸反应的突出显示区域中的痕迹的 ACI 结果。此图显示了两个 ACI 映射的叠加。
对组氨酸和神经支配的肾小球有反应的二尖瓣细胞很容易与 γ 肾小球中的热敏性二尖瓣细胞区分开来。可以执行该程序来检查热敏性和化学敏感性是否位于嗅球的隐蔽和重叠的神经元网络中。观看此视频后，您应该对如何使用活体动物的细胞电穿孔、推注负荷和活动相关性成像（也称为 ACI）来记录嗅球中的温度处理有很好的了解。
推注加载和 ACI 是观察和比较数十个神经元的 3D 活动和连接的强大工具，这使得它们很容易适用于不同的大脑区域和神经元网络。
概述
本文介绍了一种测量非洲爪蛙嗅球温度反应的协议。该方法涉及嗅觉受体神经元和三叉神经节细胞的差异染色，然后通过钙成像来评估神经对温度变化的敏感性。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 嗅觉处理
- 钙成像技术
背景
- 了解嗅球如何处理温度信息对于神经科学至关重要。
- 神经元中的钙变化可以表明神经对刺激的反应。
- 非洲爪蛙是研究嗅觉系统的模型生物。
- 温度波动可能影响嗅球的感觉处理。
研究目的
- 记录温度下降导致的嗅球神经元钙变化。
- 探索嗅球如何整合鼻腔上皮的温度信息。
- 提供一种适用于其他脑网络的方法。
使用的方法
- 嗅觉受体神经元和三叉神经节细胞的差异染色。
- 钙成像监测神经反应。
- 电穿孔技术用于染料加载。
- 实验过程中的温度监测和刺激应用。
主要结果
- 成功可视化了响应温度刺激的钙变化。
- 证明了该协议用于研究其他神经网络的可行性。
- 确定了影响染色和成像质量的参数。
- 建立了实验过程中精确温度控制的方法。
结论
- 该协议有效测量了嗅球中温度诱导的钙变化。
- 研究结果有助于理解嗅觉系统中的感觉处理。
- 这种方法可以适用于其他脑区的研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding temperature-sensitive neural pathways in olfactory processing provides mechanistic insights for sensory neuroscience target validation. This method enables de-risking of thermosensory pathway hypotheses through quantitative calcium imaging in a genetically tractable model. The approach supports early discovery by linking peripheral sensory input to central neural activity patterns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of thermosensory hypothesis in olfactory bulb circuitry.
- Operational Value: Provides differential staining to isolate contralateral afferent pathways to the gamma-glomerulus.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by correlating temperature drops with calcium transients in mitral cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative calcium readouts for thermosensitive versus chemosensitive network comparison.
- Operational Value: Establishes reproducible bolus loading and electroporation for mitral cell and axon terminal labeling.
- Scientific Value: Enables 3D brain volume scanning under line-illumination microscopy for activity correlation imaging.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses disease-relevant Xenopus laevis model to study sensory integration mechanisms.
- Operational Value: Facilitates morphological reconstruction of thermosensitive networks based on temperature-induced calcium traces.
- Scientific Value: Supports predictive confidence by comparing thermosensitive and chemosensory responses in overlapping neuronal populations.
Pipeline & Workflow Integration
This method positions within early discovery workflows where sensory stimulus response profiling informs target hypothesis testing and pathway de-risking prior to assay development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of thermosensory integration in olfactory bulb via calcium imaging readouts.
- Screening: Delivers assay-ready biological system with standardized staining and stimulus delivery via funnel applicator.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (calcium traces) enabling comparison of cold Ringer, L-histidine, and room temperature Ringer responses.
- Translational Research: Connects peripheral temperature stimulation to central neural output in a model with translational relevance to vertebrate sensory processing.
- Enterprise Reuse: Electroporation and bolus loading techniques are adaptable to other brain regions and neuronal networks beyond olfactory bulb.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in thermosensory pathway validation through activity correlation imaging.
- Operational Value: Standardization of dye loading, temperature control, and stimulus application parameters.
- Strategic Value: Reduces mechanistic ambiguity in sensory processing models for better go/no-go decisions.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of thermosensory targets based on reproducible neural activity readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, microscopy, and fluorescent dye handling.
- Dependent on line-illumination microscopy and temperature-controlled perfusion systems.
- Necessitates cross-team standardization for electroporation polarity and bolus loading optimization.
- Adaptation considerations include model system compatibility and dye spectral separation for multiplexed imaging.
- Practical limitations include staining variability based on dye quantity and ejection site location.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:55
Electroporation
2:06
Whole Mount Preparation
4:06
Bolus Loading
5:42
Odor Application and Temperature Experiments
7:08
Image Processing of the Post-synaptic Recordings Using Activity Correlation Imaging
8:50
Results: Bolus Loading and ACI Dissociate Thermosensitive and Chemosensitive Networks
10:16
Conclusion
